CN111748558B - 结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用 - Google Patents

结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的核衣壳蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下核苷酸序列中的至少一种：A、如SEQ ID No.1‑2所示的任意一个DNA序列；B、与SEQ ID No.1‑2所示的任意一个DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；C、在严格条件下与SEQ ID No.1‑2所示的任意一个DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQ ID No.1‑2所示的任意一个DNA序列转录的RNA序列；其中，上述核苷酸序列均能够特异性结合新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的核衣壳蛋白。本发明还公开了上述核酸适配体的缀合物、衍生物及其应用。

Description

结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用。
背景技术
引起严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syn-dromecoronavirus 2，SARS-CoV-2)为一种新型的冠状病毒，具有棘突蛋白S(S蛋白)，核衣壳蛋白(N蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和膜蛋白(M蛋白)等数种主要结构蛋白，研究表明S蛋白是该病毒的主要保护性抗原，N蛋白和M蛋白也可以诱导免疫效应，特别是N蛋白具有较强的免疫原性，2020年1月10日前后，新型冠状病毒基因组全序列由复旦大学上海市公共卫生临床中心提交至NCBI GenBank数据库，其中28274—29533位为“N”基因，可产生病毒核衣壳蛋白(N蛋白)。N蛋白是SARS-CoV主要的结构蛋白，在冠状病毒颗粒中，位于病毒颗粒的核心部分和基因组RNA结合，以往对动物冠状病毒结构蛋白的研究表明，N蛋白在病毒复制和产生的病理反应中起重要作用。
新型冠状病毒可以人传人，对比SARS冠状病毒，SARS-CoV-2致死率低，但传播较快，因为SARS-CoV-2感染者会出现急性、严重呼吸道疾病，伴有发热、咳嗽、气短及呼吸困难，严重的病例还会出现肾功能衰竭和死亡，当前并无有效的治疗药物。新型冠状病毒检测方法目前也并不完善，需依赖特定仪器、特殊实验室和专业技术人员，且检测过程复杂，不能满足及时检测需求，且存在一定的漏检率。新型冠状病毒由于潜伏期具有传染性，为了排查很多无症状感染者，迫切需要发展现场、实时、便捷的家庭检测方法。已知N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中含量非常丰富，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。在抗击SARS病毒中，核衣壳蛋白已被证明是良好的诊断标记，目前新型冠状病毒结构与SARS病毒类似并且新型冠状病毒引起的肺炎，相应的疫苗、小分子药物甚至抗体药物都在开发中。目前检测方法主要是实时逆转录酶聚合酶链检测方法(rRT-PCR)。不管是小分子药物、疫苗或抗体的开发周期都较长，而筛选得到的新型冠状病毒核衣壳蛋白特异的核酸适配体既可以用于快速建立有效的检测方法，也可能用于新冠肺炎的治疗。
新冠状病毒特异性的核酸适配体(aptamer)可以用于开发多种检测方法。核酸适配体是一种经SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选得到的短链DNA或RNA序列，与对应的靶物质有特异的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体在病毒检测以及中和病毒方面的价值已被广泛证实，包括针对埃博拉、HIV，流感(H1N5、H9N2、H1N1)、乙肝、丙肝、病毒等。在point-of-care testing(POCT)检测方面，适配体技术也表现出卓越的优势。相对于抗体而言，核酸适配体具有多方面的优势。如靶标广泛，不管是金属离子、有机小分子、小肽、蛋白质、病毒、细菌、细胞甚至病理组织，都可以筛选到相应的适配体。适配体可以通过体外实验快速获得，生产与质控远比抗体简单，直接化学合成即可，另外生产成本较低等。基于核酸适配体的识别机制和核酸可以配对的特点，可以设计出比抗体更多的检测技术，用于适应不同的应用场景。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用，本发明可以高度特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白，且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记。
本发明人使用体外指数富集的利用(SELEX)技术，筛选得到了特异性结合新型冠状病毒核衣壳核衣壳蛋白的核酸适配体。详细地，本发明人设计并合成了一个随机单链DNA文库及相应的引物，用来筛选具有亲和力高、特异性强、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体，由此筛选得到2个特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体，并检测了它们与新型冠状病毒核衣壳N蛋白的结合能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。
本发明提出的一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下核苷酸序列中的至少一种：
A、如SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列；
B、与SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；
