CN108929873B - 一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种序列中的至少一种：A、如SEQ ID No.1所示的DNA序列；B、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合转移性胃癌细胞的DNA序列；C、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列。本发明还公开了一种核酸适配体衍生物。本发明还公开了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物的应用。

Description

一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体及其应用。
背景技术
转移和侵袭是恶性肿瘤最重要的标志，是癌症病人死亡的主要因素。在胃癌病例中约有50％的新确诊患者是转移性病变，通常会导致不良预后。肿瘤细胞膜分子与许多恶性肿瘤的浸润转移密切相关。肿瘤细胞膜分子靶点的鉴定需要有效的分子探针，这些探针需要具有很好的亲和力和特异性。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，也称为化学抗体，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合。与传统的抗体相比，核酸适配体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针，可以特异结合到目标细胞或者蛋白表面。
正如我们所知，预后不佳的转移性癌症无法治愈，是导致大多数癌症病人死亡的原因。基于SELEX的方法，核酸适配体在癌细胞靶向治疗研究中有很大突破，包括肝癌、结肠癌、结直肠癌、前列腺癌等，但是目前，还没有能够区分转移性胃癌细胞和非转移性胃癌细胞的核酸适配体。因此，能区分转移性胃癌细胞和非转移性胃癌细胞的核酸适配体具有非常重要的价值。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体及其应用，本发明能特异性结合转移性胃癌细胞。
本发明提出的一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种序列中的至少一种：
A、如SEQ ID No.1所示的DNA序列；
B、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合转移性胃癌细胞的DNA序列；
C、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；
D、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列。
优选地，上述与SEQ ID No.1所示DNA序列具有同源性，且能够特异性结合转移性胃癌细胞的DNA序列，其同源性可以为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
发明人通过指数富集细胞系统进化(Cell-SELEX)方法，对转移性胃癌细胞进行核酸适配体筛选，筛选过程中使用淋巴结转移的胃癌细胞系HGC-27细胞作为靶标细胞，使用高分化胃腺癌AGS细胞作为反筛细胞，筛选得到特异性识别转移性胃癌细胞的核酸适配体，简称其为核酸适配体LW-25，其序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。
优选地，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶。
本发明还提出了一种核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸适配体改造成的肽核酸。
硫代磷酸酯修饰是最简单和广泛使用的可应用于增加核酸酶抗性的化学修饰，未经修饰的核酸适配体可以显示活性，但他们会被核酸酶迅速降解，因此作用有限。在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯键用硫原子取代了非桥键氧原子，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解从而更稳定。
肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构，有很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞。
上述硫代磷酸酯骨架序列和肽核酸可用核酸适配体按照本领域常规方法制得。
本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在组织成像中的应用。
本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在捕获转移性胃癌细胞中的应用。
本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备检测转移性胃癌的试剂盒或分子探针中的应用。
本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备治疗转移性胃癌的药物或制剂中的应用。
