CN114814216B - 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法 - Google Patents

用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法 Download PDF

Info

Publication number
CN114814216B
CN114814216B CN202210756418.XA CN202210756418A CN114814216B CN 114814216 B CN114814216 B CN 114814216B CN 202210756418 A CN202210756418 A CN 202210756418A CN 114814216 B CN114814216 B CN 114814216B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
cov
sars
nucleocapsid protein
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210756418.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114814216A (zh
Inventor
谭蔚泓
彭瑞资
李恒轩
付晓艺
杨秋霞
宋明慧
甘绍举
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Of Basic Medicine And Oncology Chinese Academy Of Sciences Preparatory
Original Assignee
Institute Of Basic Medicine And Oncology Chinese Academy Of Sciences Preparatory
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Of Basic Medicine And Oncology Chinese Academy Of Sciences Preparatory filed Critical Institute Of Basic Medicine And Oncology Chinese Academy Of Sciences Preparatory
Priority to CN202210756418.XA priority Critical patent/CN114814216B/zh
Publication of CN114814216A publication Critical patent/CN114814216A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114814216B publication Critical patent/CN114814216B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体‑抗体混合夹心法，属于生物检测技术领域。本发明所使用的核酸适体‑抗体混合夹心法以SARS‑CoV‑2的核衣壳蛋白为检测靶点，能够准确鉴别出SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白。使用本发明进行鉴别SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白的步骤包括：收集待测样品；将待测样品与核酸适体‑抗体组合混合形成混合物；检测混合物中是否存在SARS‑CoV‑2‑核衣壳蛋白‑核酸适体复合物。利用核酸适体‑抗体混合夹心法能够鉴别SARS‑CoV‑2家族中多种病毒的核衣壳蛋白，可解决基于核酸适体的SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白靶向识别策略的难题。

Description

用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法。
背景技术
新冠肺炎的“早发现”措施，主要依赖于疾病的诊断，目前主要有三种方式，一是核酸诊断方法（如荧光定量PCR）、二是抗原诊断（如胶体金）、三是抗体检测（如ELISA），但这些检测方法目前并不完善，对加护、设备要求高，需依赖特定仪器、特殊实验室和专业技术人员，且检测过程复杂，不能满足及时检测需求，还存在一定的漏检率。
核酸适体是指通过指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其它靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合。核酸适体具有高亲和力，高特异性，稳定性好等多个优点，近年来其在生物医学领域得到了广泛的应用。由于病毒和病原体容易变异，从而能轻易逃离免疫系统的应答，对人体造成难以预测的重大危害。核酸适体的各方面优点使其在病毒和病原体的检测与控制方面有着很好的应用前景。
传统意义上的双抗夹心法是利用被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用有颜色的纳米颗粒标记后直接通过肉眼观测得到。这两种抗体必须小心选取，才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。采用核酸适体-抗体混合夹心策略是指用核酸适体替代检测抗体或者捕捉抗体，有利于提高检测的灵敏度和检出率。
