CN111778338A - 一种环状rna生物标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环状RNA生物标志物的应用，尤其是hsa_circ_0001666在食管癌中的应用。本发明通过构建食管癌患者相关的环状RNA表达谱，发现环状RNA生物标志物hsa_circ_0001666及其表达水平与食管癌的相关性；与癌旁正常组织相比，hsa_circ_0001666在食管癌癌灶中表达水平下调。本发明通过细胞功能学研究，发现过表达hsa_circ_0001666可以抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭表型，表明其在食管癌的发生发展过程中具有重要的调节作用。本发明揭示了hsa_circ_0001666在食管癌辅助诊断和治疗中的作用，为临床上食管癌患者的发现和治疗提供支持。

Description

一种环状RNA生物标志物的应用

技术领域

本发明涉及一种环状RNA生物标志物的应用，尤其是hsa_circ_0001666在食管癌中的应用，属于分子生物技术、预防医学和临床医学技术领域。

背景技术

据申请人了解，食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。据统计，2018年全球新发食管癌病例达57万，死亡约50万。中国是食管癌发病率和死亡率最高的国家之一，2015年我国食管癌新发病例约48万，其中男性32万，女性16万，死亡约37万，其中男性25万，女性12万。食管癌的病理类型主要包括鳞癌和腺癌，我国食管癌患者以鳞癌为主要亚型，占90％以上。食管癌的发生与吸烟、饮酒等不健康行为，长期食用腌制食品、高盐饮食、喜烫食、进食速度快等不良饮食习惯，EBV和HPV等病原体感染等有关。然而家庭聚集现象以及在相同暴露下只有少数人患病的事实表明，个体遗传因素同样重要。虽然近年来手术、放疗、化疗和分子靶向治疗等取得了显著进展，但食管癌患者的预后仍然不佳，发展中国家食管鳞癌患者的5年生存率仅为20％，主要原因是食管癌早期多无明显症状，不易发现，多数患者被诊断时已发展为晚期。因此，寻找一种灵敏、特异、易操作的生物标志物和药物作用靶点，对食管癌早发现、早诊断、早治疗并有效改善预后具有重要意义。

非编码RNA(ncRNA)是一种常见的表观遗传改变，主要在真核生物中表达。丰富且功能重要的ncRNA主要包括转运RNA(tRNA)，核糖体RNA(rRNA)，microRNA(miRNA)，小干扰RNA(siRNA)，长非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)等。随着高通量测序技术和生物信息学的不断进步和应用，诸多研究发现ncRNA与阿尔茨海默病、心血管疾病和各种肿瘤等疾病的发生、发展有关。早期的ncRNA研究主要集中在miRNA和lncRNA，但近年来circRNA的作用日益受到重视。circRNA是通过反向剪切将5’端和3’末端以共价结合方式形成的环形闭合RNA分子，曾经被认为是基因副产物或错误剪切而形成的副产物，但越来越多的证据表明，circRNA在生物体内普遍存在，对生命活动具有重要的表观遗传调控作用。根据剪切来源，circRNA可分为外显子环状RNA(exonic circular RNA，ecircRNA)、内含子环状RNA(circular intron RNA，ciRNA)和外显子-内含子环状RNA(exon-intron circular RNA，EIciRNA)。

circRNA最早于上世纪70年代在RNA病毒中被发现，但一直被误认为是无用的副产品低丰度RNA分子。随着高通量测序和生物信息学的发展，研究发现circRNA其实在人体多种肿瘤组织、细胞中是广泛表达的，有时甚至超过线性RNA表达量的10倍之多，且具有组织、细胞、发育阶段和疾病特异性。与线性RNA的产生模式不同，circRNA的独特的闭合环状结构能保护其免受外切酶的影响，因而是一种潜在的表达稳定的生物标志物。

