CN113293210A - Elfn1-as1在结直肠癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用 - Google Patents

Elfn1-as1在结直肠癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，涉及一种长链非编码RNA lncRNA ELFN1‑AS1作为结直肠癌诊断生物标志物及治疗靶点的应用。本发明首次发现ELFN1‑AS1可作为结直肠癌诊断生物标志物和药物治疗靶点。与健康人相比，ELFN1‑AS1在结直肠癌患者的癌组织中显著上调。本发明的结果表明ELFN1‑AS1在结直肠癌细胞中高表达，干扰ELFN1‑AS1可以抑结直肠癌细胞的迁移和侵袭，尤其是对恶性程度较高的低氧状态的结直肠细胞。表明ELFN1‑AS1在结直肠癌，尤其是恶性结直肠癌的发生发展中发挥促癌基因的作用，为临床治疗结直肠癌提供新的靶点。

Description

ELFN1-AS1在结直肠癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，涉及一种长链非编码RNA lncRNA ELFN1-AS1作为结直肠癌诊断生物标志物及治疗靶点的应用。
背景技术
结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。目前结直肠癌的治疗主要采用手术联合术后辅助化疗和靶向治疗，但治疗效果并不理想。因此，识别和开发结肠癌新的治疗靶点具有重要意义。缺氧被认为是大多数实体肿瘤的微环境特征之一。中度缺氧可能是肿瘤细胞遗传不稳定、恶性转化甚至转移的起始因素。低氧环境下对细胞凋亡不敏感的细胞具有更强的侵袭性和对放化疗的耐药性。侵袭转移是结直肠癌死亡的主要原因，但是目前没有明确简易且稳定的检测指标进行指导和预后监测。90%以上的死亡病例都是转移造成的，也是导致结直肠癌预后不良的重要因素。结直肠癌的早期诊断和及时正确的治疗，直接影响结直肠癌患者的预后。因此，探究一种新型高灵敏度和高特异度的结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点，提高结直肠癌的早期诊出率，是近年来关注的热点和难点。
早期结直肠癌通常缺乏明显的临床体征，主要通过钼靶X线、彩色多普勒超声等影像学检查获得早期诊断，但对于早期结直肠癌的诊断特异性和敏感性并不高。基于lncRNA在肝癌中的异常表达及生物学功能，确定新型lncRNA作为结直肠癌诊断生物标志物及治疗靶点并探究lncRNA在结直肠癌中的生物学调节功能，对于结直肠癌的诊断及治疗具有潜在的临床意义。
长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸且编码蛋白的潜力有限的RNA分子。根据在基因组中的相对位置及方向，lncRNA主要被分成以下几种：正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因间lncRNA和基因内lncRNA。研究表明，lncRNA具有特定的空间结构和高度保守的序列原件，广泛存在于细胞的各个层面，其在遗传水平、转录及转录后水平、翻译及翻译后水平等多种层面调控重要的病理生理过程，如在染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA代谢和表观遗传特征的调节。近年研究发现，lncRNA广泛参与各种生物学过程，例如调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭等。文献报道，异常表达的lncRNAs与人类各种疾病尤其是恶性肿瘤（结直肠癌、肝癌、胰腺癌等）的发生发展、转移及耐药等过程密切相关。这些特征显示lncRNA在生物学过程中发挥着重要作用，并逐渐成为临床肿瘤诊断、治疗及预后的全新靶点。
发明内容
本发明针对传统早期结直肠癌诊断和治疗中存在的问题提出ELFN1-AS1在结直肠癌诊断及治疗方面的应用。
为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提供一个结直肠癌潜在诊断生物标志物和治疗靶点，其为ELFN1-AS1，其序列如下：
gggtctggcc agcggccgca caggaagcgt gtaggaagcg tggcgcctca gccacaatcgtaatcacctt taatctcttg ctcaaaataa cccaaagtca agctgaccct cggtctatct tgaggccctcggctgccccc gacttgaaga ttctcccccg ttgcgtctaa gtggctgctc caagttcccg tccccgctggcatctccctg cctcaccatc cgccacattc ctacaccaaa agttgacgcc gcattctgga ctcctctctttcctcccccc acacctggtc caactccagc