CN114921551B - 人Circ-FIRRE在食管鳞癌中的应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人Circ‑FIRRE在食管鳞癌中的应用及试剂盒。本发明研究发现Circ‑FIRRE在食管鳞癌组织中较癌旁正常组织表达量明显升高，且其高表达与食管鳞癌(ESCC)患者的临床分期、淋巴结转移等密切相关。本发明以Circ‑FIRRE作为食管鳞癌的生物标志物，提出了Circ‑FIRRE在食管鳞癌中的用途，尤其是在制备食管鳞癌诊断产品中的应用。本发明研究表明，较高的Circ‑FIRRE表达量提示所述对象患恶性食管鳞癌的可能性增加，或者提示食管鳞癌预后不佳。

Description

人Circ-FIRRE在食管鳞癌中的应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及人Circ-FIRRE在食管鳞癌中的应用及试剂盒，属于生物医学技术领域。

背景技术

我国是食管癌高发地区，约占全球总发病人数的一半以上。主要有食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)两种类型，食管鳞状细胞癌是中国主要的病理类型，占90％左右，其5年生存率仍然很低，仅有15％-25％。食管癌还具有症状出现较晚、内镜检查费用或不适、生物标志物的不敏感性和非特异性的特点。因此，寻找并鉴定与ESCC相关的新型分子标志物不仅有可能作为ESCC的潜在临床诊断指标，亦可以此为靶点，进一步深入研究ESCC转移的分子机制，有效抑制ESCC进展。2022

环状RNA(CircRNA)是一种新类型的广泛存在且具有组织特异性、较线性RNA更稳定和肿瘤中高表达的内源性非编码RNA。目前已被应用于多种疾病疫苗研发中。机制上，环状RNA可以通过吸附内源性微小RNA，即MicroRNA(miRNA)起到竞争性抑制的作用，也可以与RNA结合蛋白结合发挥功能，并且还可以调控靶基因可变剪切和转录的过程。大量研究证实了CircRNA在多种疾病中发挥重要作用，且与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关，这表明CircRNA有巨大的潜力成为新的疾病诊断标志物和治疗靶点。目前的研究表明，CircRNA在多种人类癌症中表达失调，包括喉鳞状细胞癌，胃癌，肝癌，结直肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌等。CircRNAs已被证明是一种潜在的新型生物标志物，有望应用于多种癌症的早期检测和筛查以及成为ESCC潜在的治疗靶点。

组织芯片(tissue chip)，也称组织微阵列(tissue microarrays)，是生物芯片技术的一个重要分支，是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片上，进行同一指标的原位组织学研究。其最大优势在于，芯片上的组织样本实验条件完全一致，有极好的质量控制。节省时间、节省试剂更是显而易见的。

CircRNA FISH常用来定位CircRNA在细胞中的分布，而将CircRNA FISH(CircRNA荧光原位杂交)，作为检测食管鳞癌分期和预后的方法，却还有诸多需要解决的难题。目前对临床组织RNA的检测方法为提取新鲜组织核酸进行RT-qPCR的验证，主要是通过高通量二代测序，进行线性化分析，然而临床新鲜组织既难获得又难保存。另外如何提高个体和组织样本的操作重复性，以及面对临床工作中大批量的样本检测如何减少时间和人力成本，也是本领域人员要面临的问题。有效地解决这些问题才可以真正提高CircRNA在临床病理诊断工作中由理论向实践转变的可能性。

发明内容

针对现有技术中环状RNA在疾病诊断中的重要作用，本发明提供了人Circ-FIRRE在食管鳞癌中的应用及试剂盒。

本发明的技术方案如下：

人Circ-FIRRE在制备食管鳞癌诊断、预后评估和靶向治疗产品中的应用。

根据本发明优选的，所述应用中Circ-FIRRE为食管鳞癌诊断和预后评估的生物标志物。

根据本发明优选的，所述应用中Circ-FIRRE为食管鳞癌靶向治疗的作用靶点。

根据本发明优选的，所述Circ-FIRRE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述食管鳞癌诊断产品用于食管鳞癌的诊断；所述食管鳞癌预后评估产品用于评估食管鳞癌患者总生存期。

根据本发明优选的，所述食管鳞癌诊断和预后评估产品包括特异性识别Circ-FIRRE的物质。

进一步优选的，所述特异性识别Circ-FIRRE的物质为特异性扩增Circ-FIRRE的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增Circ-FIRRE的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述食管鳞癌靶向治疗产品包括特异性敲低Circ-FIRRE表达的物质。