在机制上，circRNA具有“miRNA海绵”效应或作为竞争性内源性RNA(ceRNA)与miRNA结合而抑制其活性，从而调控miRNA靶标，参与肿瘤的发生发展。哈佛医学院Salmena等提出ceRNA调控假说，即circRNA的生物学功能是通过miRNA应答元件(MRE)完成的。circRNA上存在多个miRNA的互补结合位点，可以类似海绵般地吸附miRNA，减少miRNA对靶基因的负性调控作用。随着生物信息学的发展，circRNA的ceRNA调节作用在乳腺癌、胃癌、肺癌等肿瘤中的生物学作用和分子机制也正逐渐被揭示。因此，circRNA是一种理想的靶标，可以作为肿瘤诊断、预后预测和治疗的生物标志物，给疾病的诊疗提供新的手段。然而，目前对可用于食管癌诊断、预后及治疗的circRNA生物标志物的相关报道并不多见。

经检索发现，申请号CN201811632790.X、申请公布号CN109371137A的发明专利申请，公开了一种检测食管癌患者血清中hsa_circ_0007986作为新型生物标记物的方法，主要包括数字PCR检测如其序列1所示的生物标记物。数字PCR扩增所使用的引物包括如其序列2所示的正向引物和如其序列3所示的反向引物。

申请号CN202010203383.8、申请公布号CN111269985A的发明专利申请，公开了一种食管鳞癌诊断和预后预测的标志物——hsa_circRNA6448-14。hsa_circRNA6448-14在食管鳞癌组织中高表达，在癌旁正常组织中低表达。通过检测组织中hsa_circRNA6448-14的表达水平，可以对食管鳞癌进行诊断和预后预测。

以上技术方案分别涉及了与食管癌相关的不同circRNA生物标志物，但均不同于本发明的研究成果。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术存在的问题，基于发明人课题组的研究成果，提出一种环状RNA生物标志物在食管癌中的应用。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种食管癌的诊断引物对，其特征是，所述诊断引物对由SEQ ID No.2所示的正向引物、以及SEQ ID No.3所示的反向引物组成。

由上述正向引物和反向引物组成的诊断引物对可以用于检测环状RNA生物标志物：hsa_circ_0001666的表达水平，从而为诊断食管癌提供依据。

本发明还提出：

一种食管癌的诊断试剂盒，其特征是，包括前文所述的诊断引物对。

优选地，所述诊断试剂盒还包括：作为阳性对照的环状RNA生物标志物，所述环状RNA生物标志物为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

采用该试剂盒，可通过检测hsa_circ_0001666的表达水平为诊断食管癌提供依据。

本发明还提出：

一种环状RNA生物标志物的检测方法，其特征是，采用由SEQ ID No.2所示的正向引物、以及SEQ ID No.3所示的反向引物组成的检测引物对；所述环状RNA生物标志物为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

优选地，所述检测方法包括以下步骤：

S1、提取目标组织样本的总RNA；

S2、将S1所得总RNA逆转录获得cDNA；

S3、采用所述检测引物对，以实时荧光定量PCR法检测S2所得cDNA中hsa_circ_0001666的表达水平。

本发明还提出：

一种环状RNA生物标志物用于制备抗肿瘤药物或药物组合物的用途，所述环状RNA生物标志物为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

一种环状RNA生物标志物用于制备抗肿瘤辅助治疗药物或药物组合物的用途，所述环状RNA生物标志物为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

上述用途中，所述肿瘤为食管癌；所述药物或药物组合物的具体作用为：抑制食管癌细胞增殖、或抑制食管癌细胞迁移、或抑制食管癌细胞侵袭。

上述用途中，所述药物或药物组合物针对的靶点为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

上述用途中，所述药物或药物组合物包括有效剂量的促进剂，所述促进剂为促进hsa_circ_0001666表达的激动剂，所述促进剂包括寡核苷酸、蛋白、小分子化合物、表达质粒、慢病毒。

本发明通过构建食管癌患者相关的环状RNA表达谱，发现环状RNA生物标志物hsa_circ_0001666及其表达水平与食管癌的相关性；与癌旁正常组织相比，hsa_circ_0001666在食管癌癌灶中表达水平下调；hsa_circ_0001666在基因组上的位置为：chr6：+170626457-170639638，线性亲本基因为FAM120B(NM_032448)，环化序列共2038个碱基。本发明通过细胞功能学研究，发现过表达hsa_circ_0001666可以抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭表型，表明其在食管癌的发生发展过程中具有重要的调节作用。