中国专利CN104031921A公开了一种西维因的核酸适体、衍生物及其应用，该发明利用核酸适体制备胶体金试纸，检测西维因；中国专利CN104745586A公开了可卡因核酸适体、检测试剂盒及其应用，该发明使用核酸适体制备胶体金试纸检测可卡因。可见，核酸适体在检测领域发挥重要作用，但目前针对核酸适体检测SARS-CoV-2鲜有研究。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于鉴别新冠（SARS-CoV-2）核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法，使用这种方法能够快速并且准确鉴别样品中的SARS-CoV-2。
为达到上述发明目的，采用如下技术方案。
一种复合物，包括：
核酸适体与SARS-CoV-2野生型和/或突变型核衣壳蛋白特异性结合形成的复合物；
核酸适体与可检测标记物组成的偶联物与SARS-CoV-2野生型和/或突变型核衣壳蛋白特异性结合形成的复合物。
核衣壳蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。核衣壳蛋白是一种具有高度免疫原性的磷蛋白，基因序列非常保守，因此非常适合作为检测标志物。本发明使用核酸适体对SARS-CoV-2-进行检测和鉴定，核酸适体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短等特点，能够特异性结合SARS-CoV- 2核衣壳蛋白不同位点。
优选地，可检测标记物包括以下至少一种：
生物素；化学发光基团；化学荧光基团；荧光蛋白；酶；抗体；抗原；配体；放射性同位素；胶体金；乳胶微球。
优选地，
核酸适体包括以下至少一条：
如SEQIDNO.1所示序列N35：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
如SEQIDNO.2所示序列N10：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.3所示序列N2-62：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.4所示序列N2：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG。
优选地，核酸适体的筛选方法为SELEX（Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，指数富集配体系统进化技术）筛选，包括如下步骤：
设计长度为60-80 nt的筛选文库，文库包含中间的随机序列和两端的引物序列；根据设计的筛选文库，以SARS-CoV-2野生型或突变型核衣壳蛋白为对象，筛选出与SARS-CoV-2野生型或突变型核衣壳蛋白具有高亲和力的核酸适体。
本发明还提供一种偶联物，该偶联物能够用于检测和鉴别SARS-CoV-2。
一种偶联物，包括SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示核酸适体以及与其相连的可检测标记物。
优选地，可检测标记物包括以下至少一种：
生物素；化学发光基团；化学荧光基团；荧光蛋白；酶；抗体；抗原；配体；放射性同位素；胶体金；乳胶微球。
通过将核酸适体与可检测标记物偶联，使核酸适体更适于检测SARS-CoV-2 。
更优选地，化学发光基团包括但不限于：鲁米诺、吖啶酯。
更优选地，化学荧光基团包括但不限于：FITC、TRITC。
更优选地，酶包括但不限于：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶。
更优选地，放射性同位素包括但不限于：32P、36S。
更优选地，乳胶微球可携带修饰，修饰包括但不限于：链霉亲和素。
本发明还提供一种非疾病的诊断和治疗目的、检测样品中SARS-CoV-2野生型以及突变型存在情况的核酸适体-抗体混合夹心法，包括如下步骤：
收集待测样品；
将待测样品与核酸适体或上述偶联物混合形成混合物；
检测混合物中是否存在SARS-CoV-2-核酸适体复合物。
利用核酸适体-抗体混合夹心法能够鉴别SARS-CoV-2家族中多种病毒的核衣壳蛋白，可解决基于核酸适体的SARS-CoV-2核衣壳蛋白靶向识别策略的难题。本发明核酸适体-抗体混合夹心法是指通过多个核酸适体联合抗体结合同一蛋白的不同位置来进行检测，包括但不限于夹心ELISA法。
本发明还提供一种核酸适体-抗体组合，组合包括上述核酸适体与能够结合SARS-CoV-2抗原的抗体。
非疾病的诊断和治疗目的、检测样品中SARS-CoV-2野生型以及突变型存在情况的核酸适体-抗体混合夹心法，包括如下步骤：
收集待测样品；
将待测样品与上述核酸适体或上述核酸适体-抗体组合混合形成混合物；
检测混合物中是否存在SARS-CoV-核酸适体复合物。
优选地，突变型包括：Omicron，D63G-R203M-D377Y三位点突变型。
优选地，将待测样品与上述核酸适体-抗体组合混合形成混合物与检测混合物中是否存在SARS-CoV-2-核酸适体复合物可使用鉴别试纸完成。
更优选地，鉴别试纸包括硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸。
更优选地，鉴别试纸通过如下步骤制得：
预处理；喷涂；划膜；组合。
更进一步优选地，预处理包括如下步骤：
样品垫处理：将玻璃纤维浸润在样品垫处理液中，静置10-40min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
结合垫处理：将玻璃纤维浸润在结合垫处理液中，静置10-40min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
抗体透析：将蛋白质稀释到一定浓度装入透析袋中依次放入低浓度溶液（0.005-0.008mol/L NaCl pH 7.0）和三蒸水中透析。
更进一步优选地，样品垫处理液pH为8.0-9.0，含0.05-1M Tris-HCl，0.5%-1%PVP，0.5%-1PEG，0.2%-5% BSA。
更进一步优选地，结合垫处理液pH为7.0-8.0，含0.1-0.2M Tris-HCl缓冲液，1%-5% BSA，0.5%-1% PVP，0.5%-2% PEG， 5%-20% 蔗糖。