进一步优选的，所述特异性敲低Circ-FIRRE表达的物质为特异性干扰Circ-FIRRE表达的shRNA。

进一步优选的，所述特异性干扰Circ-FIRRE表达的shRNA的序列如SEQ ID NO.5～8所示。

根据本发明优选的，所述食管鳞癌诊断和预后评估产品的检测样本为组织、血浆或血清。

一种食管鳞癌诊断和预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性识别Circ-FIRRE的引物对和荧光原位杂交探针。

根据本发明优选的，所述荧光原位杂交探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述特异性扩增Circ-FIRRE的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR的检测试剂。

一种食管鳞癌靶向治疗药物，所述药物包括特异性敲低Circ-FIRRE表达的物质。

根据本发明优选的，所述特异性敲低Circ-FIRRE表达的物质为特异性干扰Circ-FIRRE表达的shRNA。

进一步优选的，所述特异性干扰Circ-FIRRE表达的shRNA的序列如SEQ ID NO.5～8所示。

一种Circ-FIRRE荧光原位杂交检测芯片，其特征在于，所述检测芯片为由石蜡包埋组织制成，所述检测芯片中含有可以被序列如SEQ ID NO.4所示探针特异性识别的Circ-FIRRE，可用于对食管癌诊断分期和预后的判断。

一种通过荧光原位杂交方法检测组织芯片中Circ-FIRRE表达水平来判断食管癌鳞癌分期和预后诊断的方法。

本发明有益效果有：

1、本发明研究发现Circ-FIRRE在食管鳞癌组织中较癌旁正常组织表达量明显升高，且其高表达与食管鳞癌(ESCC)患者的临床分期、淋巴结转移等密切相关。本发明以Circ-FIRRE作为食管鳞癌的生物标志物，提出了Circ-FIRRE在食管鳞癌中的用途，尤其是在制备食管鳞癌诊断产品中的应用。本发明研究表明，较高的Circ-FIRRE表达量提示所述对象患恶性食管鳞癌的可能性增加，或者提示食管鳞癌预后不佳。

2、本发明设计了特异性扩增Circ-FIRRE的引物对，可特异性有效检测Circ-FIRRE。

3、本发明设计了Circ-FIRRE的荧光原位杂交探针的核苷酸序列，可以用于FISH特异性识别Circ-FIRRE。同时使用了石蜡包埋组织制成组织芯片，并结合组织芯片技术和应用数字切片扫描仪大大提高了CircRNA FISH作为一种诊断方式的准确率和重复性，提高了CircRNA应用于临床诊断的新的可能性。基于组织芯片，应用数字切片扫描仪结合Circ-FIRRE荧光原位杂交探针检测试剂盒检测食管鳞癌分期和预后是一种经济便捷的创新检测方式

4、本发明设计体外干扰Circ-FIRRE的短发夹RNA(shRNA)，可特异性降低Circ-FIRRE的表达水平，进而降低Circ-FIRRE相关的食管癌迁移和浸润能力。

5、本发明提供了荧光原位杂交探针，采用更易获得的临床石蜡组织和切片，通过CircRNA FISH的方法检测Circ-FIRRE表达，判断食管鳞癌分期及预后，整个检测过程可在石蜡组织和石蜡组织切片中完成，对于时间和样品保存环境具有极高包容性，本发明在传统检测方法外，我们利用CircRNA荧光原位杂交探针检测食管鳞癌分期和预后具有更加便捷和经济并且组织包容性强的优势。

附图说明

图1为特异性扩增Circ-FIRRE的引物对与Circ-FIRRE的相对位置示意图。

图2为DNA水平胶电泳示意图(A)和SANGER测序鉴定图(B)。

图3为24例食管鳞癌组织(Tumor)和33例邻近癌旁正常组织(Normal)Circ-FIRRE表达量统计图。

图4为食管正常上皮细胞和食管鳞癌细胞系中Circ-FIRRE的相对表达量柱状图

图5为组织芯片中114例食管鳞癌组织行FISH染色后其平均荧光强度的统计图(A-C)及其ROC曲线(D)和根据69例食管鳞癌组织的Circ-FIRRE的平均荧光强度中位值分为高低表达组后进行Kaplan–Meier生存分析图(E)