agcatctaat ccacctgcag aagcatctgg aatcactccactcccaccac gaccgcccaa acccacctcc agcggggacg acgcccaagg taccacctgg tctcctggcacccacaatcc attctccctc cacagccaga gggagcctcg ctaaccacca aggcggtcct gcggccccgcgcagccctga gggcgtccag tcctccacgc gtggaggaga atccggcctc cagacacaat ctccagggcccactggatgg gcctccgctc cttctcactc ccagtcctct ggtgcatgcc cccttcctgg ctgaagaacctgcaccagcc gcccctccgc ctgggaagct ccctcctgtc attcactccg agacgcagca gcgttgccccaagagccctc cctgctctgc accccgaatt cactctcagc ccccacctag tttaaatcct ggcccttctctctccctgat gttctgcttg gttatttact tttaattcat gttggagctc ctcctgccac tgcaagagcaggagctgtgt gtcctggtca ctgctgtggc atcccagggc cggcgcggtg cccagcagcc aggactggacagactcgggc cacgctgcgc acgggctggg atgcgctggc tctgcttcct cttccgttga atgggagtaaagaccactcc tcccagggag cttgtggttt ctcacaaa。
本发明的第二个目的是提供特异性识别ELFN1-AS1的引物对，包括上游引物和下游引物。上游引物的核苷酸序列ELFN1-AS1-F, 5’- GCGCCTCAGCCACAATCGTAATC -3’；下游引物的核苷酸序列ELFN1-AS1-R ，5’- GGGGGCATGCACCAGAGGACT -3’。干扰RNA序列为：ELFN1-AS1 shRNA #1：5’-CCTTTAATCTCTTGCTCAA-3’，ELFN1-AS1 shRNA #2： 5’-CAAAATAACCCAAAGTCAA-3’。
本发明的第三个目的是公开ELFN1-AS1在结直肠癌患者标本及肝癌细胞中的表达情况。
本发明的第四个目的是公开ELFN1-AS1在结直肠癌细胞中发挥的生物学功能。
本发明公开了ELFN1-AS1作为一种新型潜在的结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点。本发明从数据库中提取组织标本库中选取结直肠癌及癌旁组织的数据，差异表达的lncRNA与TCGA分析数据进行联合分析，筛选出在结直肠癌组中显著变化且与预后相关的候选lncRNA分子。在体外细胞实验中通过qRT-PCR验证发现ELFN1-AS1在结直肠癌中表达显著上调，且高表达的ELFN1-AS1与患者的不良预后相关；功能实验结果显示干扰ELFN1-AS1可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1.首次发现ELFN1-AS1在结直肠癌诊断生物标志物和药物治疗靶点。
2.与健康人相比，ELFN1-AS1在结直肠癌患者的癌组织中显著上调。
3.本发明的结果表明ELFN1-AS1在结直肠癌细胞中高表达，干扰ELFN1-AS1可以抑结直肠癌细胞的迁移和侵袭，表明ELFN1-AS1在结直肠癌的发生发展中发挥促癌基因的作用，为临床治疗结直肠癌提供新的靶点。
附图说明
图1A为TCGA数据挖掘分析结果，显示ELFN1-AS1在结直肠癌中的表达差异（p<0.001）。图1C显示ELFN1-AS1在结直肠癌及癌旁组织中差异表达。图1B为TCGA公共数据库中ELFN1-AS1在结直肠癌组织中的与患者预后相关情况。图1D为ELFN1-AS1在四种常见人源结直肠癌细胞系中的表达情况。图1E为ELFN1-AS1在直肠癌细胞中的表达位置。图1F为ELFN1-AS1在低氧的结直肠癌细胞中蛋白水平的表达变化。图1G为ELFN1-AS1在低氧的结直肠癌细胞中RNA水平的表达变化。
图2干扰ELFN1-AS1抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，同时干扰ELFN1-AS1抑制结低氧环境的结直肠癌细胞的侵袭和迁移。
图3干扰ELFN1-AS1促进结直肠癌细胞的凋亡，尤其是干扰ELFN1-AS1促进低氧环境的结直肠癌细胞的凋亡。
图4为TANRIC数据集上分析ELFN1-AS1所调控的mRNA和miRNA。
图5为干扰ELFN1-AS1抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，相关下游基因可以反转此功能。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术上人员通常理解的含义。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1
