CN113999852B - circ_0001772作为结直肠癌诊断和治疗标志物的应用 - Google Patents

circ_0001772作为结直肠癌诊断和治疗标志物的应用 Download PDF

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Abstract

通过公开数据库GEO环状RNA表达谱数据中筛选在结直肠癌中差异表达的，可作为潜在诊断靶标的circRNA；进一步通过检测真实病理血清学样本，确定circRNA_0001772(来源于母基因RBM33)在结直肠癌中低表达；通过低表达circRNA_0001772的结直肠癌细胞系验证了恢复circRNA_0001772可以抑制肿瘤细胞的迁徙，可以作为潜在的治疗结直肠癌的药物。

Description

circ_0001772作为结直肠癌诊断和治疗标志物的应用
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域,尤其涉及circRNA检测和治疗结直肠癌的方法。
背景技术
结直肠癌是国内外常见的恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率位于全球第三位,死亡率高居全球第二位(Global Cancer statistics,2018：GLOBOCAN estimate ofincidence and mortality worldwide for 36cancers in 185countries.Ca A CancerJournal for Clinicians.2018.)。在我国,随着生活水平的提高，饮食结构的改变，结直肠癌的发病率也呈逐年上升趋势，2015年我国约有38万例新发病例，死亡约19万例，在所有恶性肿瘤中的发病率和死亡率中位列第5(Cancer statistics in China,2015.Ca A CancerJournal for Clinicians.2016.)。大约有15％-25％的患者在初次就诊时已经出现了转移，并且最终约有半数患者死于远处转移(Molecular targets and pathways involvedin liver metastasis of colorectal cancer.Clinical&ExperimentalMetastasis.2015)。因此鉴定结直肠癌发生发展中的关键分子，实现早期诊断和干预，对提高患者生存率意义重大。
环状RNA是一类具有闭环结构的内源性非编码RNA，它不含有5’帽子和3’poly(A)尾巴，其发现最早可追溯至上世纪70年代，Sanger等观察到了一种类病毒是单链闭合的环状RNA分子(Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA moleculesexisting as highly base-paired rod-like structures.PNAS.1976.)。Ming-Ta Hsu等在1979年通过电镜首次在真核细胞中观察到了环状RNA的存在(Electron microscopicevidence for the circular form of RNA in the cytoplasm of eukaryoticcells.Nature.1979.)。当时的研究者通常认为环状RNA是转录“垃圾”而将其忽视，直到2012年，Salzman,J等通过高通量测序技术鉴定到了一大批环状RNA的存在，随后Jeck,W.R等报道了超过25000个环状RNA的存在(Circular RNAs are abundant,conserved,andassociated with ALU repeats.RNA.2013.)，同年研究发现环状RNA的分子可以通过microRNA“海绵”机制发挥生物学功能(Circular RNAs are a large class of animalRNAs with regulatory potency.Nature.2013.)，从而重新引起了生物学家的关注，并使环状RNA成为目前研究的热点。
环状RNA还与肿瘤的发生和发展密切相关。许多环状RNA具有类似原癌基因或抑癌基因的作用，通过各种调控方式，影响肿瘤的发生发展。环状RNA最重要的功能之一是作为内源性竞争RNA，吸附miRNA，解除miRNA对其靶基因的抑制效应。如在肝细胞肝癌中，环状RNA circMTO1可以吸附miR-9，解除miR-9对P21的抑制作用，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭(Circular RNAMTO1 acts as the sponge of miR-9to suppress hepatocellularcarcinoma progression.Hapatology.2017.)。在非小细胞肺癌中，环状RNA分子FLI1可以与miR-584-3p结合，上调ROCK1从而促进肿瘤转移(FLI1 Exonic Circular RNAs as aNovel Oncogenic Driver to Promote Tumor Metastasis in Small Cell LungCancer.Clinical cancr research.2018.)。环状RNA还能与RNA结合蛋白结合，从而发挥相关作用。