图中：T1为癌症侵犯黏膜固有层；T2为癌侵犯固有肌层；T3为癌症侵犯外膜；T4为癌侵入局部结构；N0为无淋巴结转移；N1为涉及1-2个区域淋巴结转移；N2为涉及3-6个区域淋巴结转移；N3为涉及7个或以上区域淋巴结转移。

图6为过表达Circ-FIRRE在KYSE-410和Eca109两株细胞系肿瘤功能学实验结果。

图中：图A为过表达效率，图B、C是KYSE-410细胞中transwell和划痕愈合实验结果及统计分析，图D、E是Eca109细胞中transwell和划痕愈合实验结果及统计分析。

图7为Circ-FIRRE的shRNA在KYSE-410和KYSE-510两株细胞系肿瘤功能学实验结果。

图中：图A为敲低效率，图B、C是KYSE-410细胞中transwell和划痕愈合实验结果及统计分析，图D、E是KYSE-510细胞中transwell和划痕愈合实验结果及统计分析。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例内容全部经过山东大学第二医院医学伦理委员会审查并批准。

试剂：Circ-FIRRE筛查引物由生工生物工程(上海)股份有限公司青岛项目部合成；Trizol试剂(货号DP424)、lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR202)、Nuclease-FreeWater(货号251D)、荧光原位杂交试剂盒(货号F26501)，荧光定量检测试剂盒(货号FP402)购自TIANGEN；氯仿(货号20100927)购自北京化工；异丙醇(货号120503D)购自西陇化工；乙醇(货号101860)购自北化经销。

人正常食管上皮细胞系HEEC、食管鳞癌细胞系Eca109、KYSE-30、KYSE-150、KYSE-410、KYSE-510细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

本发明人利用GEO数据库(GSE130078)对ESCC及癌旁正常组织(各23例)中circRNA表达谱检测，ESCC与癌旁正常组织相比，发现39个差异表达基因(Log2 Fold change>2，pvalue<0.05)，其中Circ-FIRRE是在ESCC组织中表达升高且差异倍数最明显的circRNA。另外，通过提取24例食管鳞癌组织(Tumor)和33例邻近癌旁正常组织(Normal)中的RNA后经RT-qPCR验证发现Circ-FIRRE在ESCC组织中表达升高，与公共数据库表达水平一致。因此我们预测，Circ-FIRRE中具有潜在的促进ESCC发生发展的功能。Circ-FIRRE起源于FIRRE基因，其成熟环化序列长度为1096nt，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，位于人类X染色体Xq26.2：130883333-130928494(GRCh37/hg19)。

实施例1、基于特异性扩增Circ-FIRRE的引物对进行的鉴定

特异性扩增Circ-FIRRE的引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司青岛项目部合成，所述引物对的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-TGATGAGGGCATGGATCACT-3’(SEQ ID NO.2)，

下游引物R：5’-GCAGAGCAGCTTGAAGAACA-3’(SEQ ID NO.3)；

其中，上述引物对与Circ-FIRRE的相对位置如图1所示。

以Circ-FIRRE为模板，采用上游引物F和下游引物R进行PCR扩增，验证引物对的准确性，实验方法如下：

1)RNA提取

将细胞接种于2cm细胞培养皿中，加入1mL的Trizol试剂室温混匀后静置裂解5～10min。收集于1.5mL的RNase-Free离心管中，加入200μL氯仿试剂，涡旋振荡15～30s，静置2～3min后，在13000rpm、4℃下离心15min。小心移取上清400μL转移至新1.5mL的RNase-Free离心管中并加入400μL异丙醇，室温沉淀10min后，在13000rpm、4℃下离心15min，小心弃掉上清，保留沉淀。预冷的75％乙醇洗涤沉淀，5000rpm离心5min，重复75％乙醇洗涤一遍，弃洗涤液，通风橱晾干10～15min，添加30μLRNase-free水溶解。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。

2)cDNA逆转录

首先，配制DNA去除体系混合物：1μg RNA加入2μL的5×gDNA buffer到0.2mLPCR管中，加入RNase-freeWater补充至10μL，彻底混匀后，简短离心，置于42℃孵育3min，快速放在冰上2min。

采用lncRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA逆转录，反应体系如下：

在42℃孵育15min，95℃孵育3min，4℃保温，得cDNA。

3)PCR获取Circ-FIRRE扩增产物

PCR的反应体系如下：

PCR程序如下：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，30个循环；72℃8min；4℃保温。