本实施例提供ELFN1-AS1在结直肠癌中的表达、预后及诊断效能方面的研究情况。
1、实验材料与方法
1.1数据库数据提取
运用网络分析工具，GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/)，使用GEPIA分析ELFN1-AS1的表达和总存活率，包括TCGA和GTEx的转录组数据。在基因表达分析中参数采用，对数尺度采用log2(TPM + 1)， |Log2FC| Cutoff=1, p值Cutoff=0.01。总生存期分析采用Log-rank检验，即Mantel-Cox检验进行假设检验。
1.2相关基因分析
在Diana tools (https://diana.e-ce.uth.gr/ lncbasev3/ interactions)上分析获得ELFN1-AS1的相关mRNA和miRNA。TANRIC使用TCGA和CCLE程序的RNA_seq数据，用Spearman相关系数计算进行相关分析。
1.3 细胞系及培养
4株人结直肠癌细胞系HCT116, SW480, HT29 and LoVo，均购买于中国科学院上海生命科学研究院。结直肠癌细胞均培养在含有10%胎牛血清（Gibco）的DMEM（Gibco）培养基中，并添加100ng/ml的霍乱毒素、20ng/ml EGF、0.5μg/ml的氢化可的松和10μg/ml的胰岛素。所有细胞系都培养在37℃和5%CO2的培养箱中。
1.4 lncRNA 差异基因表达谱
从TCGA数据挖掘组织标本库中选取结直肠癌275例及癌旁正常组织349例。分析肝癌及正常组织数据进行比对（设置差异显著基因的默认阈值为：p≤0.001），得到ELFN1-AS1在结直肠癌中的表达差异。
1.5 RNA提取及荧光实时定量PCR（qRT-PCR）
采用RNA提取试剂盒fast2000（飞捷，上海）提取细胞总RNA。逆转录试剂盒采用PrimeScriptTM RT reagent Kit( TAKARA,大连)；荧光定量PCR试剂盒采用TB Green TMPremix Ex taqTMⅡ( TAKARA,大连)。采用β-actin作为内参；采用2-ΔΔCt法计算RNA相对表达量；引物由济南博尚生物技术有限公司合成；引物序列见表1，qRT-PCR体系见表2。
表1 qRT-PCR使用的引物序列
Figure RE-387168DEST_PATH_IMAGE001
表2 qRT-PCR使用的体系
Figure 1
1.6数据处理与分析
使用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，使用GraphPad Prism 7.0软件做统计图。根据需要采用t检验或Wilcoxon秩和检验比较样本间或组间差异，p<0.05被认为具有统计学差异。
2、实验结果
如图1所示，图1显示 ELFN1-AS1在人结直肠癌中表达上调。其中图1A利用GEPIA在线分析软件上的TCGA数据分析ELFN1-AS1在人结直肠癌中表达上调，差异有统计学意义，我们使用log2(TPM + 1)作为对数尺度。| Log2FC |cutoff= 1。图1C中对结直肠癌组织和结直肠脏正常组织进行比较，发现在结直肠癌组织中ELFN1-AS1水平表达明显升高。图1B显示ELFN1-AS1在结直肠癌中表达显著上调，且其高表达与患者不良预后显著相关（p=0.0085）。
TCGA数据挖掘组织标本库中选取结直肠癌275例及癌旁正常组织349例。分析结直肠癌及正常组织数据进行比对。结果显示，ELFN1-AS1在结直肠癌中表达显著上调，见图1A。表明其对结直肠癌具有较好的诊断价值。图1B 显示了高表达（下面的线）和低表达（上面的线）患者生存率，从图中可以看出，高表达人群生存率明显降低。
本发明检测人结直肠癌细胞系中ELFN1-AS1的表达，显示ELFN1-AS1在4种结直肠癌中高表达，见图1D。
实施例2
本实施例探讨过表达ELFN1-AS1对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响。
1、实验材料与方法
1.1 细胞系及培养
同实施例1
1.2 细胞转染
靶向干扰ELFN1-AS1的特异性干扰序列及阴性对照由吉玛基因（上海）设计合成；利用Lipofectamine 2000（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）将过干扰序列转染入结直肠癌细胞LoVo 和 HT29中；干扰序列见表3。
表3 ELFN1-AS1干扰序列
Figure 2
1.3 细胞迁移实验
将24孔细胞池放入24孔板中，胰酶消化转染的细胞，以5×104个细胞/孔取出相应细胞量，用200μl的无血清培养基重悬，接种于24孔池上室中，下室加入含有20%的胎牛血清的培养基。37℃，5% CO2的环境中培养24h后，弃掉上下室中的液体，擦除上室未迁移的细胞，PBS洗2遍，4%的多聚甲醛固定1h。弃固定液，PBS洗2遍，使用吉姆萨染色液染1h。弃染色液，PBS洗2遍，将小室孔膜割下，中性树胶封于载玻片上。使用蔡司显微镜拍照并计数统计