C、在严格条件下与SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列杂交的DNA序列；
D、由SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列转录的RNA序列；
其中，上述核苷酸序列均能够特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。
上述如SEQ ID No.1-2所示的DNA序列，其序列如下表所示：
Figure BDA0002543227630000031
Figure BDA0002543227630000041
优选地，上述与SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列具有同源性，且能够特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的DNA序列，其同源性可以为至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％；例如可以通过在SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列上删除或增加部分互补的核苷酸。
优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等中的至少一种。
本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，以上经修饰处理后的核酸适配体，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合；经修饰处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。
本发明还提出了一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体缀合物，所述核酸适配体缀合物是在上述核酸适配体序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗的物质。
优选地，用于标记、检测、诊断或治疗的物质包括：荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽或siRNA中的至少一种。
本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，上述核酸适配体缀合物，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合；上述核酸适配体缀合物可以保持或提高核酸适配体与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。
本发明还提出了一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体、核酸适配体缀合物序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸适配体、核酸适配体缀合物改造成的肽核酸。
上述核酸适配体衍生物与原核酸适配体具有基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合。
上述“硫代磷酸酯骨架”具有本领域技术人员一般理解的含义，其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，并且可以增强核酸适配体对核酸酶的抗性，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解从而更稳定。
上述“肽核酸”具有本领域技术人员一般理解的含义，其是指一种人工合成DNA分子类似物，于1991年由Nielsen等首次报道。用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团，因此PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于DNA与DNA之间的结合强度。
上述硫代磷酸酯骨架序列和肽核酸可用核酸适配体按照本领域常规方法制得。
本发明提出了上述核酸适配体、核酸适配体缀合物、核酸适配体衍生物在检测、富集新型冠状病毒SARS-CoV-2中的应用。
本发明提出了上述核酸适配体、核酸适配体缀合物、核酸适配体衍生物在新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白的纯化、成像、浓度检测中的应用。
本发明提出了上述核酸适配体、核酸适配体缀合物、核酸适配体衍生物在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的肺炎的药物中的应用。
本发明所提供的核酸适配体或其截断核酸适配体可以高度特异性结合N蛋白，其相对蛋白抗体而言，具有能够化学合成、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记等优点；其可以用于N蛋白的检测。
本发明所提供的核酸适配体、其缀合物、其衍生物可以高度特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白，且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记；其可以用于检测新型冠状病毒、结合富集新型冠状病毒；也可以用于新型冠状病毒核衣壳蛋白的纯化、成像、浓度检测；还可以用于诊断和治疗新型冠状病毒核衣壳蛋白所致的疾病，尤其是严重急性呼吸综合症；本发明还可以用于治疗新型冠状病毒药物和疫苗的研发，对新冠肺炎的防治药物和疫苗以及诊断技术研究具有重要意义；
其中，如SEQ ID No.1、2所示的两条DNA序列结合在新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白的不同位置，因此可以配对使用，可以利用夹心法的方式的检测新型冠状病毒N蛋白。上述如SEQ ID No.1、2所示的DNA序列、及其缀合物、衍生物可以用来开发夹心法检测新型冠状病毒N蛋白。