4)琼脂糖凝胶电泳及核酸胶回收

配置2％琼脂糖凝胶于TAE缓冲液中，取5μL上述PCR产物样品加入DNA上样缓冲液，120V进行电泳。再将PCR产物样品在紫外切胶仪上进行切割，目的片段长度185bp，之后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGENDP219-02)进行胶回收，所得核酸产物于通风橱晾干10-15min，无酶水溶解。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度，接着进行SANGER测序验证。

琼脂糖凝胶电泳结果如图2A所示，SANGER测序结果如图2B所示，由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3引物对PCR所得核酸片段测序结果与Circ-FIRRE的序列一致。

实施例2、检测Circ-FIRRE基因在食管鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达

本实施例取24例食管鳞癌组织(Tumor)和33例邻近癌旁正常组织(Normal)，由山东大学第二医院病理科提供。

1)RNA提取

将组织从-80℃冰箱中取出并切成黄豆粒大小的组织块，然后每管加入1mL的Trizol试剂室温混匀后静置裂解5～10min。收集于1.5mL的RNase-Free离心管中，加入200μL氯仿试剂，涡旋振荡15～30s，静置2～3min后，在13000rpm、4℃下离心15min。小心移取上清400μL转移至新1.5mL的RNase-Free离心管中并加入400μL异丙醇，室温沉淀10min后，在13000rpm、4℃下离心15min，小心弃掉上清，保留沉淀。预冷的75％乙醇洗涤沉淀，5000rpm离心5min，重复75％乙醇洗涤一遍，弃洗涤液，通风橱晾干10～15min，添加30μLRNase-free水溶解。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。

2)cDNA逆转录

首先，配制DNA去除体系混合物：1μg RNA加入2μL的5×gDNA buffer到0.2mLPCR管中，加入RNase-freeWater补充至10μL，彻底混匀后，简短离心，置于42℃孵育3min，快速放在冰上2min。

采用lncRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA逆转录，反应体系如下：

在42℃孵育15min，95℃孵育3min，4℃保温，得cDNA。

3)qRT-PCR检测Circ-FIRRE基因表达量

采用荧光定量检测试剂盒进行qRT-PCR，检测Circ-FIRRE基因表达量，qRT-PCR的反应体系如下：

离心机1000rpm离心1min；将样品放置入qRT-PCR仪(QuantStudio 3)中运行，qRT-PCR程序如下：95℃3min；95℃15s，55℃30s，72℃30s，40个循环。

检测结果如图3所示，实验结果表明Circ-FIRRE在食管鳞癌组织中相对于癌旁正常组织Circ-FIRRE表达量显著增加。

实施例3、检测Circ-FIRRE基因在食管正常细胞和食管鳞癌细胞系中的表达

本实施例取人正常食管上皮细胞系HEEC、食管鳞癌细胞系Eca109、KYSE-30、KYSE-150、KYSE-410、KYSE-510细胞。

1)RNA提取

将6株细胞分别接种于2cm细胞培养皿中，加入1mL的Trizol试剂室温混匀后静置裂解5～10min。收集于1.5mL的RNase-Free离心管中，加入200μL氯仿试剂，涡旋振荡15～30s，静置2～3min后，在13000rpm、4℃下离心15min。小心移取上清400μL转移至新1.5mL的RNase-Free离心管中并加入400μL异丙醇，室温沉淀10min后，在13000rpm、4℃下离心15min，小心弃掉上清，保留沉淀。预冷的75％乙醇洗涤沉淀，5000rpm离心5min，重复75％乙醇洗涤一遍，弃洗涤液，通风橱晾干10～15min，添加30μLRNase-free水溶解。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。

2)cDNA逆转录

首先，配制DNA去除体系混合物：1μg RNA加入2μL的5×gDNA buffer到0.2mLPCR管中，加入RNase-freeWater补充至10μL，彻底混匀后，简短离心，置于42℃孵育3min，快速放在冰上2min。

采用lncRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA逆转录，反应体系如下：

42℃孵育15min，95℃孵育3min，4℃保温，得cDNA。

3)qRT-PCR检测Circ-FIRRE基因表达量

采用荧光定量检测试剂盒进行qRT-PCR，检测Circ-FIRRE基因表达量，qRT-PCR的反应体系如下：

离心机1000rpm离心1min；将样品放置入qRT-PCR仪(QuantStudio 3)中运行，qRT-PCR程序如下：95℃3min；95℃15s，55℃30s，72℃30s，40个循环。

检测结果如图4所示，实验结果表明由实施例1中SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3引物对Circ-FIRRE进行qRT-PCR后，与正常食管上皮细胞系相比，食管鳞癌细胞系中Circ-FIRRE的表达量显著增加。

实施例4、本实施例取114例食管鳞癌病人的食管鳞癌组织和癌旁正常组织石蜡切块，由山东大学第二医院病理科提供，制成组织芯片。

1)组织芯片Circ-RNA荧光原位杂交探针设计

首先需要利用生物信息学手段对Circ-FIRRE进行二级和3级结构预测，选取未被高级结构遮盖并且集中在juction位点两端的核酸序列。然后分别将Circ-FIRRE接口两端序列±100bp以5bp间隔，每30bp长度作为候选探针，通过blast序列比对软件与ReferenceRNA文库和人基因组文库比对。挑选同源序列重复最低的一个作为备选探针，两端分别加生物素和cy3修饰，将T变为U，作为探针使用。

荧光素标记的单链核酸为荧光原位杂交探针，序列如下：

5'-ACATTTTCTCATTCAGTAATAGGGCTGGAAGTTGAAGGCC-3'(SEQ ID NO.4)，在探针的5'端标记有Cy3荧光报告基团。本荧光原位杂交探针是按照碱基互补配对原则与待检测基因Circ-FIRRE进行特异性结合，从而进行定性和定量分析。

2)组织芯片Circ-FISH荧光原位杂交方法，具体方法如下：

①脱蜡复水：将食管鳞癌组织和癌旁正常组织的石蜡切片在60℃烤箱中预热30min，将切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中放置10min，在梯度酒精(100％、95％、90％、80％、70％)中室温孵育各2min，PBS洗切片两次，每次5min。

②蛋白酶处理：将蛋白酶K稀释预热至37℃，每张切片滴加100μL蛋白酶K稀释溶液，37℃孵育20min；每张切片滴加100μL的2×Buffer C溶液，在室温下洗切片3次，每次1min；梯度酒精(70％、80％、90％、100％)脱水，每次2分钟，空气中干燥。

③变性：在78℃下预热变性液，每张切片滴加100μL预热变性液，78℃孵育8min；梯度酒精(70％、80％、90％、100％)脱水，每次2min，空气中干燥。

④杂交：稀释荧光原位杂交探针，配制探针混合液，预热变性5min，准备湿盒，在切片上滴加100μL探针混合液，在湿盒中37℃孵育12～16小时。

⑤清洗：在43℃预热杂交后水洗，吸弃杂交溶液，每张切片滴加100μL的2*Buffer(预热至37℃)清洗两次，每次10min，再用PBS缓冲液清洗一次，时间为10min。

⑥细胞核染色：每张切片加100μL稀释后的DAPI工作液，在室温下避光孵育20min，吸弃DAPI工作液，PBS缓冲液清洗切片两次，每次2min，滴加抗猝灭剂，盖上盖玻片，用数字切片扫描仪拍照结果如图5所示。

图5中A-C结果表明食管鳞癌组织相对于癌旁正常组织Circ-FIRRE表达量显著增加并随TNM分期由早到晚表达量升高。

图5D中Normal-Cancer ROC曲线AUC为0.8901，特异性为80.7％，敏感性84.21％；淋巴结转移ROC曲线AUC为0.7983，特异性为62.75％，敏感性80.95％；Ⅰ+Ⅱ-Ⅲ+ⅣROC曲线AUC为0.8697，特异性为72.34％，敏感性82.61％；T1+T2-T3+T4 ROC曲线AUC为0.6616，特异性为52％，敏感性70.79％；Survive-Dead ROC曲线AUC为0.7804，特异性为72.09％，敏感性69.23％；曲线结果表明在对食管鳞癌患者血浆中Circ-FIRRE具有较好的诊断价值。图5E结果表明，低表达Circ-FIRRE患者的生存率在40个月降低至70％，而高表达Circ-FIRRE患者的生存率在在40个月从降低至25％，因此Circ-FIRRE可以用于判断食管鳞癌的预后情况。所述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为根据第八版国际抗癌联盟(UICC)食管癌癌TNM分期划分的食管癌临床分期。

实施例5、Circ-FIRRE基因过表达在体外中促进细胞迁移浸润

本实施例取人食管鳞癌细胞系KYSE-410和Eca109细胞进行细胞划痕实验和transwell实验。

细胞划痕实验：

1)在六孔板中接种KYSE-410和Eca109每孔各2×10⁵个细胞，每孔总体积为2mL，48h后细胞可以铺满；

2)用枪头在培养孔底划横线，吸去培养上清，用PBS洗2-3次，去除划下的细胞，每孔加入2mL无血清或低血清培养基；

3)放入培养箱中培养，按0h、6h、12h取样拍照,观察细胞迁移性的变化。

本实验的结果如图6B、C所示。

transwell侵袭实验：

1)基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8稀释(可以直接用无血清的培养基稀释)，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃孵箱1～4h使Matrigel聚合成凝胶；

2)制作细胞悬液:细胞饥饿12～24h，然后消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍，用无血清培养基重悬；

3)接种细胞：向Transwell小室中加入200μL细胞悬液，调整细胞个数为5×10⁴，下室加入600μL含15％FBS的培养基常规培养24h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。

4)固定染色：取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS缓冲液洗2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，甲醇或者甲醛固定30分钟，将小室适当风干，用0.1％结晶紫染色30～60min，用PBS缓冲液洗3遍。用棉签轻轻擦掉上室水分，后拍照。结果如图6D、E所示。

本实施例中Circ-FIRRE在KYSE-410和Eca109两株细胞系中的过表达效率如图6A所示。

由图6A-E可知，Circ-FIRRE过表达后的细胞恶性程度显著增加，可以根据Circ-FIRRE的表达水平判断食管鳞癌的预后情况。

实施例6

在食管癌细胞系中转染靶向Circ-FIRRE反向剪接位点的特异性短发夹RNA(shRNA)并验证靶向Circ-FIRRE反向剪接位点的特异性短发夹RNA(shRNA)由生工生物工程(上海)股份有限公司青岛项目部合成，空载体(pLent-U6-Pure，vector)由生工生物工程(上海)股份有限公司青岛项目部提供；其序列如下：

使用LipofectamineTM3000 Reagent试剂盒转染质粒，然后进行Transwell实验，具体实施过程如下：

1)使用LipofectamineTM3000 Reagent试剂盒将Sh-circ0001944-1、Sh-circ0001944-2和空载体pLent-U6-Pure分别转染至KYSE-410细胞、KYSE-510细胞中，使用RNA-Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)提取细胞总RNA，使用lnRcute lncRNAcDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)去除基因组DNA，并进行逆转录合成cDNA，使用Power SYBR^TM Green PCR预混液(Thermo Fisher Scientific，4367659)以及如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示的引物进行荧光定量PCR，Sh-circ0001944-1、Sh-circ0001944-2和空载体pLent-U6-Pure均转染成功；

2)将转染后的KYSE-410细胞放入24孔板中，胰酶消化细胞，含有10％胎牛血清的培养基终止消化，并进行细胞计数，以50000个细胞/孔，取出相应细胞数，800rpm室温离心5分钟，弃上清，用无血清培养基重悬。接种50000个细胞/200μL于24孔细胞池中。下室加入含有20％胎牛血清的培养基。37℃，5％CO₂的环境中培养24h后，弃上清及下室培养基，用棉签擦去上室中未发生迁移细胞，PBS洗两次，4％多聚甲醛固定1h。固定后，弃固定液，PBS洗两次，使用Giemsa染液染小室24h。PBS洗两次，将小室孔膜割下，中性树胶固定。采用CZI显微镜拍照。对细胞进行计数，结果如图7B和C所示；

3)将转染后的KYSE-510细胞放入24孔板中，上室加入60μL的matrigel，置于37℃、5％CO₂的环境中12h，待胶凝固为胶冻状后。胰酶消化细胞，含有10％胎牛血清的培养基终止消化，并进行细胞计数，以100000个细胞/孔，取出相应细胞数，800rpm室温离心5分钟，弃上清，用无血清培养基重悬。接种100000个细胞/200μL于24孔细胞池中。下室加入含有20％胎牛血清的培养基。37℃，5％CO₂的环境中培养48h后，弃上清及下室培养基，用棉签擦去上室中未发生侵袭细胞，PBS洗两次，4％多聚甲醛固定1h。固定后，弃固定液，PBS洗两次，使用Giemsa染液染小室24h。PBS洗两次，将小室孔膜割下，中性树胶固定。采用CZI显微镜拍照，对细胞进行计数，结果如图7D和E所示。