1.4 细胞侵袭实验
将24孔细胞池放入24孔板中，上室加入60μl基质胶（BD Biosciences），置于细胞培养箱中1h待胶凝固。胰酶消化转染的细胞，以1×105个细胞/孔取出相应细胞量，用200μl的无血清培养基重悬，接种于24孔池上室中，下室加入含有20%的胎牛血清的培养基。37℃，5%CO2的环境中培养24h后，弃掉上下室中的液体，擦除上室未迁移的细胞，PBS洗2遍，4%的多聚甲醛固定1h。弃固定液，PBS洗2遍，使用吉姆萨染色液染1h。弃染色液，PBS洗2遍，将小室孔膜割下，中性树胶封于载玻片上。使用蔡司显微镜观察拍照并计数统计。
1.6 数据处理与分析
数据处理过程同实施例1。
2.实验结果
2.1 本发明检测人结直肠癌细胞系中ELFN1-AS1的表达，显示ELFN1-AS1在4种结直肠癌中均高表达，干扰ELFN1-AS1可以抑制结直肠癌细胞增殖，见图2。
图2 显示干扰ELFN1-AS1抑制结直肠癌细胞活力。(A) 在2种结直肠癌细胞株LoVo和HT29种干扰ELFN1-AS1的干扰效率，转染ELFN1-AS1干扰序列(sh-ELFN1-AS1 #1 和sh-ELFN1-AS1 #2)或NC(对照组)后，用qPCR检测ELFN1-AS1的表达水平。(B)和(C) CCK8法检测细胞活力。450nm处测OD值。结果显示，从CCK8的结果来看，与对照细胞相比，干扰ELFN1-AS1后OD值明显升高(图2B,2C)。这些结果表明干扰ELFN1-AS1可以抑制结直肠癌细胞的活力。
2.2 在实施例2中，本发明在人肝癌细胞HLF中转染过表达质粒后，能显著上调肝癌细胞中LINC00969的表达水平，见图4B。*代表p值<0.05。
2.3 在实施例2中，本发明在人肝癌细胞HLF中转染过表达质粒后，细胞实验结果显示过表达LINC00969能显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力，见图5。
图2 干扰ELFN1-AS1抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭， (D)和 (E)Transwell实验检测HLF细胞的迁移和侵袭。(E)显微镜下5个随机场计数迁移细胞数量。(H)显微镜下进行5个随机场的侵袭细胞计数。
肿瘤转移是结直肠癌患者死亡的主要原因之一。低氧是增强细胞的侵袭和迁移能力的主要原因，也是肿瘤转移的必要条件。因此，我们使用transwell实验检测了低氧条件下结直肠癌细胞的迁移和侵袭。如图2D和2G所示，干扰ELFN1-AS1细胞与对照组相比侵袭转移细胞数量明显减少50%以上，低氧状态的结直肠细胞侵袭转移能力明显增加1倍以上，但干扰ELFN1-AS1对低氧状态的结直肠细胞的转移侵袭数量也明显减少50%以上。此外，干扰ELFN1-AS1后凋亡细胞数量也增加50%以上(图3)，低氧状态的结直肠细胞凋亡明显减少，但干扰ELFN1-AS1低低氧状态的结直肠细胞凋亡数量明显增加1倍以上。这些数据表明干扰ELFN1-AS1可以抑制结直肠癌细胞的增值，转移，侵袭，同时促进结直肠细胞的凋亡，这些调控作用对低氧状态的结直肠癌细胞(具有高转移和高侵袭性的癌细胞)尤为明显。
2.4 使用Co-lncRNA在线工具分析TANRIC数据分析ELFN1-AS1所调控的mRNA和miRNA。如图4所示。结果显示，在TCGA的结直肠样本中，miR-33a-5p, miR-151b, miR-16b-5p, miR-191-5p, miR-877-5p 和 miR-28-5p为与ELFN1-AS1负相关的前6个miRNA,FOXK1, TRIM14, SMC1A, RCC2 and GBP1为与ELFN1-AS1正相关的前5个mRNA。且具有统计学意义。
2.5 肿瘤通路中与ELFN1-AS1相关的标记基因中的miR-191-5p和基因TRIM14与ELFN1-AS1最为显著相关。
在LoVo和HT29细胞中，干扰ELFN1-AS1或过表达miR-191-5p可以抑制TRIM14的表达，见图4C。在ELFN1-AS1敲除细胞中过表达TRIM14可显著增加细胞增殖和侵袭能力。说明ELFN1-AS1通过TRIM14调控肿瘤及低氧肿瘤的增殖，凋亡，迁移及侵袭。
上述结果表明ELFN1-AS1在结直肠癌组织、细胞中高表达且与预后不良相关，体外实验显示干扰ELFN1-AS1抑制结直肠癌细胞的迁移，侵袭能力，表明干扰ELFN1-AS1在结直肠癌中发挥抑癌基因的作用，且与低氧环境的肿瘤有显著相关性。ELFN1-AS1有望成为一种新型结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学第二医院