更进一步优选地，喷涂包括如下步骤：
将质量分数为0.5-0.8%核酸适体-乳胶微球偶联物通过划膜机喷涂于预处理后的结合垫上，喷量为4-8μL/cm。
更进一步优选地，划膜包括如下步骤：
将试纸条置于划膜机合适的位置，制备检测线和质控线的抗体溶液，检测线和质控线所用抗体浓度为0.5-2 mg/mL。
更进一步优选地，组合包括如下步骤：
将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸组装到PVC板上。
更优选地，鉴别试纸的使用方法包括如下步骤：
取待测样品滴加与样品垫；等待15min后进行结果判读。
更优选地，使用鉴别试纸进行检测时的判读标准为：
阳性（+）：出现两条带，检测线和质控线，表示样本中存在SARS-CoV-2；
阴性（-）：仅质控线出现一条带，检测线无条带出现，表示样本中没有SARS-CoV-2；
无效：质控线未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效，应重新测试。
本发明还公开了上述核酸适体的用途，包括以下至少一种：
在特异性结合SARS-CoV-2-核衣壳蛋白中的用途；
在制备检测或鉴别SARS-CoV-2-核衣壳蛋白的试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明使用核酸适体-抗体混合夹心法鉴别SARS-CoV-2-核衣壳蛋白。核酸适体-抗体混合夹心法是指通过多个核酸适体联合抗体结合同一蛋白的不同位置来进行检测，包括但不限于夹心ELISA法。本发明所使用的核酸适体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短等特点，能够特异性结合SARS-CoV-2-核衣壳蛋白不同位点。因此，本发明所使用的方法能够准确鉴别SARS-CoV-2，并且根据本发明方法制得的鉴别试纸具有特异性强，灵敏度高的特点。
附图说明
图1为本发明试纸对多种冠状病毒交叉反应检测结果；
图2为本发明试纸与部分商业化试纸条对SARS-CoV-2-核衣壳蛋白的检测结果；
图3为本发明试纸对多种SARS-CoV-2突变株的检测结果。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
核酸适体的制备
1、构建筛选文库
本研究中所用的ssDNA文库，全长为76 nt，由两端固定的20 nt长度的引物片段和中间30 nt的随机片段构成；正向引物5’修饰FITC荧光基团，与初始文库的5’端固定序列相同；反向引物5’端以Biotin标记，序列与初始文库的3’端固定序列反向互补；
靶向SARS-Cov-2 核衣蛋白筛选文库序列为：
SEQIDNO.5：
CTTCTGCACGCCTCCTTCC（N35）GGAGACGAGATCGGCGGACACT。
构建文库所使用的引物为：
正向引物：SEQIDNO.6：CTTCTGCACGCCTCCTTCC；
反向引物：SEQIDNO.7：AGTGTCCGCCGATCTCGTCTCC。
2、蛋白与磁珠偶联
取链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠加入SARS-CoV-2-核衣壳蛋白或BSA稀释液，室温摇床孵育60min，使羧基磁珠与蛋白偶联。
3、蛋白筛选
文库变性后与偶联凝胶珠的SARS-CoV-2-核衣壳蛋白混合孵育；洗脱后，利用高温将结合在偶联凝胶珠的SARS-CoV-2-核衣壳蛋白上的序列分离下来；利用PCR扩增，之后进行单链制备；
文库变性后与偶联BSA的凝胶珠混合孵育；将不与凝胶珠结合的序列收集投入到下一轮筛选中；
如此反复，进行8轮的蛋白筛选。
4、核酸适体候选链的挑选
使用qPCR检测筛选进程，为了获得与SARS-CoV-2-核衣壳蛋白结合的ssDNA，将第8轮ssDNA富集文库进行高通量测序，挑选核酸适体；得到如下序列：
如SEQIDNO.1所示序列N35：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
如SEQIDNO.2所示序列N10：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.3所示序列N2-62：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.4所示序列N2：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG；
筛选出以上序列后交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，合成的核酸适体带有生物素修饰。
实施例2
乳胶微球-核酸适体偶联物的制备
将链霉亲和素（SA）修饰的乳胶微球（质量分数1%，杭州优思达提供）用超纯水稀释一倍至质量分数为0.5%；然后，向质量分数为0.5%的SA修饰的乳胶微球加入4倍过量生物素修饰的核酸适体进行交联，交联条件为室温震荡1 h；
将所得到的交联产物通过离心法除去上清液中未结合到乳胶微球表面的核酸适体序列，离心条件为4℃，10000 rpm，5 min；然后通过离心法用超纯水洗涤交联产物两次，最终用50 uL的点胶液定容待后备用；
按照上述操作方法，制备乳胶微球-核酸适体偶联物，当使用多条核酸适体与乳胶微球制备乳胶微球-核酸适体偶联物时，有如下标记方法：
1）混合标记，即不同的核酸适体序列标记至同一个乳胶微球标表面；
2）单一标记，即同一种核酸适体序列标记至同一个乳胶微球标表面，然后将不同的乳胶微球进行混合使用；
根据不同的标记方法以及不同的核酸适体，制备出不同的乳胶微球-核酸适体偶联物。
实施例3
鉴别试纸的制备
1、预处理
按配方配制如下处理液：
样品垫处理液：1 M Tris-HCl缓冲液，1% PVP，1% PEG，5% BSA，pH为9.0；