如环状RNA circFOXO3可以与CDK2和P21形成复合物，该复合物可以抑制细胞周期，从而影响肿瘤细胞的增殖(Foxo3 circular RNA retards cell cycleprogression viaforming ternary complexes withp21 and CDK2.Nucleic Acids Res.2016.)。另外，也有少量报道指出环状RNA还能通过翻译产生蛋白质或多肽来调控肿瘤进程。在神经胶质瘤中，环状RNA circFBXW7能翻译出小分子蛋白质FBXW7-185aa，抑制细胞周期，影响肿瘤细胞的增殖(Novel Role of FBXW7Circular RNA in Repressing GliomaTumorigenesis.JNCI.2018.)。此外，已有的研究还发现环状RNA在血清外泌体中富集，并且保持了其结构和功能的完整(Circular RNA is enriched and stable in exosomes:apromising biomarker for cancer diagnosis.Cell research.2015.)。由于环状RNA的稳定性、重要性、丰富性和组织特异性，环状RNA具有巨大的潜能作为疾病的生物标志物及治疗靶点。
有关结直肠癌环状RNA生物学标志物的研究尚不多，但环状RNA作为生物标志物诊断别的癌症已有较多报道。Xiao Zhang等发现环状RNA circ_104075相较目前常用的血清学肿瘤标志物具有更好的特异性与敏感性，其效能曲线曲线下面积高达0.973(circRNA_104075stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4aand may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma.Cell Death&Disease.2018.)。Xin Chen等也在膀胱尿路上皮癌患者的血清及尿液中检测到了环状RNAcircPRMT5的上调。此外，2019年Josh N.Vo等人检测了2000多例肿瘤样本和细胞系，涉及肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等10几种肿瘤，首次绘制了癌症环状RNA全景图，并筛选到了前列腺癌潜在的环状RNA标志物(The Landscape of Circular RNA in Cancer.Cell.2019.)。
发明内容
本发明的第一个方面，提供一种环状RNA circRNA_0001772，其序列为SEQ ID NO:1所示。在一个具体的实施例中，所述的circRNA_0001772，其特征在于，circRNA_0001772备靠背剪切拼接的序列为SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二个方面提供一种检测circRNA_0001772表达的引物组，包括Convergent引物组和/或Divergent引物组，其中Convergent引物组为：
F:5’-ACGACCAATCTGGAGAACAGG-3’(SEQ ID NO:3)；
R:5’-CTCCTCCTCTGGCTCTTCCA-3’(SEQ ID NO:4)；
Divergent引物组为：
F:5’-GGCCACGAAGCTGAGTTGA -3’(SEQ ID NO:5)；
F:5’-TGCCAGATAGCAAATCTTCTCCA-3’(SEQ ID NO:6)。
本发明的第三个方面，提供一种circRNA_0001772在制备诊断癌症试剂中的应用；在一个具体的实施例中，所述的癌症为结直肠癌；在另外一个具体的实施例中，所述的circRNA_0001772的序列如SEQ ID NO:1所示；在另外的一个具体的实施例中，所述的circRNA_0001772背靠背剪切拼接的序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第四个方面提供特异性检测环状RNA circRNA_0001772的试剂在制备诊断结直肠癌中的应用；在一个具体的实施例中，其中所述的特异性检测环状RNA circRNA_0001772的试剂为核酸扩增引物、原位杂交探针；在另外的一个具体实施例中，所述的特异性检测环状RNA circRNA_0001772的试剂包括Convergent引物组和/或Divergent引物组，其中Convergent引物组为：
F:5’-ACGACCAATCTGGAGAACAGG-3’(SEQ ID NO:3)；
R:5’-CTCCTCCTCTGGCTCTTCCA-3’(SEQ ID NO:4)；
Divergent引物组为：
F:5’-GGCCACGAAGCTGAGTTGA-3’(SEQ ID NO:5)；
F:5’-TGCCAGATAGCAAATCTTCTCCA-3’(SEQ ID NO:6)。
本发明的第五个方面，提供环状RNA circRNA_0001772在制备治疗结直肠癌试剂中的应用；在一个具体的实施例中，所述的circRNA_0001772的序列如SEQ ID NO:1所示；在另外一个具体的实施例中，所述的circRNA_0001772背靠背剪切拼接的序列为SEQ ID NO:2所示。