本发明揭示了hsa_circ_0001666在食管癌辅助诊断和治疗中的作用，为临床上食管癌患者的发现和治疗提供支持。

附图说明

图1为本发明实施例1中hsa_circ_0001666在食管癌临床样本中的表达水平及环状验证图。

图2为本发明实施例1食管癌细胞中过表达hsa_circ_0001666表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭的结果图。

图3为本发明实施例1食管癌细胞KYSE-150中hsa_circ_0001666分布图。

具体实施方式

在本发明的具体实施方式中，采用三阶段设计方案。

第一步：发现阶段，基于Array Human Circular RNA芯片V2检测手段，利用7对组织构建了食管癌组织和癌旁正常组织间的差异circRNAs表达谱，筛选出候选circRNA，即hsa_circ_0001666。

第二步：验证阶段，采用qRT-PCR方法，扩大样本量，对第一步中选出的候选circRNA，即hsa_circ_0001666进行验证，并评价hsa_circ_0001666表达水平与食管癌临床表现间的关系。

第三步：生物学作用，通过细胞水平确定hsa_circ_0001666对食管癌恶性表型的作用。

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例1

一、临床样本收集

本实施例共纳入了58例食管鳞状细胞癌患者，病例纳入排除标准为：1)经知情同意；2)有明确的食管鳞状细胞癌病理组织学诊断依据；3)样本采集前未接受过放化疗等治疗；4)既往无肿瘤病史和食管癌家族史。

二、circRNA表达水平检测

(一)、RNA的提取

在食管癌患者组织中采用Trizol法提取总RNA，要求组织和细胞中浓度不低于50ng/ul，OD值260/280在1.9～2.2之间，基因组DNA应去除干净，RNA无降解和污染。

具体步骤如下：

①取食管癌组织约100mg，剪碎后置于研钵中加入液氮研磨，将磨碎的组织移置1.5ml RNA-free的EP管中，加入1ml TRIzol混匀；

②将加入TRIzol的组织样本悬液置于室温静置5min，使核酸和蛋白质复合物有效解离；

③加入200ul氯仿，充分混匀15s，常温静置5min；

④在4℃条件下，12000rpm/min，离心15min；

⑤吸取上清(约500ul)至1.5ml RNA-free的EP管中；

⑥加入等体积的异丙醇，上下颠倒数次，室温静置10min；

⑥在4℃条件下，12000rpm/min，离心15min；

⑦弃上清，贴壁加入1ml预冷75％乙醇洗涤沉淀；

⑧在4℃条件下，12000rpm/min，离心10min；

⑨弃上清，室温干燥约15min；

⑩加入RNA-free水约20μl，置于冰上溶解20-30min，然后测浓度，备用。细胞中总RNA的提取为加入1ml的TRIzol混匀，后同上述③-⑩。

应注意的是，RNA提取过程的关键在于预防RNA酶污染，因此实验中使用的移液器枪头、EP管、外科剪刀等器械均应无菌无酶，实验人员需佩戴口罩、手套，操作过程中避免交谈等。

(二)、RNA逆转录为cDNA

选择Takara反转录试剂盒RR037A并依照说明书采用两步法将RNA反转录成cDNA。具体的，按照总RNA为500ng的量逆转录为cDNA，反应体系如表1所示。

表1食管癌组织和细胞RNA的逆转录反应体系

注释：*加入组织或细胞总RNA的体积为500ng除以每个样本总RNA的浓度。

逆转录反应液在冰上配制完成后，混合均匀，进行离心处理，使其集中于无酶EP管底部。逆转录反应程序：37℃进行15min，85℃进行5s，待温度降至4℃后予以保温。反应结束后，在得到的10μl cDNA中加入40μl RNA-Free水稀释，保存在-80℃冰箱或直接进行后续qRT-PCR反应。