结合垫处理液：0.2 M Tris-HCl缓冲液，5% BSA，1% PVP，2% PEG，20% 蔗糖，pH为8.0；
透析液：0.008 mol/L NaCl，pH 7.0；
配制完成后进行预处理：
样品垫处理：将玻璃纤维浸润在样品垫处理液中，静置30 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
结合垫处理：将玻璃纤维浸润在结合垫处理液中，静置30 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
抗体透析：将抗体稀释后装入透析袋中依次放入透析液和三蒸水中透析12 h；
2、喷涂乳胶微球
将实施例2中制得的乳胶微球-核酸适体偶联物通过划膜机喷涂于预处理后的结合垫上，乳胶微球-核酸适体偶联物质量分数为0.5%，喷量为6 μL/cm；
3、划膜
使用划膜机进行划膜，检测线（T线）使用的抗体为：核衣壳蛋白抗体Cov6，浓度为2mg/mL；
质控线（C线）使用的抗体为：抗链霉亲和素抗体，浓度为1 mg/mL；
4、组合
依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装到PVC板上即得鉴别试纸；
按照上述方法制备不同的鉴别试纸。
实施例2和3中制得的乳胶微球-核酸适体偶联物以及试纸如表1所示。
表1 乳胶微球-核酸适体偶联物以及试纸
所用核酸适体SEQIDNO 偶联物序号 试纸序号 标记方法
1 1 1 单一标记
2 2 2 单一标记
3 3 3 单一标记
4 4 4 单一标记
1、2 5 5 单一标记
1、3 6 6 单一标记
1、4 7 7 单一标记
2、3 8 8 单一标记
2、4 9 9 单一标记
3、4 10 10 单一标记
1、2、3 11 11 单一标记
1、2、4 12 12 单一标记
1、3、4 13 13 单一标记
2、3、4 14 14 单一标记
1、2、3、4 15 15 单一标记
1、2 16 16 混合标记
1、3 17 17 混合标记
1、4 18 18 混合标记
2、3 19 19 混合标记
2、4 20 20 混合标记
3、4 21 21 混合标记
1、2、3 22 22 混合标记
1、2、4 23 23 混合标记
1、3、4 24 24 混合标记
2、3、4 25 25 混合标记
1、2、3、4 26 26 混合标记
试验例1
鉴别试纸特异性和灵敏度检测
通过滴加不同浓度的、含有不同病毒或病毒核衣壳蛋白的缓冲液，观察试纸条出现条带的情况。
选择的病毒或病毒核衣壳蛋白包括：SARS-CoV，HCOV-HKV-1，HCOV-OC43，HCOV-229E，MERS-Cov核衣壳蛋白；
将上述病毒或病毒核衣壳蛋白使用DPBS缓冲液配制成浓度为100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL的标准液，用胶头滴管吸取标准液，滴3滴在样品垫上，滴加后静置15分钟后进行结果判读：
阳性(+)：出现两条带，检测线和质控线，表示样本中存在SARS-CoV或SARS-CoV-2；
阴性(-)：仅质控线出现一条带，检测线无条带出现，表示样本中没有SARS-CoV或SARS-CoV-2；
无效：质控线未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效，应重新测试。
通过上述方法测定实施例3中制得的所有试纸，为避免冗余，此处仅展示15号试纸的检测结果图（见图1），其他检测结果由表2所示，且表2仅展示最低检测限的检测结果；
表2 试纸对不同病毒以及蛋白的检测结果
试纸序号 SARS-CoV（1ng/mL） HCOV-HKV-1（1ng/mL） HCOV-OC43（1ng/mL） HCOV-229E（1ng/mL） MERS-Cov核衣壳蛋白（1ng/mL）
1 + - - - -
2 + - - - -
3 + - - - -
4 + - - - -
5 + - - - -
6 + - - - -
7 + - - - -
8 + - - - -
9 + - - - -
10 + - - - -
11 + - - - -
12 + - - - -
13 + - - - -
14 + - - - -
15 + - - - -
16 + - - - -
17 + - - - -
18 + - - - -
19 + - - - -
20 + - - - -
21 + - - - -
22 + - - - -
23 + - - - -
24 + - - - -
25 + - - - -
26 + - - - -
由表2和图1可知，本发明核酸适体-抗体混合夹心法能够准确鉴别SARS-CoV，具有特异性。
试验例2
鉴别试纸对核衣壳蛋白的检测
取SARS-CoV-2-核衣壳蛋白配制成10 pg/mL和100 pg/mL的标准液，用胶头滴管吸取标准液，滴3滴在样品垫上，滴加后静置15分钟后进行结果判读，判读标准同试验例1；
通过上述方法测定实施例3中制得的所有试纸以及3种商业化试纸，为避免冗余，此处仅展示15号试纸的检测结果照片（见图2），其他检测结果由表3所示；由图和表中数据可见本发明所得试纸条能有效鉴别SARS-CoV-2-核衣壳蛋白，并且检测限不低于10 pg/mL，再次说明本发明检测方法的有效性和准确性。
表3 试纸对核衣壳蛋白的检测结果
试纸序号 核衣壳蛋白（100 pg/mL） 核衣壳蛋白（10 pg/mL）
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 + +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 + +
15 + +
16 + +
17 + +
18 + +
19 + +
20 + +
21 + +
22 + +
23 + +
24 + +
25 + +
26 + +
商业化A - -
商业化B - -
商业化C - -
试验例3