本发明的有益效果，通过公开数据库GEO环状RNA表达谱数据中筛选在结直肠癌中差异表达的，可作为潜在诊断靶标的circRNA；进一步通过检测真实病理血清学样本，确定circRNA_0001772(来源于母基因RBM33)在结直肠癌中低表达；克隆并检测获得了其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，背靠背剪切拼接序列为SEQ ID NO:2；本发明还设计了特异性检测circRNA_0001772的Convergent引物组和/或Divergent引物组用于特异性检测circRNA_0001772表达；通过低表达circRNA_0001772的结直肠癌细胞系验证了恢复circRNA_0001772可以抑制肿瘤细胞的迁徙，可以作为潜在的治疗结直肠癌的药物。
附图说明
图1:GEB circRNA_0001772在结直肠癌与对照样本中的差异表达分析。
图2：circRNA_0001772的表达及剪接位点分析：a:sanger测序验证circRNA_0001772的剪接位点；b:PCR检测，在基因组中Convergent引物和Divergent引物均可以扩增获得片断，而基因组中Divergent无法扩增获得；c：RNAase酶处理后进行扩增，证明环状RNA的稳定性；d-e表明环状和线性的RBM33的相对表达量情况和再细胞质和细胞核的表达分布。
图3：实际病例的血清学样本中circRNA_0001772的表达量情况，结直肠癌病理血清中circRNA_0001772显著低表达，具有统计学差异。
图4：结直肠癌细胞系中circRNA_0001772的表达情况鉴定。
图5：circRNA_0001772对结直肠癌细胞系细胞行为的影响，其中EV表示空载体组，OE为过表达组。
具体实施方法
详细说明
1)circRNA：circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA(ceRNA)机制。此外，研究表明circRNA分子可以与蛋白质结合，参与蛋白质的表达作用。一些研究还表明，circRNA可以参与编码肽链参与生物学作用。circRNA通过与疾病关联的miRNA和(或)蛋白质相互作用，在疾病中发挥着重要的调控作用。
2)敲降：又叫敲减，即knock-down，是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。
3)过表达：是指利用基因表达载体将含有目的基因的表达盒转入进目的细胞，利用细胞自身具有的基因表达的相关工具酶使得载体中表达盒的目的基因表达，且结果是使得获得的细胞表达的目的基因的量高于出发细胞。常见的过表达的载体包括了病毒、质粒等载体，页包括了将目的基因通过基因编辑的方式克隆进细胞的基因组；其中病毒载体包括但不限于腺病毒、腺相关病毒的各个血清型，治疗载体包括但不限于pCDNA系列、pLCDH-ciR系列、pBK系列等。
实施例1.差异表达circRNA
发明人在前期收集了多个GEO数据库的环状RNA表达谱数据中，见表1(其中GSE100206和GSE100063来源于同项研究，故合并)，通过GSE126094分析获得659个差异环状RNA分子(p<0.05，Foldchange>1.20或<0.83),其中上调131个，下调528个。并在GSE121895及GSE116589中确认了其趋势的一致性。随后通过对血清环状RNA表达谱(GSE100206和GSE100063)构建ROC曲线，筛选AUC大于0.9的环状RNA分子，并综合上述所得结直肠癌差异环状RNA分子结果，共筛选获得20个候选环状RNA，上述分析提示这些环状RNA可能作为关键分子参与结直肠癌的发生发展，并有潜力作为结直肠癌诊断预后预测的生物学标志物。选取ROC曲线线下面积为0.964的cicr_0001772作为进一步研究的靶标。
表1.前期收集GEO数据库资料
在NCBI中收集结直肠癌组织与对照组织的全转录组测序样本，下载原始测序SRA文件，转为fastq序列文件。利用hisat2、bowtie2软件参考人类参考基因组hg7进行序列比对。比对结果基于python-sam的find_circ软件分析成环RNA片段，根据环状RNA对应的染色体位置及Alias对分析到的环状RNA进行标注。R语言DEseq包进行环状RNA表达差异分析。通过分析，最终，我们发现环状RNA hsa_circ_0001772在结直肠癌中显著低表达(foldchange＝2.341，p value＝0.0112)(图1A,B)。
实施例2细胞学检测以及序列鉴定
通过设计一对收敛引物和一对发散引物鉴定环状RNA的存在，提取结肠癌细胞系RKO和人肾上皮细胞系293T总RNA，采用随机引物逆转录后用上述收敛及发散引物进行PCR扩增，产物进行琼脂糖电泳，核酸外切酶R处理验证候选环状RNA稳定性，通过实验证实了其碱基序列为反向成环；使用含有gel-red核酸染料的2％琼脂糖凝胶电泳，使用TBE冲液。研究cDNA和gDNA PCR产物。通过在100V电泳50分钟分离DNA。我们发现mRNA经circ_0000173引物扩增相应的特异条带，而在基因组DNA中未发现该条带(图2)。
hsa_circ_0001772的核酸碱基序列为：
TGAACTTGAAGATGATTTACTTGGAGAAGATTTGCTATCTGGCAAAAAGAATCAGTCGGATTTGTCAGATGAAGAGCTAAATGATGATCTTTTGCAGAGTGATAATGAAGATGAAGAAAATTTCAGTTCTCAGGGTGTTACAATTAGTCTGAATGCTACATCTGGCATGGTTACATCATTTGAACTCTCTGACAACACTAACGACCAATCTGGAGAACAGGAATCTGAGTATGAACAAGAACAAGGAGAGGATGAACTGGTTTATCACAAATCTGATGGATCAGAATTGTATACTCAAGAGTACCCAGAAGAAGGACAGTATGAAGGCCACGAAGCTGAGTTGACAGAAGACCAAATAGAATATGTGGAAGAGCCAGAGGAGGAGCAGCTTTACACTGATGAAGTGTTAGACATCGAGATCAATGAACCTTTAGATGAATTTACA(SEQID NO:1)；
其背靠背剪接后的序列为：
ATCTGAGTATGAACAAGAACAAGGAGAGGATGAACTGGTTTATCACAAATCTGATGGATCAGAATTGTATACTCAAGAGTACCCAGAAGAAGGACAGTATGAAGGCCACGAAGCTGAGTTGACAGAAGACCAAATAGAATATGTGGAAGAGCCAGAGGAGGAGCAGCTTTACACTGATGAAGTGTTAGACATCGAGATCAATGAACCTTTAGATGAATTTACATGAACTTGAAGATGATTTACTTGGAGAAGATTTGCTATCTGGCAAAAAGAATCAGTCGGATTTGTCAGATGAAGAGCTAAATGATGATCTTTTGCAGAGTGATAATGAAGATGAAGAAAATTTCAGTTCTCAGGGTGTTACAATTAGTCTGAATGCTACATCTGGCATGGTTACATCATTTGAACTCTCTGACAACACTAACGACCAATCTGGAGAACAGGA(SEQID NO:2)
实施例3组织样本验证
本课题组前期已经收集大量结直肠癌患者术前术后的临床组织样本及血清样本；包括正常对照粘膜55例，结直肠腺癌55例，见表2；正常对照血清55例，结直肠癌患者术前血清55例，结直肠癌患者术后血清55例，见表3。
表2.研究对象直肠粘膜、肠癌组织资料
表3.研究对象正常对照血清、肠癌术前血清、术后血清资料
原发灶组织学形态
获取结直肠癌手术切除组织新鲜样本，检测circ_0001772表达水平，提取组织RNA，使用PrimeScript II逆转录试剂盒(TaKaRa)将总RNA反转录为cDNA。使用SYBR-Master混合物(CWBIO，中国)在Bio-rad CFX96实时荧光定量PCR系统上进行定量RT-PCR(qRT-PCR)反应。将相对基因表达水平相对于β-actin蛋白标准化，并使用2-ΔΔCt方法进行表达量计算和统计分析。circRNA_0001772设计引物如下：
Convergent Primer：
F:5’-ACGACCAATCTGGAGAACAGG-3’(SEQ ID NO:3)；
R:5’-CTCCTCCTCTGGCTCTTCCA-3’(SEQ ID NO:4)。
Divergent Primer：
F:5’-GGCCACGAAGCTGAGTTGA-3’(SEQ ID NO:5)；
F:5’-TGCCAGATAGCAAATCTTCTCCA-3’(SEQ ID NO:6)
结果发现结直肠癌组织显著低于匹配正常组织(图3)。
实施例4、circ_0001772在截止肠癌细胞系的表达
本发明检测了结直肠癌上皮细胞系中circ_0001772的表达水平，结直肠癌细胞系HCT116,SW480,SW620,RKO,HT29,HCT8,DLD1,以及肠上皮正常细胞系NCM460从购自ATCC，按照ATCC推荐的说明进行培养细胞。使用短串联重复序列(STR)表征标记，且检测细胞系不含支原体。
使用PrimeScript II逆转录试剂盒(TaKaRa)将总RNA反转录为cDNA。使用SYBR-Master Mix试剂盒(CWBIO，中国)在Bio-rad CFX96实时荧光定量PCR系统上进行定量RT-PCR(qRT-PCR)反应。将相对基因表达水平相对于β-actin蛋白标准化，并使用2ΔΔCt方法进行表达量计算和统计分析。结果发现，circ_0001772在SW620中高表达，而在SW480中低表达(图4)，基于血清学的检测数据，故后续实验中，我们以SW480细胞为过表达细胞模型，研究circ_0001772在结直肠癌细胞系中的作用。
实施例5circ_0001772对结直肠癌细胞系的影响
1、高表达和低表达的细胞系构建
通过吉凯基因合成了circRNA_0001772序列，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和慢病毒表达载体pLCDH-ciR中。
2、细胞增殖实验
我们通过Edu细胞增殖法检测结直肠癌细胞的增殖水平。使用EdU-594体外试剂盒(碧云天)检测细胞增殖。结直肠癌细胞系完全培养基的条件中加入Edu检测试剂，浓度为20μM。将细胞用4％多聚甲醛固定，试剂盒中Azide594和Hoechst33342显色和染色。
结果发现，在低表达circRNA_0001772的细胞系中，通过外源载体的高表达可抑制结直肠癌细胞增殖(图5A，B)。
5、Transwell迁移和侵袭分析
Transwell实验检测结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。对于入侵检测，悬浮1×105个细胞于250μl的无血清培养基中于24孔Transwell上室内(8um；Corning)。对于迁移试验,悬浮2×105细胞于未经过预处理的24孔板上室中。这两种方法的下室中都加入含10％FBS的新鲜培养基。24h后,被入侵或迁移的细胞用4％的结晶紫染色，每个处理样品设置3个生物学重复且每个重复拍摄3张照片。
结果显示，过表达circRNA_0001772的结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力下降(图5C)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。
序列表
<110> 杭州市富阳区第一人民医院
<120> circ_0001772作为结直肠癌诊断和治疗标志物的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 445
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
tgaacttgaa gatgatttac ttggagaaga tttgctatct ggcaaaaaga atcagtcgga 60
tttgtcagat gaagagctaa atgatgatct tttgcagagt gataatgaag atgaagaaaa 120
tttcagttct cagggtgtta caattagtct gaatgctaca tctggcatgg ttacatcatt 180
tgaactctct gacaacacta acgaccaatc tggagaacag gaatctgagt atgaacaaga 240
acaaggagag gatgaactgg tttatcacaa atctgatgga tcagaattgt atactcaaga 300
gtacccagaa gaaggacagt atgaaggcca cgaagctgag ttgacagaag accaaataga 360
atatgtggaa gagccagagg aggagcagct ttacactgat gaagtgttag acatcgagat 420
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<210> 2
<211> 445
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
atctgagtat gaacaagaac aaggagagga tgaactggtt tatcacaaat ctgatggatc 60
agaattgtat actcaagagt acccagaaga aggacagtat gaaggccacg aagctgagtt 120
gacagaagac caaatagaat atgtggaaga gccagaggag gagcagcttt acactgatga 180
agtgttagac atcgagatca atgaaccttt agatgaattt acatgaactt gaagatgatt 240
tacttggaga agatttgcta tctggcaaaa agaatcagtc ggatttgtca gatgaagagc 300
taaatgatga tcttttgcag agtgataatg aagatgaaga aaatttcagt tctcagggtg 360
ttacaattag tctgaatgct acatctggca tggttacatc atttgaactc tctgacaaca 420
ctaacgacca atctggagaa cagga 445
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgaccaatc tggagaacag g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcctcctct ggctcttcca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggccacgaag ctgagttga 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgccagatag caaatcttct cca 23

Claims (3)

1.特异性检测环状RNA circRNA_0001772的试剂在制备诊断结直肠癌试剂中的应用，其中circRNA_0001772的序列如SEQ ID NO:1所示，circRNA_0001772背靠背剪切拼接的序列为SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的应用，其中所述的特异性检测环状RNA circRNA_0001772的试剂为核酸扩增引物组，所述的引物组包括Convergent引物组和Divergent 引物组，其中Convergent引物组为：
F:5’- ACGACCAATCTGGAGAACAGG -3’;
R:5’- CTCCTCCTCTGGCTCTTCCA -3’；
Divergent 引物组为：
F:5’- GGCCACGAAGCTGAGTTGA -3’;
F: 5’-TGCCAGATAGCAAATCTTCTCCA-3’。
3.环状RNA circRNA_0001772在制备治疗结直肠癌试剂中的应用；其中circRNA_0001772的序列如SEQ ID NO:1所示，circRNA_0001772背靠背剪切拼接的序列为SEQ IDNO:2所示。
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