CN108929874B - 一种特异性结合高表达pdl1蛋白的细胞的核酸适配体及其应用 - Google Patents

一种特异性结合高表达pdl1蛋白的细胞的核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种序列中的至少一种：A、如SEQ ID No.1所示的DNA序列；B、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的DNA序列；C、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列。本发明还公开了一种核酸适配体衍生物。本发明还公开了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物的应用。本发明能够与表达PDL1蛋白的细胞紧密结合。

Description

一种特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体及其应用。
背景技术
程序性死亡分子1(programmed death-1，PD1)及其配体(programmed deathligand，PDL)属于B7家族的共刺激分子，介导免疫反应的负性调节信号，在肿瘤发生、病毒感染以及自身免疫病中都发挥了特异性的调节作用。PDL有两种分子模式：细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PDL1)和细胞程序性死亡-配体2(Programmed cell death 1ligand 1，PDL2)，PDL1组成性表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dentric cell，DC)上，在活化后的细胞上表达量增加。除此之外，PDL1还表达于大量非淋巴细胞的组织细胞上，如心脏内皮细胞、胰腺的β细胞、胎盘的合体滋养层细胞等等。相反，PDL2的表达相对较局限，主要表达在抗原递呈细胞上，如活化的巨噬细胞、DC，所以在调节免疫方面主要是PD1/PDL1发挥作用。PDL1也称为表面抗原分化簇274(clusterof differentiation 274，CD274)或B7同源体1(B7 homolog 1，B7-H1)，由CD274基因编码，是由290个氨基酸组成的第一型跨膜蛋白。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+T细胞)会增生，而PD1与PDL1结合，可以传导抑制性的信号，对活化的CD8+T细胞的进一步增殖和活化有显著的抑制作用，肿瘤细胞能借助此途径逃逸细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤作用，从而减弱机体对肿瘤细胞的免疫应答。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，也称为化学抗体，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合。与传统的抗体相比，核酸适配体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针，可以特异结合到目标细胞或者蛋白表面。
免疫检查点和CAR-T细胞治疗是近年来肿瘤免疫治疗领域最引人关注的研究热点。基于PD1/PDL1在机体免疫调节中的作用，PD1与其配体PDL1介导的信号途径正成为通过免疫干预进行临床疾病治疗的手段之一。人源化PDL1抗体能够与部分肿瘤表面PDL1位点结合，阻断T细胞表面PD1与肿瘤PDL1结合，从而解除肿瘤细胞对T细胞免疫抑制作用，增强T细胞杀伤肿瘤细胞能力。基于SELEX的方法，核酸适配体用于肿瘤免疫治疗的可行性目前也被广泛研究。但是据我们所知，基于能特异性结合细胞表面PDL1蛋白的核酸适配体的应用还没有报告。因此，本领域对特异性结合细胞表面PDL1蛋白的核酸适配体存在需求。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体及其应用，本发明与高表达PDL1蛋白的细胞的结合力很强，能特异性识别高表达PDL1蛋白的细胞。
本发明提出的一种特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种序列中的至少一种：
A、如SEQ IDNo.1所示的DNA序列；
B、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的DNA序列；
C、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；
D、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列。
优选地，上述与SEQ ID No.1所示DNA序列具有同源性，且能够特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的DNA序列，其同源性可以为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
发明人通过指数富集细胞系统进化(Cell-SELEX)方法，对高表达PDL1蛋白的细胞进行核酸适配体筛选，筛选过程中使用高表达PDL1蛋白的CHO细胞作为靶标细胞，使用高表达PD1蛋白的CHO细胞作为反筛细胞。筛选得到特异性识别高表达PDL1蛋白的CHO细胞的DNA核酸适配体，简称其为核酸适配体PDL1-45，其序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。
优选地，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶。
本发明还提出了一种核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸适配体改造成的肽核酸。
硫代磷酸酯骨架序列修饰是最简单和广泛使用的可应用于增加核酸酶抗性的化学修饰，未经修饰的核酸适配体可以显示活性，但他们会被核酸酶迅速降解，因此作用有限。在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯键用硫原子取代了非桥键氧原子，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解从而更稳定。
肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构，有很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞。
上述硫代磷酸酯骨架序列和肽核酸可用核酸适配体按照本领域常规方法制得。
本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在组织成像中的应用。
本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在捕获高表达PDL1蛋白的细胞中的应用。
本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备检测高表达PDL1蛋白的细胞的试剂盒或分子探针中的应用。
发明人使用CELL-SELEX方法，通过八轮的筛选获得了一个特定的核酸适配体PDL1-45，它可以特异性结合到高表达PDL1蛋白的CHO细胞上，核酸适配体PDL1-45与高表达PDL1蛋白的CHO细胞的解离常数Kd为152±30nM，在纳摩尔级别，结合力很强；基于核酸适配体PDL1-45对高表达PDL1蛋白的CHO细胞的亲和力和特异性，可以将核酸适配体PDL1-45应用于组织成像和捕获高表达PDL1蛋白的细胞，可以用核酸适配体PDL1-45制备试剂盒或分子探针用于识别、检测高表达PDL1蛋白的细胞。
附图说明
图1为指数富集细胞系统进化方法筛选流程图。
图2为每轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标细胞、反筛细胞结合力的检测结果图，其中a为与靶标细胞结合力的结果，b为与反筛细胞结合力的结果。
图3为不同浓度的核酸适配体PDL1-45与靶标细胞的结合力的检测结果图。
图4为核酸适配体PDL1-45与靶标细胞的解离常数曲线。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
以下实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
实施例1
特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体的筛选
1.合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
随机单链DNA文库：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-40N-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’，
其中，“40N”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列，该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
5’端引物：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG，
3’端引物：5’-(20A)-Spacer 18-TTCACGGTAGCACGCATAGG，
其中，“20A”表示由20个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂，三种“Spacer 18”的结构式如下式I-III所示，在上述3’端引物中所用的“Spacer 18”结构式如式I所示，
Figure BDA0001726784080000061
上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
将随机单链DNA文库、5’端引物、3’端引物分别用PBS缓冲液(NaCl：8g/L，KCl：0.2g/L，Na2HPO4：1.15g/L，KH2PH4：0.2g/L，CaCl2：0.1g/L，MgCl2·6H2O：0.1g/L；PH7.4)配制成浓度均为100μM的贮存液，于-20℃保存备用；
2.正筛
2.1.细胞培养条件：靶标细胞为高表达PDL1蛋白的CHO细胞，反筛细胞为高表达PD1蛋白的CHO细胞；培养基配方为DMEM+5％胎牛血清+HT(1：100)+青链霉素(1:100)+0.5mg/ml G418+1％丙酮酸钠；在二氧化碳培养箱里37℃，5％二氧化碳浓度培养。各成分的品牌以及货号如下：
Figure BDA0001726784080000062
Figure BDA0001726784080000071
2.2.细胞预处理：按2.1中细胞配营养条件分别培养正筛细胞、反筛细胞至直径6cm的平皿铺满约85％，去除培养基后用PBS清洗2次，每次用量5ml，得到预处理后的靶标细胞和反筛细胞；
2.3.孵育和清洗：用130μl PBS稀释溶解1OD上述步骤1中的随机单链DNA文库至浓度为1μM，分装到PCR管进行变复性处理。PCR仪设定95℃孵育10分钟使折叠的链解开，然后将PCR管取出，冰浴5分钟，再室温平衡30分钟得到处理后的随机单链DNA文库；将处理后的随机单链DNA文库合并到一管中，然后加入BSA和鲑鱼精DNA，使得BSA终浓度为1mg/ml，鲑鱼精DNA终浓度为0.05mg/ml，然后加入到2.2得到的预处理后的靶标细胞培养皿中，于4℃孵育1小时，然后去除上清，用PBS清洗细胞4次，每次PBS用量为1ml；
2.4.分离：将2.3得到的细胞用无酶消化液消化30秒后弃上清，用200μlPBS重悬细胞并收集到离心管中，沸水浴10分钟后，14000rpm离心3分钟后收集上清，上清中得到的文库用于扩增；
3.PCR扩增文库：以2.4获得的文库为模板进行扩增，将2.3获得的200μl文库加入2mlPCR mix中混匀，分装到PCR管中扩增，100μl/管，扩增程序为：98℃预变性2分钟，98℃10s，68℃20s，72℃20s扩增15-25个循环。PCR mix的组成比例如下：正向引物和反向引物各500nM，dNTP 200μM，
Figure BDA0001726784080000072
High-Fidelity DNA聚合酶0.02Unit/μl，1×聚合酶bμffer，用水补足体积到2ml；其中，所用的引物如下：
正向引物：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG，
反向引物：5’-(20A)-Spacer 18-TTCACGGTAGCACGCATAGG，
上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
4.制备FAM标记的单链DNA：上述步骤3的扩增产物用正丁醇纯化，方法为加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；然后室温9000rpm离心2分钟，去除正丁醇得到纯化后扩增产物；将纯化后扩增产物按体积比1：1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸变性15分钟使纯化后扩增产物变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行PAGE胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带有PolyA的单链DNA与FAM标记的单链DNA分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如下：
尿素 3.78g
40％聚丙烯酰胺 1.8ml
5*TBE 1.8ml
ddH<sub>2</sub>O 2.25ml
10％APS 60μl
TEMED 15μl
切胶回收FAM标记的单链DNA：将凝胶取出放在塑料膜上，在Ex(nm)：495，Em(nm)：517条件下检测FAM标记的单链DNA；用干净的刀片将目的条带直接切下(切胶时注意带有polyA的单链DNA在目的条带上方，避免切到带有polyA的单链DNA)，将胶条转移至1.5mlEP管中并捣碎，加入1mlddH2O后沸水浴10分钟，离心去除胶的碎片，留上清液，上清液用正丁醇纯化，方法为加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；用台式离心机，室温9000rpm离心2分钟；移弃上相(正丁醇)，回收下层的澄清液体得到FAM标记的单链DNA，用3KD的透析袋透析过夜，作为下一轮筛选的起始文库；
5.反筛：用反筛细胞进行反筛选，反筛选的具体操作为：反筛细胞培养条件和孵育步骤同步骤2.1、2.2和2.3，孵育结束后收集上清用于正筛，弃细胞；从第2轮筛选开始，每一轮在进行正筛之前先进行反筛，反筛后收集上清用于正筛；
6.多轮筛选：将上述步骤4中得到的FAM标记的单链DNA作为起始文库替代步骤2.3中的随机核酸文库，浓度为100nM，体积为1ml；重复筛选8轮，每轮操作均以前一轮操作中得到的FAM标记的单链DNA为起始文库，筛选过程中用流式细胞仪监测每轮得到的FAM标记的单链DNA对靶标细胞识别能力的变化；
7.流式细胞仪检测每轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标细胞的结合力：分别将处于对数生长期的靶标细胞、反筛细胞用PBS清洗2遍，然后用无酶消化液(APPLYGEN，北京)消化后打散，2000rpm离心后去上清，用2mlPBS离心洗涤2次后分别与500nM的每一轮筛选得到的FAM标记的单链DNA在4℃孵育1小时，孵育完成后去除上清，将细胞用洗涤缓冲液清洗3遍，用200μl洗涤缓冲液重悬，流式细胞仪检测；当FAM标记的单链DNA对靶标细胞的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，得到若干条单链DNA的序列；
8.挑选上述步骤7中得到的若干条单链DNA的序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成核酸适配体，然后检测各核酸适配体的亲和力，在后续检测(实施例2)中，确定SEQ ID No.1所示的由59个核苷酸碱基连接而成的序列所对应的核酸适配体具有理想的结合靶标细胞的亲和力，与反筛细胞不结合或者结合很弱，最终得到特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体即核酸适配体PDL1-45。
步骤7中每轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标细胞、反筛细胞结合力的检测结果如图2所示，图2为每轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标细胞、反筛细胞结合力的检测结果图，其中a为与靶标细胞结合力的结果，b为与反筛细胞结合力的结果；由图2的结果证明：随着筛选的进行，得到的单链DNA与靶标细胞的结合能力不断提高，与反筛细胞的结合能力很弱或不结合。
上述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链DNA的量、靶标细胞的用量和两者的孵育时间，增加清洗时间，清洗次数以及加大反筛细胞的用量。
实施例2
流式细胞仪检测核酸适配体PDL1-45和靶标细胞的解离常数：
1.将上海生工合成的标记了FAM的核酸适配体PDL1-45用DPBS分别稀释成浓度为0、25、50、100、200、300、400、500nM的溶液；
2.将处于对数生长期的靶标细胞用PBS清洗2遍，然后用无酶消化液(APPLYGEN，北京)消化5分钟后打散，2000rpm离心后去上清，用2mlPBS离心洗涤2次；
3.将经步骤2处理的靶标细胞分别与步骤1中不同浓度的标记了FAM的核酸适配体PDL1-45的溶液在4℃孵育1小时，然后用PBS清洗2次，每次400μl体积，用流式细胞仪检测。
4.以流式细胞仪检测到的荧光强度几何平均值为纵坐标，以核酸适配体PDL1-45的浓度为横坐标，由Y＝Bmax*X/(Kd+X)方程模拟曲线，得到核酸适配体PDL1-45结合常数绘制曲线，如图3、图4和表1所示，图3为不同浓度的核酸适配体PDL1-45与靶标细胞的结合力的检测结果图，
图4为核酸适配体PDL1-45与靶标细胞的解离常数曲线。
表1核酸适配体PDL1-45的序列及其与靶标细胞的解离常数
Figure BDA0001726784080000111
由图3、图4和表1得到核酸适配体PDL1-45与靶标细胞的解离常数Kd为152±30nM，核酸适配体PDL1-45与靶标细胞的结合能力很强，解离常数在纳摩尔级别。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司
<120> 一种特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体及其应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成(1)
<400> 2
aggtcagatg cggtcgtggc ggtgtggacc tatgcgtgct accgtgaatt cctatgcgt 59

Claims (3)

1.一种特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为：SEQ ID No.1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述特异性结合高表达PDL1蛋白的细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶。
3.一种如权利要求1或2所述核酸适配体在制备检测高表达PDL1蛋白的细胞的试剂盒或分子探针中的应用。
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