<120> ELFN1-AS1在结直肠癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggtctggcc agcggccgca caggaagcgt gtaggaagcg tggcgcctca gccacaatcg 60
taatcacctt taatctcttg ctcaaaataa cccaaagtca agctgaccct cggtctatct 120
tgaggccctc ggctgccccc gacttgaaga ttctcccccg ttgcgtctaa gtggctgctc 180
caagttcccg tccccgctgg catctccctg cctcaccatc cgccacattc ctacaccaaa 240
agttgacgcc gcattctgga ctcctctctt tcctcccccc acacctggtc caactccagc 300
agcatctaat ccacctgcag aagcatctgg aatcactcca ctcccaccac gaccgcccaa 360
acccacctcc agcggggacg acgcccaagg taccacctgg tctcctggca cccacaatcc 420
attctccctc cacagccaga gggagcctcg ctaaccacca aggcggtcct gcggccccgc 480
gcagccctga gggcgtccag tcctccacgc gtggaggaga atccggcctc cagacacaat 540
ctccagggcc cactggatgg gcctccgctc cttctcactc ccagtcctct ggtgcatgcc 600
cccttcctgg ctgaagaacc tgcaccagcc gcccctccgc ctgggaagct ccctcctgtc 660
attcactccg agacgcagca gcgttgcccc aagagccctc cctgctctgc accccgaatt 720
cactctcagc ccccacctag tttaaatcct ggcccttctc tctccctgat gttctgcttg 780
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<400> 2
gcgcctcagc cacaatcgta atcgggggca tgcaccagag gactcccgag ccgtgtttcc 60
tgtcccagtt ggtgacgatg c 81
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 未知
<400> 3
cctttaatct cttgctcaac aaaataaccc aaagtcaa 38

Claims (7)

1.长链非编码RNA lncRNA ELFN1-AS1作为结直肠癌诊断生物标志物及治疗靶点的应用，其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。
2.长链非编码RNA lncRNA ELFN1-AS1在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。
3.特异性特异性识别ELFN1-AS1的引物在制备结直肠癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物；序列为
ELFN1-AS1上游引物, 5’-GCGCCTCAGCCACAATCGTAATC-3’,
ELFN1-AS1下游引物 ，5’-GGGGGCATGCACCAGAGGACT-3’；
β-actin上游引物，5’-CCCGAGCCGTGTTTCCT-3’，
β-actin下游引物，5’-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3’。
4.降低ELFN1-AS1表达水平的RNA在制备治疗直肠癌药物中的应用，所述RNA序列为：ELFN1-AS1 shRNA #1：5’-CCTTTAATCTCTTGCTCAA-3’，ELFN1-AS1 shRNA #2： 5’-CAAAATAACCCAAAGTCAA-3’。
5.降低ELFN1-AS1表达水平的RNA在制备抑结直肠癌细胞的迁移和侵袭药物中的应用，所述RNA序列为：ELFN1-AS1 shRNA #1：5’-CCTTTAATCTCTTGCTCAA-3’，ELFN1-AS1 shRNA #2： 5’-CAAAATAACCCAAAGTCAA-3’ 。
6.干扰ELFN1-AS1的物质在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
7.干扰ELFN1-AS1的物质在制备抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭药物中的应用。
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