本实施例中Circ-FIRRE的shRNA在KYSE-410和KYSE-510两株细胞系中的敲低效率如图7A所示。

由图7A-E可知，食管癌细胞系KYSE-410与KYSE-510在转染sh-circFIRRE#1与sh-circFIRRE#2后，能显著抑制食管癌细胞系KYSE-410与KYSE-510的迁移侵袭能力。即Circ-FIRRE在食管癌组织中表达上调，同时体外实验显示Circ-FIRRE具有促进食管癌细胞迁移及侵袭的能力，表明Circ-FIRRE在食管癌中发挥促癌基因的作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 人Circ-FIRRE在食管鳞癌中的应用及试剂盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1096

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

agactaaggt gtcagtatgt tcttcaagct gctctgctcc tgggcccaag ctattctcct 60

gcctcagcct tccaagaagc tgaaactaca agaacacaag actgtacctg gcttgcaaac 120

accattgcta ataagaagat attgtaagac tgatacctaa gagataagag agtctcactc 180

attctgtcgc ccaggctgga gtgcagtggc gtgatctcag ctcactgcaa cctccacctc 240

ccggattcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcctgagtag ctgggactac aggccctccc 300

tccgttgccc aggtgggagt gcagtggtgt gatgtcagtt cactgcaacc ttggcctccc 360

ggattcaagc gattctcctg ccttaacctt ccgaacatgg atccctgagg tcggtcccca 420

atacgacaag acaatttgat atcataatag aacactgcag aaacaatgct gagtgaagaa 480

gagtagaaat gggaagactt ggttgagcgg aaactgagtt cttgaaaaga ggagatgctt 540

gatgagggca tggatccctg aggtctgccc cagtactata agacaatttg atgtaagaaa 600

acacagcaga tataatactg agtgaagaag agtataaatg agaagattgg ttgtgcagat 660

actgagttca tgaaaagagg agatgattga tgaggccagg tgcggtgact catgcctgta 720

atccctgcac tttgggaggc tgcggcgggc ggatcacctg aggtcaggag ttcgagacca 780

gcctgggaga cagagcatgg aaacctaagg tctgtaccca aaactacagg actatttgac 840

atcataataa aacactgcag atatgatgct gagtaagagt agaaatggga agacttggtt 900

gtgcagtaac tgagttcttg aaaagaggag atgcttgatg agggcatgga tcactaaggt 960

ctgttcccaa tacaagaaga ctctttgaca tcataataaa atactgcaga tacgatgctg 1020

agtgaaaaag agtagaaatg ggaagacttg gttgtgcaga aactgagttc ttaaagagag 1080

gagatacttt atgagg 1096

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgatgagggc atggatcact 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcagagcagc ttgaagaaca 20

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acattttctc attcagtaat agggctggaa gttgaaggcc 40

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctatgaggag actaaggtgt catcaagagt gacaccttag tctcctcata ttttt 55

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaaatatga ggagactaag gtgtcagtct tgatgacacc ttagtctcct catag 55

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatactttat gaggagacta atcaagagtt agtctcctca taaagtatct tttt 54

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaaaagatac tttatgagga gactaagtct tgattagtct cctcataaag tatc 54

Claims (4)

1.人Circ-FIRRE在制备食管鳞癌诊断、预后评估和靶向治疗产品中的应用，所述Circ-FIRRE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中Circ-FIRRE为食管鳞癌诊断和预后评估的生物标志物；所述应用中Circ-FIRRE为食管鳞癌靶向治疗的作用靶点。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌诊断和预后评估产品包括特异性识别Circ-FIRRE的物质；

所述特异性识别Circ-FIRRE的物质为特异性扩增Circ-FIRRE的引物对或特异性检测Circ-FIRRE的探针；

所述特异性扩增Circ-FIRRE的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物；所述特异性检测Circ-FIRRE的探针序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌靶向治疗产品包括特异性敲低Circ-FIRRE表达的物质；

所述特异性敲低Circ-FIRRE表达的物质为特异性干扰Circ-FIRRE表达的shRNA；

所述特异性干扰Circ-FIRRE表达的shRNA的序列如SEQ ID NO.5~8所示。

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