上述夹心法检测是指已知二个结合同一蛋白不同位点的核酸适配体，其中一个核酸适配体包被在载体上，然后将含有抗原(如本专利中的新型冠状病毒SARS-CoV-2的N蛋白)的待检测标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被在载体上的核酸适配体上，然后再加入做了酶或者荧光标记的另一条核酸适配体，该条适配体会连接到抗原上的另外表位上，最后根据酶的反应或者荧光标记判定待测物中的抗原含量。
附图说明
图1为实施例1中磁珠筛选后，N蛋白每轮保留率的结果。
图2为实施例1筛选时获得的第3轮和第5轮的文库与N蛋白的结合情况，其中，pool3为第3轮得到的文库，pool5为第5轮得到的文库。
图3为用SPR检测的如SEQ ID No.1、2所示的核酸适配体与N蛋白的结合力结果。
图4为用表面等离子共振检测的如SEQ ID No.1、2所示的核酸适配体的夹心实验检测结果。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
以下实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
以下实施例中，新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白简称为N蛋白。
实施例1
特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核酸适配体的筛选
1.合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
随机单链DNA文库(记为lib13文库)：
5’～3’
TTCAGCACTCCACGCA-TAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA
其中，“N”表示任意的核苷酸碱基连接而成的序列，该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
引物信息如表1所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1引物及其序列
Figure BDA0002543227630000081
备注：①在引物名称中，S1代表正向引物，A2代表反向引物，S1-FAM代表荧光标记的正向引物，A2-ployA为连接有polyA尾的反向引物，polyA为由19个A(腺苷酸)组成的polyA尾；
②在引物序列中，“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂；表1中所述的的“Spacer 18”结构式如下式所示。
Figure BDA0002543227630000082
上述引物分别用PBS缓冲液(氯化钙0.1g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，六水氯化镁0.1g/L，氯化钠8g/L，十二水磷酸氢二钠2.8915g/L；PH7.4，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。
2.磁珠法筛选
2.1羧基磁珠固定反筛蛋白：
取300μl羧基磁珠(Invitrogen,DynabeadsTMMyOneTMCarboxylic Acid，#65012)，用200μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠记为磁珠a，去上清；取浓度为0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液100μl和浓度为0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液100μl，室温缓慢解冻并混匀，然后加入到磁珠a中，室温，摇床孵育20min(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)，磁铁垂钓磁珠，去上清，用DPBS清洗磁珠2遍记为磁珠b，每次DPBS的用量均为200μl；
取20μl his蛋白(浓度为0.5mg/ml)，加入pH3.6 NaAC水溶液95μl混匀，然后加入到磁珠b中；室温摇床孵育60min(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)，磁铁垂钓磁珠记为磁珠c，去上清；取100μl浓度为1M的乙醇胺(pH8.5)加入到磁珠c中，室温，摇床孵育10min(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)，磁铁垂钓磁珠，去上清，用DPBS清洗磁珠4遍，每次DPBS的用量为200μl，磁珠记为MB-his待用。
2.2羧基磁珠固定N蛋白：
取100μl羧基磁珠，用200μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠记为磁珠d，去上清；取配置好的50μl NHS和50μl EDC，室温缓慢解冻并混匀，然后加入到磁珠d中，室温，摇床孵育20min(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)，磁铁垂钓磁珠，去上清，用DPBS清洗磁珠2遍记为磁珠e，每次DPBS的用量均为200μl；
取20μlN蛋白(购自义翘神州，40588-V08B，浓度为0.75mg/ml)，加入30μlpH3.6的NaAC水溶液混匀，然后加入到磁珠e中；室温摇床孵育60min(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)，磁铁垂钓磁珠记为磁珠f，去上清；取100μl浓度为1M乙醇胺(pH8.5)加入到磁珠f中，室温，摇床孵育10min(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)，磁铁垂钓磁珠，去上清，用DPBS清洗磁珠4遍，每次DPBS的用量为200μl，磁珠记为MB-N待用。
2.3筛选：
变复性：取一支1OD的lib13文库作为起始文库，14000rpm离心10min，加入140μlDPBS溶解，溶解后的浓度为10μM，分装到PCR管中，放入PCR仪进行变复性，程序为：95℃保持10min，立即冰水浴5min，然后平衡至室温，记为pool0；
反筛：将pool0加入到50μl MB-his中，用枪缓慢吹打混匀，室温摇床孵育40min，磁铁垂钓磁珠，用枪头吸走上清记为pool-，用DPBS漂洗磁珠4次，每次DPBS的用量为200μl，磁铁垂钓磁珠，4次漂洗的上清分别记为wash1-、wash2-、wash3-、wash4-；向磁珠中加入200μlDPBS，沸水浴10min，磁铁垂钓磁珠，上清记为elution-；
正筛：将pool-加入到50μl MB-N中，用枪缓慢吹打混匀，室温摇床孵育40min，用DPBS漂洗磁珠4次，每次DPBS的用量为200μl，磁铁垂钓磁珠，4次漂洗的上清分别记为wash1+、wash2+、wash3+、wash4+；向磁珠中加入200μlDPBS，沸水浴10min，磁铁垂钓磁珠，上清记为elution+；
荧光定量PCR检测：取罗氏8联排PCR管，每孔加入30μl Q-PCR mix，再分别加入wash1-、wash2-、wash3-、wash4-、elution-、wash1+、wash2+、wash3+、wash4+、elution+各2μl，进行荧光定量PCR，程序如下：95℃2min；95℃0.5min，60℃0.5min，72℃0.5min25cycles。
2.4制备单链：
(1)将剩下的elution+加入到2mlPCRmix里混匀，再加入8ml ePCR微液滴生成油制备得到乳浊液；ePCR微液滴生成油购自安徽省昂普拓迈(Aptamy)生物科技有限公司(货号：EPO100)，PCR mix的配方见表2；
表2:PCR mix配方
试剂 总体积1000μl
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 866μl
10×pfu酶buffer 100μl
dNTPmix(10mM) 20μl
Lib13S1-FAM(100μM) 5μl
Lib13A2-polyA(100μM) 5μl
Pfu酶 4μl(20U)
(2)将乳浊液分装到PCR管，每管100μl，进行PCR，程序为：95℃2min，95℃1min，60℃1min，72℃1min，25cycles；然后用正丁醇浓缩PCR产物，将浓缩的PCR产物按体积比1：1加入TBE/尿素变性缓冲液(安徽省昂普拓迈生物科技有限公司，货号：TLB-5)，煮沸变性15min使DNA变性，随后冰浴1min，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使FAM标记的ssDNA与反向的带有PolyA的加长的ssDNA分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表3所示：
表3变性聚丙烯酰胺凝胶配方
成分 用量
尿素 3.78g
40％聚丙烯酰胺 1.8ml
5×TBE 1.8ml
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 2.25ml
10％APS 60μl
TEMED 15μl
(3)切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，Ex(nm)：495，Em(nm)：517检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5ml EP管中并捣碎，加入1ml ddH2O后沸水浴10min，将胶中的ssDNA转移到溶液中，12000rpm离心2min，回收上清，转移到15ml的离心管中，再次取1ml MES缓冲液至碎胶中，重复煮沸离心一次，将上清全部转移至同一个15ml离心管中；向15ml离心管中，加12ml正丁醇，上下颠倒混匀离心，9000rpm离心5min，溶液出现分层，吸除上层液，回收下层液；将下层液用DPBS buffer在3.5KD的透析袋中于4℃透析过夜得到次级文库(次级文库是ssDNA)，并用微量紫外测定其浓度；
磁珠法重复筛选6轮，每次操作均以上一轮筛选中得到的次级文库为起始文库。
每轮筛选时，2.3的变复性步骤中，起始文库的配制方法如表4所示。
表4每轮筛选，起始文库的配制方法
Figure BDA0002543227630000121
备注：第1-6轮筛选得到的次级文库经2.3的变复性处理后分别记为pool1、pool2、pool3、pool4、pool5、pool6。
2.5检测：
配置不同浓度的Lib13文库绘制标准曲线，并按照2.3步骤中荧光定量PCR检测的操作方法检测计算每轮磁珠筛选N蛋白的保留率，结果如图1所示。
图1为实施例1中磁珠筛选后，N蛋白每轮保留率的结果。
由图1可以看出正筛的保留率逐渐提高，反筛保留率逐渐降低。
在筛选过程中用表面等离子共振(SPR)检测实施例1每轮筛选得到的次级文库对N蛋白识别能力的变化，具体检测步骤如下：
溶液配制：
样品溶液：取实施例1中的pool3，pool5，分别用DPBS缓冲液稀释至文库的浓度为500nM即可。
活化溶液：浓度为0.4M的EDC水溶液和浓度为0.1M的NHS水溶液的等体积混合液。
操作：
S1、使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore T200)，将N蛋白偶联到CM5芯片表面的第2通道：先用50mM NaOH水溶液清洗芯片，进样20μl，流速10μl/min，然后用活化溶液进样50μl活化芯片，流速5μl/min；将N蛋白用pH＝5.5，浓度为10mM的醋酸钠水溶液稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/min，N蛋白偶联量为2000Ru；进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/min，进样50μL；
S2、第1通道按照S1步骤处理，只是不进行偶联N蛋白的步骤，活化和封闭的步骤完全一样，作为对照通道。
S3、检测：设定动力学检测参数，取各样品溶液分别依次流过1、2通道，进样30μL/min，时间2min，解离30μL/min，时间3min，用1M NaCl再生，流速30μL/min，时间0.5min。
上述检测结果如图2所示，图2为实施例1筛选时获得的第3轮和第5轮的文库与N蛋白的结合情况，其中，pool3为第3轮得到的文库，pool5为第5轮得到的文库，每条曲线均是通道2检测结果减去通道1检测结果之后得到的曲线。