发明人使用CELL-SELEX方法，通过十一轮的筛选获得了一个特定的核酸适配体LW-25，它可以特异性结合到HGC-27细胞上，且亲和力很高；并且LW-25对其他癌细胞几乎没有结合或者结合很少，其他癌细胞包括非转移性胃癌、乳腺癌、结肠腺癌、肺癌、肝癌和人类胚胎肾细胞，由此可见核酸适配LW-25的特异性也很高；组织成像结果显示LW-25对区域淋巴结转移的胃癌组织高度特异，显示阳性率为78.2％；基于核酸适配体LW-25对转移性胃癌细胞的亲和力和特异性，可以将核酸适配体LW-25应用于组织成像和捕获转移性胃癌细胞，可以用核酸适配体LW-25制备试剂盒或分子探针用于识别、检测转移性胃癌，可以用核酸适配体LW-25制备药物或制剂用于识别、治疗转移性胃癌。
附图说明
图1为指数富集细胞系统进化方法筛选流程图。
图2为每轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标细胞、反筛细胞结合力的检测结果，其中a为与靶标细胞结合力的结果，b为与反筛细胞结合力的结果。
图3为核酸适配体LW-25和转移性胃癌细胞HGC-27的结合能力及结合位置检测结果。
图4为核酸适配体LW-25和转移性胃癌细胞HGC-27的结合特异性检测结果。
图5为核酸适配体LW-25与转移性胃癌细胞HGC-27的解离常数曲线。
图6为核酸适配体LW-25与不同胃癌组织染色结果，其中，A1-A4为区域淋巴结转移的胃癌组织，B1-B4为无区域淋巴结转移的胃癌组织，C1-C4为正常胃组织，D1-D4为区域淋巴结转移的胃癌组织与随机DNA的染色结果。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体的筛选
1.合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
随机单链DNA文库：
5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-40N-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’，
其中，“40N”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列，该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
5’端引物：5’-FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGC，
3’端引物：5’-(20A)-Spacer 18-TTCACGGTAGCACGCATAGG，
其中，“20A”表示由20个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂，三种“Spacer 18”的结构式如下式I-III所示，在上述3’端引物中所用的“Spacer 18”结构式如式I所示，
Figure BDA0001724884260000051
上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
将随机单链DNA文库、5’端引物、3’端引物分别用PBS缓冲液(NaCl：8g/L，KCl：0.2g/L，Na2HPO4：1.15g/L，KH2PH4：0.2g/L，CaCl2：0.1g/L，MgCl2·6H2O：0.1g/L；PH7.4)配制成浓度均为100μM的贮存液，于-20℃保存备用；
2.正筛
2.1.细胞预处理：用RPMI-1640培养基加10％胎牛血清分别培养人胃癌细胞系HGC-27和AGS(从中科院细胞库获得；上海，中国)至直径6cm的平皿铺满约85％，去除培养基后用PBS清洗2次，每次用5mlPBS清洗得到预处理后的HGC-27细胞和预处理后的AGS细胞；
2.2.孵育和清洗：用130μl PBS稀释溶解1OD上述步骤1中的随机单链DNA文库至浓度为1μM，分装到PCR管进行变复性处理。PCR仪设定95℃孵育10分钟使折叠的链解开，然后将PCR管取出，冰浴5分钟，再室温平衡5分钟得到处理后的随机单链DNA文库；将处理后的随机单链DNA文库合并到一管，并向其中加入BSA和tRNA，BSA的终浓度为1mg/ml，tRNA终浓度为0.1mg/ml，混合均匀后加入到2.1得到的预处理后的HGC-27细胞平皿中于4℃孵育1小时，然后去除上清，用洗涤缓冲液(洗涤缓冲液配方为：添加了4.5g/L葡萄糖和5mM MgCl2的PBS，pH7.4)清洗细胞4次，每次用400μl洗涤缓冲液清洗；
2.3.分离：向2.2得到的细胞中加200μl水，沸水浴处理10分钟后，14000rpm离心3分钟后收集上清，上清中得到的文库用于扩增；
3.PCR扩增文库：以2.3获得的文库为模板进行扩增，将2.3获得的200μl文库加入2mlPCR mix中混匀，分装到PCR管中扩增，100μl/管，扩增程序为：98℃预变性2分钟，98℃10s，68℃20s，72℃20s扩增15-25个循环。PCR mix的组成比例如下：正向引物和反向引物各500nM，dNTP 200μM，
Figure BDA0001724884260000061
High-Fidelity DNA聚合酶0.02Unit/μl，1×聚合酶bμffer，用水补足体积到2ml；其中，所用的引物如下：
正向引物：5’-FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGC，
反向引物：5’-(20A)-Spacer 18-TTCACGGTAGCACGCATAGG，
上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
4.制备FAM标记的单链DNA：上述步骤3的扩增产物用正丁醇纯化，方法为加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；然后室温9000rpm离心2分钟，去除正丁醇得到纯化后扩增产物；将纯化后扩增产物按体积比1：1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸变性15分钟使纯化后扩增产物变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行PAGE胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带有PolyA的单链DNA与FAM标记的单链DNA分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如下：
尿素 3.78g
40％聚丙烯酰胺 1.8ml
5*TBE 1.8ml
ddH<sub>2</sub>O 2.25ml
10％APS 60μl
TEMED 15μl
切胶回收FAM标记的单链DNA：将凝胶取出放在塑料膜上，在Ex(nm)：495，Em(nm)：517条件下检测FAM标记的单链DNA；用干净的刀片将目的条带直接切下(切胶时注意带有polyA的单链DNA在目的条带上方，避免切到带有polyA的单链DNA)，将胶条转移至1.5mlEP管中并捣碎，加入1ml ddH2O后沸水浴10分钟，离心去除胶的碎片，留上清液，上清液用正丁醇纯化，方法为加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；用台式离心机，室温9000rpm离心2分钟；移弃上相(正丁醇)，得到FAM标记的单链DNA，用3KD的透析袋透析过夜，作为下一轮筛选的起始文库；5.反筛：用人胃癌细胞系AGS进行反筛选，反筛选的具体操作为：AGS细胞培养条件和孵育步骤同步骤2.1和2.2，孵育结束后收集上清用于正筛，弃细胞；从第3轮筛选之后每一轮在进行以人胃癌细胞系HGC-27为靶标细胞的正筛之前用AGS细胞进行反筛，反筛后收集上清用于正筛；
6.多轮筛选：将上述步骤4中得到的FAM标记的单链DNA作为起始文库替代步骤2.2中的随机核酸文库，重复筛选11轮，每轮操作均以前一轮操作中得到的FAM标记的单链DNA为起始文库，筛选过程中用流式细胞仪监测每轮得到的FAM标记的单链DNA对细胞系HGC-27识别能力的变化；
7.流式细胞仪检测每轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标细胞的结合力：分别将处于对数生长期的HGC-27细胞、AGS细胞用PBS清洗2遍，然后用无酶消化液(APPLYGEN，北京)消化后打散，2000rpm离心后去上清，用2ml PBS离心洗涤2次后分别与200nM的每一轮筛选得到的FAM标记的单链DNA在4℃孵育1小时，孵育完成后去除上清，将细胞用洗涤缓冲液清洗3遍，用200μl洗涤缓冲液重悬，流式细胞仪检测；当FAM标记的单链DNA对细胞系HGC-27的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，得到若干条单链DNA的序列；
8.挑选上述步骤7中得到的若干条单链DNA的序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成核酸适配体，然后检测各核酸适配体的亲和力，在后续检测(实施例2-6)中，确定SEQ ID No.1所示的核酸适配体具有理想的结合细胞系HGC-27的亲和力，与反筛细胞不结合或者结合很弱，最终得到特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体即核酸适配体LW-25。
步骤7中每轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标细胞、反筛细胞结合力的检测结果如图2所示，图2为每轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标细胞、反筛细胞结合力的检测结果，其中a为与靶标细胞结合力的结果，b为与反筛细胞结合力的结果；由图2的结果证明：随着筛选的进行，得到的单链DNA与靶标细胞HGC-27的结合能力不断提高，与反筛细胞AGS的结合能力很弱或不结合。
上述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链DNA的量、靶标细胞的用量和两者的孵育时间，增加清洗时间，清洗次数以及加大反筛细胞的用量。
实施例2
流式细胞仪检测核酸适配体LW-25和转移性胃癌细胞HGC-27的结合能力及结合位置：
1.将处于对数生长期的HGC-27细胞用PBS清洗2遍，然后用无酶消化液(APPLYGEN，北京)消化5分钟后打散，2000rpm离心后去上清，用2ml PBS离心洗涤2次后分别与400nM的标记了FAM的核酸适配体LW-25和随机单链DNA文库在4℃孵育1小时；
2.同时取处于对数生长期的HGC-27细胞用PBS清洗2遍，然后用0.25％的胰酶消化液于37℃处理5分钟后加入血清终止消化，将细胞打散，2000rpm离心后去上清，用2ml PBS离心洗涤2次后与400nM的标记了FAM的核酸适配体LW-25于4℃孵育1小时；
3.将步骤1和2孵育后的细胞分别用洗涤缓冲液清洗2次，每次用量400μl，最后加入200μl的洗涤缓冲液重悬细胞，用于流式细胞仪检测。检测结果如图3所示，图3为核酸适配体LW-25和转移性胃癌细胞HGC-27的结合能力及结合位置检测结果；图3的结果证明，核酸适配体LW-25能特异性识别靶标细胞HGC-27的表面膜蛋白，当细胞表面膜蛋白被破坏后则不被识别，且随机单链DNA文库与HGC-27细胞无识别。
实施例3
流式细胞仪检测核酸适配体LW-25和转移性胃癌细胞HGC-27的结合特异性：
1.分别将处于对数生长期的HGC-27细胞、AGS细胞、A549细胞、Hep3B细胞、sw480细胞、MCF-7细胞、HepG2细胞、HEK-293细胞用PBS清洗2遍，然后用无酶消化液(APPLYGEN，北京)消化后打散，2000rpm离心后去上清，用2ml PBS离心洗涤2次后分别与400nM的标记了FAM的核酸适配体LW-25和随机单链DNA文库在4℃孵育1小时；
2.将步骤1孵育后的细胞分别用洗涤缓冲液清洗2次，每次用量400μl，最后加入200μl的洗涤缓冲液重悬细胞，用于流式细胞仪检测。检测结果如图4所示，图4为核酸适配体LW-25和转移性胃癌细胞HGC-27的结合特异性检测结果；图4的结果证明，核酸适配体LW-25能特异性识别靶标细胞HGC-27，且随机单链DNA文库与HGC-27细胞无识别，核酸适配体LW-25与其他细胞如AGS细胞、A549细胞、Hep38细胞、sw480细胞、MCF-7细胞、HepG2细胞、HEK-293细胞均无结合或者结合能力很弱。
上述人肝癌细胞系HepG2和Hep3B，人乳腺癌细胞系MCF-7，人肺癌细胞系A549，人结肠癌细胞系SW480，人胚胎肾细胞HEK-293为实验室自有，所有细胞系均是在37℃，5％CO2的培养箱里培养；HepG2、Hep3B、HEK-293和MCF-7的培养基为DMEM含10％胎牛血清(Hyclone)，其他细胞系的培养基为RPMI-1640含10％胎牛血清。
实施例4
流式细胞仪检测核酸适配体LW-25和转移性胃癌细胞HGC-27的解离常数：
1.将生工生物工程(上海)股份有限公司合成的标记了FAM的核酸适配体LW-25用DPBS分别稀释成浓度为0、25、50、100、200、300、400、500nM的溶液；
2.将处于对数生长期的HGC-27细胞用PBS清洗2遍，然后用无酶消化液(APPLYGEN,北京)消化5分钟后打散，2000rpm离心后去上清，用2ml PBS离心洗涤2次；
3.将经步骤2处理的靶标细胞分别与步骤1中不同浓度的标记了FAM的核酸适配体LW-25的溶液在4℃孵育1小时，用流式细胞仪检测。
以流式细胞仪检测到的荧光强度几何平均值为纵坐标，以核酸适配体LW-25的浓度为横坐标，由Y＝Bmax*X/(Kd+X)方程模拟曲线，得到核酸适配体LW-25结合常数绘制曲线，如图5所示，图5为核酸适配体LW-25与转移性胃癌细胞HGC-27的解离常数曲线，由此得到核酸适配体LW-25与转移性胃癌细胞HGC-27的解离常数Kd为121±28nM，核酸适配体LW-25与HGC-27细胞的结合能力很强，解离常数在纳摩尔级别。
实施例5
激光共聚焦检测核酸适配体LW-25和转移性胃癌组织的结合能力及其特异性：
将来自不同病人的淋巴结转移性的胃癌组织、非转移性的胃癌组织、正常的胃部组织分别制备成切片；
将FAM标记的核酸适配体LW-25稀释到浓度为400nM，变复性处理后与切片孵育1小时，用洗涤缓冲液清洗3次后，将切片晾干后用共聚焦显微镜观察；并用随机单链DNA文库与淋巴结转移性的胃癌组织切片的染色结果为对照组。结果如图6和表1所示，图6为核酸适配体LW-25与不同胃癌组织染色结果，其中，A1-A4为区域淋巴结转移的胃癌组织，B1-B4为无区域淋巴结转移的胃癌组织，C1-C4为正常胃组织，D1-D4为区域淋巴结转移的胃癌组织与随机DNA的染色结果；表1为核酸适配体LW-25的免疫组化染色结果。
表1核酸适配体LW-25的免疫组化染色结果
Figure BDA0001724884260000121
由图6和表1可以看出，核酸适配体LW-25对转移性的胃癌组织的识别率为78.2％，对非转移胃癌组织识别率仅29.4％，不识别正常的胃部组织，核酸适配体LW-25对转移性的胃癌组织有很好的识别能力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司
<120> 一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体及其应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工合成(1)
<400> 1
ttcagcactc cacgcatagc caagttgccg acaatacaac ggaccgatta tttccaccga 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

Claims (4)

1.一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为如SEQ ID No.1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶。
3.一种如权利要求1或2所述核酸适配体在制备检测转移性胃癌的试剂盒或分子探针中的应用。
4.一种如权利要求1或2所述核酸适配体在制备治疗转移性胃癌的药物或制剂中的应用。
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