(三)、qRT-PCR表达水平检测

根据hsa_circ_0001666序列(SEQ ID No.1)，采用Primer5.0设计其反向引物，并在primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)平台验证引物的特异性，以GAPDH为内参，采用实时荧光定量PCR方法，选择Takara定量试剂盒RR820A并应用罗氏LC-480II PCR仪检测hsa_circ_0001666的表达水平，反应体系如表2所示。

表2 qRT-PCR检测hsa_circ_0001666的反应体系

表达水平：ΔCT＝CT目的-CT内参，ΔΔCT＝ΔCT癌组织-ΔCT癌旁组织，采用2-ΔΔCT值表示hsa_circ_0001666的相对表达量。扩增引物由南京锐尔真生物公司合成，引物序列如表3所示：

表3 hsa_circ_0001666和GAPDH引物序列

另：SEQ ID No.1：

atcctttcccggagttcagttatgggtgtgagaggtttgcaaggatttgtgggaagtacctgcccacatatatgtacagtagtaaatttcaaagaactggcagagcaccaccgaagcaagtatcctggatgtacccctaccattgtggttgatgccatgtgttgtctcagatattggtatactccagaatcttggatctgcggtggccagtggcgagaatacttttctgctttgcgagattttgttaaaacttttacggcagctgggatcaagttgatattcttctttgatggcatggtggagcaggataagagagatgaatgggtgaaacgaaggctcaagaacaacagggagatatccaggatttttcattacatcaagtcacacaaggagcagccaggcagaaatatgttcttcatcccctcagggctagctgtgtttacacgatttgctctaaagacactgggccaggaaactttgtgttctttgcaggaagcagattatgaggtagcttcctatggcctccagcataactgtcttgggattctgggggaagacactgattacctaatctatgacacttgtccctacttttcaattagcgagctctgcctagagagcctggacaccgtcatgctctgcagagagaagctctgtgagagtctgggcctctgtgtggccgaccttcctcttctggcctgcctccttggcaacgacataatcccagagggcatgtttgaaagctttaggtacaaatgcttatcgtcctacacctctgtaaaagagaactttgacaaaaaaggtaacatcatattagctgtgtcagaccatatatcgaaagttctttacttgtatcaaggtgagaaaaaattagaagagatattacctctgggaccaaacaaagctcttttttataaaggaatggcatcatatcttttaccaggacaaaaatctccatggtttttccaaaaacccaaaggtgtaataactttggacaaacaagtaatatccacgagttcagacgccgaatccagggaagaagttcccatgtgttcagatgctgaatccaggcaagaagttcccatgtgtacaggccctgaatccaggcgagaagttcccgtgtatacagattctgaacccaggcaagaagttcccatgtgttcagaccctgaacccaggcaagaagttcccacgtgtacaggccctgaatccaggcgagaagttcccatgtgttcagaccctgaacccaggcaagaagttcccatgtgtacaggccctgaagccaggcaagaagttcccatgtatacagactctgaacccaggcaagaagttcccatgtatacagactctgaacccaggcaagaagttcccatgtatacaggctctgaacccaggcaagaagttcccatgtatacaggccctgaatccaggcaagaagttcccatgtatacaggccctgaatccaggcaagaagttttaatacggacagaccctgaatctaggcaagaaattatgtgtacaggccatgaatccaaacaggaagttcccatatgtacagatcctatatccaagcaagaagactccatgtgtacacacgctgaaatcaatcaaaaattacctgtagcaacagattttgaatttaagctagaagctctcatgtgtacaaaccctgaaattaaacaagaagaccccacaaatgtggggcctgaagtaaagcaacaagtaaccatggtttcagacactgaaatcttaaaggttgctagaacacatcacgtccaagcagaaagctacctggtgtacaacatcatgagcagtggagagattgaatgcagcaacaccctagaagatgagcttgaccaggccttacccagccaggccttcatttaccgtcccattcgacagcgggtctactcactcttactggaggactgtcaagatgtcaccagcacctgcctagctgtcaaggagtggtttgtgtatcctgggaacccactgaggcacccggacctcgtcaggccgctgcagatgaccattccag。