由图2可以看出第五轮文库与N蛋白的亲和力比第三轮文库的亲和力高很多，满足测序要求。将所得文库高通量测序分析。
2.6分析和鉴定多次筛选后得到的核酸适配体：
将实施例1筛选得到的富集文库经高通量测序分析后，挑选若干条序列由通用生物合成，检测亲和力。
在后续检测中，确定了2条序列与N蛋白具有很强的结合能力，将2条序列进行截短之后分别得到了如SEQ ID No.1-2所示的核酸适配体，分别命名为SARS-CoV-2-N1和SARS-CoV-2-N2。
实施例2表面等离子共振(SPR)检测如SEQ ID No.1-2所示的核酸适配体与N蛋白的亲和力情况
样品溶液：取如SEQ ID No.1-2所示的核酸适配体，分别用DPBS缓冲液稀释至浓度为500nM即可。
其他操作同实施例1的2.5步骤中的图2的检测方法，其中S1中，N蛋白的偶联量为1500Ru。
检测结果如图3所示，图3为用SPR检测的如SEQ ID No.1、2所示的核酸适配体与N蛋白的结合力结果，其中，SARS-CoV-2-N1为如SEQ ID No.1所示的核酸适配体、SARS-CoV-2-N2为如SEQ ID No.2所示的核酸适配体。每一条曲线是通道2差减通道1之后的曲线。
由图3可以看出，用SPR仪检测到如SEQ ID No.1、2所示的核酸适配体与SARS-CoV-2核衣壳蛋白均有很强的结合，仪器给出的每条序列的KD值分别如表5所示。
表5如SEQ ID No.1、2所示的核酸适配体与N蛋白的亲和力检测结果
核酸适配体名称 亲和力KD(nM)
SEQ ID No.1 8.76
SEQ ID No.2 9.82
由表5和图3可以看出，如SEQ ID No.1、2所示的核酸适配体与N蛋白的亲和力很高。
实施例3表面等离子共振(SPR)检测如SEQ ID No.1、2所示的核酸适配体与N蛋白结合位点。
溶液配制：
样品1：取如SEQ ID No.1所示的核酸适配体，用DPBS缓冲液稀释至浓度为500nM即可。
样品2：取如SEQ ID No.2所示的核酸适配体，用DPBS缓冲液稀释至浓度为500nM即可。
混合溶液：浓度为0.4M的EDC水溶液和浓度为0.1M的NHS水溶液的等体积混合液。
操作：
S1、将N蛋白偶联到CM5芯片表面的第2通道：先用50mM NaOH水溶液清洗芯片，进样20μl，流速10μl/min，然后用混合溶液进样50μl活化芯片，流速5μl/min；将N蛋白用pH＝5.5，浓度为10mM的醋酸钠水溶液稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/min，N蛋白偶联量为3000Ru；进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/min，进样50μL；
S2、检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore T200)设定动力学检测参数，取样品1进样流过2通道，进样2min，接着取样品3进样流过2通道，进样2min，然后解离2min。
上述检测结果如图4所示，图4为用表面等离子共振检测的如SEQ ID No.1、2所示的核酸适配体的夹心实验检测结果。
由图4可以看出，两次进样后信号均有明显的提升，可以说明如SEQ ID No.1、2(即图4中的SARS-CoV-2-N1、SARS-CoV-2-N2)所示的核酸适配体结合在N蛋白的不同位点。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司
<120> 结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cacgcatagc ttccaatgga gggggttggg atgggatggg tattggccta tgcgtg 56
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cacgcatagc cgtgcggata cggaaccgta ccatgggcgg tgggtggcct atgcgtg 57

Claims (7)

1.一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列如SEQ ID No.1或2所示。
2.根据权利要求1所述特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化中的至少一种。
3.一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体缀合物，其特征在于，所述核酸适配体缀合物是在权利要求1所述核酸适配体序列中连接上用于标记、检测、诊断或治疗的物质；用于标记、检测、诊断或治疗的物质包括：荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽或siRNA中的至少一种。
4.一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体衍生物，其特征在于，所述核酸适配体衍生物是由权利要求1或2中所述核酸适配体、权利要求3所述核酸适配体缀合物序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由权利要求1或2项所述核酸适配体、权利要求3所述核酸适配体缀合物改造成的肽核酸。
5.一种如权利要求1或2所述核酸适配体、权利要求3所述核酸适配体缀合物、权利要求4所述核酸适配体衍生物在非诊断目的的检测、富集新型冠状病毒SARS-CoV-2中的应用。
6.一种如权利要求1或2所述核酸适配体、权利要求3所述核酸适配体缀合物、权利要求4所述核酸适配体衍生物在新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白的纯化、成像、非诊断目的的浓度检测中的应用。
7.一种如权利要求1或2所述核酸适配体、权利要求3所述核酸适配体缀合物、权利要求4所述核酸适配体衍生物在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的肺炎的药物中的应用。
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