鉴别试纸对SARS-COV-2突变病毒的检测
所选择的突变为Omicron，D63G-R203M-D377Y-三位点突变型
将上述病毒使用DPBS缓冲液配制成浓度为100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100ng/mL、1000 ng/mL的标准液，用胶头滴管吸取标准液，滴3滴在样品垫上，滴加后静置15分钟后进行结果判读，判读标准同试验例1；
通过上述方法测定实施例3中制得的所有试纸，为避免冗余，此处仅展示15号试纸的检测结果图（见图3），其他检测结果由表4所示，且表4仅展示最低检测限的检测结果；
表4 试纸对突变的检测结果
试纸序号 Omicron（10 pg/mL） D63G-R203M-D377Y-三位点突变型（10 pg/mL）
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 + +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 + +
15 + +
16 + +
17 + +
18 + +
19 + +
20 + +
21 + +
22 + +
23 + +
24 + +
25 + +
26 + +
由表4和图3可知，本发明核酸适体-抗体混合夹心法对SARS-CoV-2突变株的鉴定同样有效，特异性强，并且最低检测限可达10 pg/mL。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院基础医学与肿瘤研究所（筹）
<120> 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgtcgggg gggtcacaca tgaaccgtgc ggatacggag acgag 45
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcctccttc ctctcggggt gtgtagggtc agggagtgtg agaggaggag acgagatcgg 60
cg 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcctccttc cacgggatcg gattccccac tcggctctat cggattggag acgagatcgg 60
cg 62
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgcatagc cgtgcggata cggaaccgta ccatgggcgg tgggtggcct atgcgtg 57
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttctgcacg cctccttccn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnggagac 60
gagatcggcg gacact 76
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttctgcacg cctccttcc 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtgtccgcc gatctcgtct cc 22

Claims (8)

1.一种复合物，其特征在于，所述复合物包括：
核酸适体与SARS-CoV-2野生型或突变型核衣壳蛋白特异性结合形成的复合物；
核酸适体与可检测标记物组成的偶联物与SARS-CoV-2野生型或突变型核衣壳蛋白特异性结合形成的复合物；
其中，所述核酸适体包括：
如SEQ ID NO.2所示序列N10：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述可检测标记物包括以下至少一种：
生物素；化学发光基团；化学荧光基团；荧光蛋白；酶；抗体；抗原；放射性同位素；胶体金；乳胶微球。
3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述核酸适体还包括以下任一组：
N35/N10；或
N2/N10；或
N2-62/N10；或
N35/N2/N10；或
N35/N2-62/N10；或
N2/N2-62/N10；或
N35/N10/N2-62/N2；
其中，N35序列如SEQ ID NO.1所示：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
N2-62序列如SEQ ID NO.3所示：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
N2序列如SEQ ID NO.4所示：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG。
4.一种非疾病的诊断和治疗目的、检测样品中SARS-CoV-2野生型以及突变型核衣壳蛋白存在情况的核酸适体-抗体混合夹心法，包括如下步骤：
收集待测样品；
将待测样品与核酸适体或权利要求1所述偶联物混合形成混合物；
检测混合物中是否存在SARS-CoV-2-核衣壳蛋白-核酸适体复合物。
5.一种核酸适体-抗体组合，其特征在于，所述组合包括权利要求3所述的核酸适体与能够结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的抗体。
6.一种非疾病的诊断和治疗目的、检测样品中SARS-CoV-2野生型以及突变型核衣壳蛋白存在情况的核酸适体-抗体混合夹心法，包括如下步骤：
收集待测样品；
将待测样品与权利要求5所述核酸适体-抗体组合混合形成混合物；
检测混合物中是否存在SARS-CoV-2-核衣壳蛋白核酸适体复合物。
7.如权利要求6所述的混合夹心法，其特征在于，所述突变型包括：Omicron，D63G-R203M-D377Y-三位点突变型。