三、RNase R酶消化

采用epicentre的RNase R消化酶，按照4U/μg的RNase R酶或等体积的DEPC水处理食管癌细胞系KYSE-150细胞中提取的总RNA后，分别置于37℃水浴15min，随后采用RNeasyMinElute试剂盒纯化。然后用qRT-PCR对产物进行检测，并在2％琼脂糖凝胶电泳上进行观察。

四、hsa_circ_0001666与临床关系

采用独立样本t检验或单因素方差分析比较实施例2食管癌癌灶组织和癌旁组织中hsa_circ_0001666的相对表达水平分布；采用ROC曲线(receiver operatorcharacteristic curve)评价hsa_circ_0001666表达水平对食管癌患者的诊断价值。上述统计学分析采用IBM SPSS Statistics Premium V25.0和MedCalc19.1.3软件完成，并以双侧检验，P<0.05认为有统计学差异。

五、生物学作用

1)过表达质粒构建：采用过表达验证手段确定hsa_circ_0001666对食管癌的生物学作用及分子机制。其中hsa_circ_0001666的过表达质粒和慢病毒包装委托上海吉凯基因完成。

2)CCK-8和克隆形成检测细胞增殖：对于CCK-8检测，收集生长状态良好的hsa_circ_0001666过表达及阴性对照细胞，以每孔3000个细胞的密度接种到96孔板，每个细胞设置4个复孔，连续培养5天。每孔加入10μl的CCK-8试剂，放置培养箱中孵育2h，在选用酶标仪450nm波长处测定吸光度值(OD值)，以绘制细胞增殖曲线。对于克隆形成实验，按上述步骤接种细胞培养，弃去培养基，PBS洗涤3次后，室温干燥，用4％多聚甲醛固定30min，结晶紫染色20-30min，用流动水缓慢洗去多余染液，室温干燥后在显微镜下计数。

3)划痕实验检测细胞迁移：收集生长状态良好的hsa_circ_0001666过表达及阴性对照细胞，分别接种于6孔板并培养至细胞铺满6孔板，用20μl Tip垂直于培养板轻轻划线，PBS洗去脱落细胞，用含1％血清的培养基培养，选取固定的3-5个视野于0h和24h拍照，观察划痕愈合情况。

4)Transwell实验检测细胞侵袭：收集生长状态良好的hsa_circ_0001666过表达及阴性对照细胞，分别接种于上室含有Matrigel基质胶(1:7稀释，加50μl)的小室中进行培养。培养24h后，擦去上小室内细胞，用4％多聚甲醛固定下室细胞20min，结晶紫染色15min，清水冲洗干净，擦净上室，晾干。在倒置显微镜下(200×)观察计数。

六、hsa_circ_0001666的亚细胞定位

通过FISH和核质分离方法双重验证hsa_circ_0001666在细胞中的分布。其中，FISH探针委托广州锐博生物公司设计和合成。

七、结果

1、hsa_circ_0001666在食管癌中的表达水平

本实施例共纳入了58例食管癌患者，其中男性32例(55.17％)，女性26例(44.83％)。在食管癌组织中检测发现，癌灶组织中hsa_circ_0001666的表达水平明显低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(图1的A图)；并且癌灶组织中hsa_circ_0001666的表达水平随着T分期的增加而降低(图1的B图)。

2、hsa_circ_0001666对于食管癌的诊断价值

根据ROC曲线分析结果表明，hsa_circ_0001666曲线下面积为0.688(95％CI：0.595-0.771)，Youden指数为0.414，灵敏度为67.24％，特异度为74.14。表明hsa_circ_0001666对食管癌具有一定的辅助筛检、诊断价值，可用于制备食管癌患者检测试剂盒的辅助组分(图1的C图)。

3、hsa_circ_0001666的环状验证

根据RNase R消化酶处理结果显示，hsa_circ_0001666对RNase R消化酶具有较好的抗性，并且仅在cDNA中检测到hsa_circ_0001666而gDNA中未检测到，表明hsa_circ_0001666来源于反向剪切产生(图1的D图)。

4、过表达hsa_circ_0001666抑制了食管癌细胞的增殖

通过CCK-8和集落形成实验检测了hsa_circ_0001666对细胞增殖能力的影响发现：在食管癌细胞系KYSE-150和TE-1中，CCK-8结果表明，过表达hsa_circ_0001666组细胞的OD值明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(图2的A图)；集落形成实验表明，过表达hsa_circ_0001666组形成的集落数量较阴性对照组细胞显著减少，差异有统计学意义(图2的B图)。

5、过表达hsa_circ_0001666抑制了食管癌细胞的迁移

通过划痕实验检测了hsa_circ_0001666对细胞迁移能力的影响发现：在食管癌细胞系KYSE-150和TE-1中，过表达hsa_circ_0001666组细胞划痕剩余间距明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(图2的C图和2的D图)。

6、过表达hsa_circ_0001666抑制了食管癌细胞的侵袭

通过Transwell实验检测了hsa_circ_0001666对细胞侵袭能力的影响发现：在食管癌细胞系KYSE-150和TE-1中，过表达hsa_circ_0001666组细胞穿过铺有Matrigel胶的小室滤膜的数量较阴性对照组显著减少，差异有统计学意义(图2的E图和2的F图)。

7、hsa_circ_0001666的亚细胞分布

根据KYSE-150细胞中的FISH和核质分离检测发现，hsa_circ_0001666主要定位于细胞质中(图3)，表明其可能通过“miRNA海绵”效应或作为竞争性内源性RNA(ceRNA)与miRNA结合而抑制其活性，从而调控miRNA靶标，参与食管癌的发生发展。

由以上结果可见：

hsa_circ_0001666可为诊断食管癌提供依据，具体可采用：由SEQ ID No.2所示的正向引物、以及SEQ ID No.3所示的反向引物组成的诊断引物对；含有该诊断引物对，以及hsa_circ_0001666的诊断试剂盒。以此来检测hsa_circ_0001666的表达水平。

hsa_circ_0001666可用于制备抗肿瘤药物或药物组合物、制备抗肿瘤辅助治疗药物或药物组合物。其中，肿瘤为食管癌；药物或药物组合物的具体作用为：抑制食管癌细胞增殖、或抑制食管癌细胞迁移、或抑制食管癌细胞侵袭；药物或药物组合物针对的靶点为hsa_circ_0001666。此外，药物或药物组合物可包括有效剂量的促进剂，即促进hsa_circ_0001666表达的激动剂，包括寡核苷酸、蛋白、小分子化合物、表达质粒、慢病毒。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一种环状RNA生物标志物的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2038

<212> DNA/RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atcctttccc ggagttcagt tatgggtgtg agaggtttgc aaggatttgt gggaagtacc 60