8.权利要求3中所述核酸适体的用途，包括：
在制备检测或鉴别SARS-CoV-2-核衣壳蛋白的试剂中的用途。
CN202210756418.XA 2022-06-30 2022-06-30 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法 Active CN114814216B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210756418.XA CN114814216B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210756418.XA CN114814216B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114814216A CN114814216A (zh) 2022-07-29
CN114814216B true CN114814216B (zh) 2022-10-18

Family

ID=82522484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210756418.XA Active CN114814216B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114814216B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115838728B (zh) * 2022-07-12 2023-10-03 中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹) 新冠病毒全长核衣壳蛋白dna核酸适体的体外筛选方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021233977A1 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 Diesse Diagnostica Senese S.P.A. Method for inactivating sars-cov-2 and its use for detecting antibodies

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005054469A1 (en) * 2003-12-05 2005-06-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Health Anti-sars monoclonal antibodies
KR101887876B1 (ko) * 2016-08-18 2018-08-13 한국과학기술연구원 H5형 조류독감 바이러스에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머 및 이를 이용하는 h5형 조류독감 바이러스의 검출방법
BR102021003012A2 (pt) * 2020-02-19 2021-11-30 Univ Berlin Charite Métodos para o diagnóstico de infecção por sars-cov-2, kit e usos
CN113151282B (zh) * 2020-02-21 2022-04-19 中国科学技术大学 结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的核酸适配体及其用途
WO2021202440A1 (en) * 2020-03-30 2021-10-07 Biovector, Inc. Aptamers against sars-cov-2, compositions comprising aptamers against sars-cov-2 and methods of using the same
CN111693712B (zh) * 2020-04-02 2023-05-02 苏州大学 一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法
US20210349090A1 (en) * 2020-05-06 2021-11-11 Roche Diagnostics Operations, Inc. Corona nucleocapsid antigen for use in antibody-immunoassays
US20210333277A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Roche Diagnostics Operations, Inc. Corona nucleocapsid antigen for use in antibody-immunoassays
CN111748558B (zh) * 2020-06-17 2023-05-05 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用
GB202009351D0 (en) * 2020-06-18 2020-08-05 Aptamer Diagnostics Ltd Aptamers against SARS-CoV-2
WO2022016163A2 (en) * 2020-07-17 2022-01-20 The Regents Of The University Of California Aptamer-based point-of-care assay devices an methods