tgcccacata tatgtacagt agtaaatttc aaagaactgg cagagcacca ccgaagcaag 120

tatcctggat gtacccctac cattgtggtt gatgccatgt gttgtctcag atattggtat 180

actccagaat cttggatctg cggtggccag tggcgagaat acttttctgc tttgcgagat 240

tttgttaaaa cttttacggc agctgggatc aagttgatat tcttctttga tggcatggtg 300

gagcaggata agagagatga atgggtgaaa cgaaggctca agaacaacag ggagatatcc 360

aggatttttc attacatcaa gtcacacaag gagcagccag gcagaaatat gttcttcatc 420

ccctcagggc tagctgtgtt tacacgattt gctctaaaga cactgggcca ggaaactttg 480

tgttctttgc aggaagcaga ttatgaggta gcttcctatg gcctccagca taactgtctt 540

gggattctgg gggaagacac tgattaccta atctatgaca cttgtcccta cttttcaatt 600

agcgagctct gcctagagag cctggacacc gtcatgctct gcagagagaa gctctgtgag 660

agtctgggcc tctgtgtggc cgaccttcct cttctggcct gcctccttgg caacgacata 720

atcccagagg gcatgtttga aagctttagg tacaaatgct tatcgtccta cacctctgta 780

aaagagaact ttgacaaaaa aggtaacatc atattagctg tgtcagacca tatatcgaaa 840

gttctttact tgtatcaagg tgagaaaaaa ttagaagaga tattacctct gggaccaaac 900

aaagctcttt tttataaagg aatggcatca tatcttttac caggacaaaa atctccatgg 960

tttttccaaa aacccaaagg tgtaataact ttggacaaac aagtaatatc cacgagttca 1020

gacgccgaat ccagggaaga agttcccatg tgttcagatg ctgaatccag gcaagaagtt 1080

cccatgtgta caggccctga atccaggcga gaagttcccg tgtatacaga ttctgaaccc 1140

aggcaagaag ttcccatgtg ttcagaccct gaacccaggc aagaagttcc cacgtgtaca 1200

ggccctgaat ccaggcgaga agttcccatg tgttcagacc ctgaacccag gcaagaagtt 1260

cccatgtgta caggccctga agccaggcaa gaagttccca tgtatacaga ctctgaaccc 1320

aggcaagaag ttcccatgta tacagactct gaacccaggc aagaagttcc catgtataca 1380

ggctctgaac ccaggcaaga agttcccatg tatacaggcc ctgaatccag gcaagaagtt 1440

cccatgtata caggccctga atccaggcaa gaagttttaa tacggacaga ccctgaatct 1500

aggcaagaaa ttatgtgtac aggccatgaa tccaaacagg aagttcccat atgtacagat 1560

cctatatcca agcaagaaga ctccatgtgt acacacgctg aaatcaatca aaaattacct 1620

gtagcaacag attttgaatt taagctagaa gctctcatgt gtacaaaccc tgaaattaaa 1680

caagaagacc ccacaaatgt ggggcctgaa gtaaagcaac aagtaaccat ggtttcagac 1740

actgaaatct taaaggttgc tagaacacat cacgtccaag cagaaagcta cctggtgtac 1800

aacatcatga gcagtggaga gattgaatgc agcaacaccc tagaagatga gcttgaccag 1860

gccttaccca gccaggcctt catttaccgt cccattcgac agcgggtcta ctcactctta 1920

ctggaggact gtcaagatgt caccagcacc tgcctagctg tcaaggagtg gtttgtgtat 1980

cctgggaacc cactgaggca cccggacctc gtcaggccgc tgcagatgac cattccag 2038

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcagatgac cattccagat cc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtgctctg ccagttcttt ga 22

Claims (10)

1.一种食管癌的诊断引物对，其特征是，所述诊断引物对由SEQ ID No.2所示的正向引物、以及SEQ ID No.3所示的反向引物组成。

2.一种食管癌的诊断试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述的诊断引物对。

3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征是，所述诊断试剂盒还包括：作为阳性对照的环状RNA生物标志物，所述环状RNA生物标志物为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

4.一种环状RNA生物标志物的检测方法，其特征是，采用由SEQ ID No.2所示的正向引物、以及SEQ ID No.3所示的反向引物组成的检测引物对；所述环状RNA生物标志物为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是，所述检测方法包括以下步骤：

S1、提取目标组织样本的总RNA；

S2、将S1所得总RNA逆转录获得cDNA；

S3、采用所述检测引物对，以实时荧光定量PCR法检测S2所得cDNA中hsa_circ_0001666的表达水平。

6.一种环状RNA生物标志物用于制备抗肿瘤药物或药物组合物的用途，所述环状RNA生物标志物为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

7.一种环状RNA生物标志物用于制备抗肿瘤辅助治疗药物或药物组合物的用途，所述环状RNA生物标志物为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征是，所述肿瘤为食管癌；所述药物或药物组合物的具体作用为：抑制食管癌细胞增殖、或抑制食管癌细胞迁移、或抑制食管癌细胞侵袭。

9.根据权利要求6或7所述的用途，其特征是，所述药物或药物组合物针对的靶点为序列如SEQ ID No.1所示的hsa_circ_0001666。

10.根据权利要求6或7所述的用途，其特征是，所述药物或药物组合物包括有效剂量的促进剂，所述促进剂为促进hsa_circ_0001666表达的激动剂，所述促进剂包括寡核苷酸、蛋白、小分子化合物、表达质粒、慢病毒。

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