GB202014755D0 (en) * 2020-09-18 2020-11-04 Randox Laboratories Ltd Methods to determine coronavirus infectivty status
CN112198316A (zh) * 2020-10-28 2021-01-08 北京安必奇生物科技有限公司 一种检测新型冠状病毒n蛋白的适配体胶体金试纸及其制备方法
CN214669112U (zh) * 2020-10-28 2021-11-09 北京安必奇生物科技有限公司 一种检测新型冠状病毒n蛋白的适配体胶体金试纸条
CN112941078B (zh) * 2021-02-04 2021-09-10 绵阳市游仙区创新科技产业技术研究院 一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途
CN112964873B (zh) * 2021-02-22 2022-09-30 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 基于夹心法的SARS-CoV-2检测试剂盒
CN113447467B (zh) * 2021-06-04 2022-05-13 厦门大学 一种新冠病毒SARS-CoV-2抗原的检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021233977A1 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 Diesse Diagnostica Senese S.P.A. Method for inactivating sars-cov-2 and its use for detecting antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
核酸适体的筛选制备及分析应用;刘腾飞等;《生物技术通报》;20130426(第04期);39-48页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114814216A (zh) 2022-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109406778B (zh) 一种检测烟叶中青枯病菌的时间分辨荧光定量试纸条及其制备方法和应用
CN114814215B (zh) 基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条
CN110579591A (zh) 一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法
CN114814216B (zh) 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法
CN107828856B (zh) 一种pcr-lf技术检测碳青霉烯类耐药基因kpc和ndm的引物组合物及其应用
CN112415195A (zh) 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用
WO2022053072A1 (zh) 荧光层析定量检测幽门螺杆菌抗体试剂卡及检测方法
CN112415205A (zh) 检测eb病毒/hcmv的试剂盒及其应用
CN115073613A (zh) 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用
CN110618259A (zh) 一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法
CN114460287A (zh) 一种中和抗体的检测方法和试剂盒
CN111551746A (zh) 非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法
CN116298297A (zh) 一种同时检测合胞病毒和新型冠状病毒抗原的胶体金层析试纸条
CN108303543B (zh) 一种猪瘟e2蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法
CN108303542B (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法
CN108303531B (zh) 一种o型口蹄疫抗体检测试剂盒及其检测方法
CN114807151B (zh) 用于检测病原微生物的多核酸适体及其组合
CN114910649A (zh) 检测抗α-烯醇化酶-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN114910650A (zh) 检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN116970611B (zh) 一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体及其应用
CN114410640B (zh) 一种用于检测麻疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN104558135B (zh) 一种与谷氨酸脱氢酶65抗体特异结合的抗原蛋白质
CN114410641B (zh) 一种用于检测风疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114381460B (zh) 一种用于检测腮腺炎病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN113917134B (zh) 用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant