CN107828856B

CN107828856B - 一种pcr-lf技术检测碳青霉烯类耐药基因kpc和ndm的引物组合物及其应用

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Publication number: CN107828856B
Application number: CN201711179817.XA
Authority: CN
Inventors: 李晓军; 顾芸芸; 孙宁; 史利宁; 姚新月; 王卫萍; 陈芳芳; 黄梅; 王颖; 杨阳
Original assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Current assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: CN107828856A

Abstract

本发明公开了一种PCR‑LF技术检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的引物组合物及其应用。所述引物组合物包含：用于检测KPC基因的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2；用于检测NDM基因的上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4；其中KPC基因的上游引物5’端标记生物素，下游引物3’端标记地高辛；NDM基因的上游引物5’端标记生物素，下游引物3’端标记FAM。本发明系首次采用多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术的方法实现KPC和NDM碳青霉烯类耐药基因的检测，耗时短、灵敏度高、特异性强。

Description

一种PCR-LF技术检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的引物组合物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种PCR-LF技术检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的引物组合物及其应用。

背景技术

细菌对β内酰胺类抗菌药物的耐药机制是产生了可以水解药物β内酰胺环的β内酰胺酶，使药物失去抗菌活性。Ambler分类法根据氨基酸序列的相似性将β内酰胺酶分为A、B、C、D共4类，其中A、B、D类中具有水解碳青霉烯类活性的酶被称为碳青霉烯酶。A类碳青霉烯酶的催化基团活性部位均含丝氨酸残基，可以被克拉维酸和他挫巴坦抑制。A类碳青霉烯酶有KPC、GES、SEM、IMI/NMC-A、SHV-38和SFC-1，各组酶对碳青霉烯类的水解活性有很大差异。A类酶中KPC-2是最常见的耐药基因类型，世界范围内均有流行。B类碳青霉烯酶又称金属β内酰胺酶(MBL)，所有的金属酶都含有至少1个锌离子活性中心，可以水解包括碳青霉烯类在内带有β内酰胺环的多种抗生素，其水解活性不被克拉维酸、舒巴坦等酶抑制剂抑制，但可以被乙二胺四乙酸(EDTA)及巯基化合物等金属离子螯合剂所抑制。主要有IMP、VIM和NDM等类型，据报道从肺炎克雷伯菌中首次分离出新的金属酶基因型即NDM-1，该菌株对几乎所有β内酰胺类耐药，仅对替加环素和多黏菌素敏感。D类碳青霉烯酶又称苯唑西林酶(OXA酶)，大多对碳青霉烯类水解效率较低，不能水解氨曲南，常与其他耐药机制协同导致细菌对碳青霉烯类高度耐药。早期检测和鉴别碳青霉烯酶的耐药基因能更好控制感染扩散和爆发。实验室检测方法有药物敏感试验，改良Hodge试验，分子诊断等。实验室最常用的是采用临床标本进行分离培养鉴定，选用亚胺培南或美罗培南做药敏鉴定，通常需要2-5天；改良Hodge试验，周转时间达4天，这些方法均耗时又费力，不能及时提供有效的诊断；基于核酸的检测技术，多数是PCR技术，其检测成本和技术要求高，易污染，急需一种能够及时，简便，准确，避免污染的核酸检测方法，用于耐药基因的多重检测。多重聚合酶链反应结合胶体金免疫侧流层析杂交技术是一种利用标记引物同时检测多个靶标基因进行扩增，胶体金免疫侧流层析试纸条进行快速，安全的检测其耐药基因，指导病人合理治疗。

发明内容

本发明的目在于克服现有技术的不足，为提升临床碳青霉烯类耐药基因检测技术，提供一种碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM多重聚合酶链反应结合胶体金免疫侧流层析杂交技术(PCR-LF)的试剂盒。利用生物信息学技术，按照各基因不同的亚型与发现菌株进行分类整理基因组序列，比对序列，获得一致性序列，获得基因序列的保守区，分别设计针对KPC基因(用于鉴别碳青霉烯酶的耐药基因KPC)和NDM基因(用于鉴别碳青霉烯酶的耐药基因NDM)标记的多重扩增引物，优化引物组合与反应体系；利用核酸杂交的原理，将带有标记的扩增产物与侧流层析试纸条上特异性抗体进行结合，建立了碳青霉烯类耐药基因的多重PCR扩增与胶体金免疫侧流层析杂交技术试剂盒；操作简便，特异性强且检测灵敏度高的检测方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一对带有标记的用于扩增碳青霉烯类耐药基因KPC的PCR引物，作为碳青霉烯类耐药基因KPC检测引物，其上游引物5’端标记生物素，序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物3’端标记地高辛,序列如SEQ ID NO.2所示。碳青霉烯类耐药基因KPC的PCR检测引物(KPC基因的检测引物)：

KPC-2F:5’GACAACAGGCATGACGGTGG 3’(SEQ ID NO.1)，

KPC-2R:5’GTCCAGACGGAACGTGGTATC 3’(SEQ ID NO.2)；

一对带有标记的用于扩增碳青霉烯类耐药基因NDM的PCR引物，作为碳青霉烯类耐药基因NDM检测引物，其上游引物5’端标记生物素，序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物3’端标记FAM,序列如SEQ ID NO.4所示。碳青霉烯类耐药基因NDM的PCR检测引物(NDM基因的检测引物)：

NDM-9F:5’TGGCAGCACACTTCCTATCT 3’(SEQ ID NO.3)，

NDM-9R:5’CGACAACGCATTGGCATAAG 3’(SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了一种带有标记的用于扩增碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的多重聚合酶链反应结合胶体金免疫侧流层析杂交技术(PCR-LF)试剂盒，所述试剂盒中包含本发明的多重PCR扩增引物组，所述引物组包括如下引物对：

碳青霉烯类耐药基因KPC的多重PCR检测引物(KPC基因的检测引物)，其上游引物5’端标记生物素，下游引物3’端标记地高辛：

KPC-2F:5’GACAACAGGCATGACGGTGG 3’(SEQ ID NO.1)，

KPC-2R:5’GTCCAGACGGAACGTGGTATC 3’(SEQ ID NO.2)；

碳青霉烯类耐药基因NDM的多重PCR检测引物(NDM基因的检测引物)，其上游引物5’端标记生物素，下游引物3’端标记FAM：

NDM-9F:5’TGGCAGCACACTTCCTATCT 3’(SEQ ID NO.3)，

NDM-9R:5’CGACAACGCATTGGCATAAG 3’(SEQ ID NO.4)。

所述引物组成为：上游引物和下游引物均为0.1μM/L，多重PCR扩增碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的产物分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

进一步的，该检测试剂盒还包括有：KPC标准品、NDM标准品、TaqDNA聚合酶、无菌去离子水、阴性标准品、胶体金免疫侧流层析试纸条。

所述的KPC及NDM标准品，采用pUCm-T载体转化克隆技术，分别合成碳青霉烯类耐药基因KPC标准品和NDM标准品，用于多重PCR反应体系的构建和优化。用于构建碳青霉烯类耐药基因KPC标准品和NDM标准品的引物序列如下：

用于构建碳青霉烯类耐药基因KPC标准品的引物：

KPC-F:GTATCGCCGTCTAGTTCTGC(SEQ ID NO.9)

KPC-R:GGTCGTGTTTCCCTTTAGCC(SEQ ID NO.10)

用于构建碳青霉烯类耐药基因NDM标准品的引物：

NDM-F:GGTTTGGCGATCTGGTTTTC(SEQ ID NO.11)

NDM-R:CGGAATGGCTCATCACGATC(SEQ ID NO.12)

所述的DNA标准品，依据pUCm-T载体转化克隆技术，采用已制备克隆载体内含目的基因作为扩增模板，利用单重PCR技术合成双链DNA，双链DNA序列依次为SEQ ID NO.7和SEQID NO.8。

所述的阴性标准品为无菌去离子水。

所述的阳性标准品分别为KPC标准品、NDM标准品。

所述的TaqDNA聚合酶于市场购买得到。

所述的胶体金免疫侧流层析试纸条主要由玻璃纤维素膜、PVC底板、样品垫、吸水纸、硝酸纤维素膜、质控线包被BSA化生物素、KPC检测线包被的抗地高辛抗体、NDM检测线包被抗FAM抗体组成,均于市场购买得到。试纸条结构如图17所示。

具体的检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的多重聚合酶链反应及胶体金免疫侧流层析技术试剂盒，每30μL扩增体系中含TaqDNA聚合酶15μL，带有标记的上游和下游引物分别为0.3μL，待测样本DNA提取液为5μL，无菌去离子水补足至30μL。

多重聚合酶链反应的反应条件为：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，60℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。产生带有标记的多重PCR扩增产物。

利用胶体金免疫侧流层析试纸条进行检测；从而检测临床标本中的碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM。

本发明的优点和积极效果如下：

(1)单管多重检测：本发明首次建立碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的多重PCR检测方法，可一次实现两个靶标基因的检测，从而直接实现碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的检测，降低检测成本，节省检测时间；

(2)灵敏度高：本发明采用多重PCR方法检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM，对于KPC基因最低可见检测到700copies/反应，对于NDM基因最低可见检测到500copies/反应；

(3)特异性高：本发明中，利用生物信息学方法，根据发现基因的亚型与菌种进行分类，比对分析，而后获得其保守序列，进而设计引物，其覆盖度高和特异性强；

(4)避免污染：本发明所采用的胶体金免疫侧流层析法，用于多重PCR产物的检测，无需采用传统的凝胶电泳法，避免了环境污染和操作者的损害；同时无需电泳仪和紫外照射仪，操作简单易用。

综上所述，本发明提供了一种多重PCR检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的多重聚合酶链反应及胶体金免疫侧流层析技术试剂盒，及其相关的寡核苷酸引物序列。本发明特异性高，适用性广，节省检测时间，并且操作简单，避免环境污染，能够有效地应用于临床医学标本的检测。

附图说明

图1采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板,以双标记的KPC为引物的单重PCR特异性检测结果。1为KPC阳性菌液，2为KPC阳性标准，3为NDM阳性菌液，4为NDM阳性标准，引物为5’端标记生物素的KPC-2F/3’端标记地高辛的KPC-2R单重PCR扩增产物，使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果。

图2采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板,以双标记的NDM为引物的单重PCR特异性检测结果。1为NDM阳性菌液，2为NDM阳性标准，3为KPC阳性菌液，4为KPC阳性标准，引物为5’端标记生物素的NDM-9F的/3’端标记FAM的NDM-9R单重PCR扩增产物，使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果。

图3采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR-LF的双标记引物特异性检测结果。1为KPC阳性菌液，2为NDM阳性菌液，3为KPC和NDM阳性菌液混合液，4为KPC阳性标准，5NDM阳性标准，6为KPC和NDM阳性标准，7为空白，引物为5’端标记生物素的KPC-2F/3’端标记地高辛的KPC-2R和5’端标记生物素的NDM-9F的/3’端标记FAM的NDM-9R多重PCR扩增产物，使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果。

图4采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR-LF的双标记引物特异性检测结果。1为标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)，2为标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923),3为标准菌株铜绿假单胞菌(ATCC27853),4为标准菌株粪肠球菌(ATCC29212),5为标准菌株肺炎克雷伯菌(ATCCBAA1705)，引物为5’端标记生物素的KPC-2F/3’端标记地高辛的KPC-2R和5’端标记生物素的NDM-9F的/3’端标记FAM的NDM-9R多重PCR扩增产物，使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果。

图5显示采用含有碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM细菌培养物作为模板的多重PCR-LF验证体系检测细菌分离培养物的灵敏度。1-8为梯度稀释的KPC和NDM模板，多重PCR扩增产物使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果：1.KPC基因的菌液7.6×10⁷copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁷copies/reaction；2.KPC基因的菌液7.6×10⁶copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁶copies/reaction；3.KPC基因的菌液7.6×10⁵copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁵copies/reaction；4.KPC基因的菌液7.6×10⁴copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁴copies/reaction；5.KPC基因的菌液7.6×10³copies/reaction、NDM基因的菌液5×10³copies/reaction；6.KPC基因的菌液7.6×10²copies/reaction、NDM基因的菌液5×10²copies/reaction；7.KPC基因的菌液7.6×10¹copies/reaction、NDM基因的菌液5×10¹copies/reaction，8.KPC基因的菌液7.6×10⁰copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁰copies/reaction。引物为5’端标记生物素的KPC-2F/3’端标记地高辛的KPC-2R和5’端标记生物素的NDM-9F/3’端标记FAM的NDM-9R多重PCR扩增产物，使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果。

图6显示采用模拟临床痰液样本中含有耐药基因KPC和NDM的作为模板，将其10倍梯度稀释的的多重PCR-LF验证体系检测临床样本的灵敏度。1-8为梯度稀释的KPC和NDM模板，多重PCR扩增产物使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果：1.KPC基因的菌液7.6×10⁷copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁷copies/reaction；2.KPC基因的菌液7.6×10⁶copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁶copies/reaction；3.KPC基因的菌液7.6×10⁵copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁵copies/reaction；4.KPC基因的菌液7.6×10⁴copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁴copies/reaction；5.KPC基因的菌液7.6×10³copies/reaction、NDM基因的菌液5×10³copies/reaction；6.KPC基因的菌液7.6×10²copies/reaction、NDM基因的菌液5×10²copies/reaction；7.KPC基因的菌液7.6×10¹copies/reaction、NDM基因的菌液5×10¹copies/reaction，8.KPC基因的菌液7.6×10⁰copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁰copies/reaction。引物为5’端标记生物素的KPC-2F/3’端标记地高辛的KPC-2R和5’端标记生物素的NDM-9F的/3’端标记FAM的NDM-9R多重PCR扩增产物，使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果。

图7显示采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR-LF检测41份临床标本中1-24个样本的检测结果:6、7、8、21、24为KPC阳性；其余结果为KPC和NDM均阴性。引物为KPC-2F的5’端标记生物素/KPC-2R的3’端标记地高辛和NDM-9F的5’端标记生物素/NDM-9R的3’端标记FAM的多重PCR扩增产物，使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果。

图8显示采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR-LF检测41份临床标本25-41个样本的检测结果:26、28、29、30、33、36、38、41为KPC阳性；35、39为NDM阳性；其余结果为KPC和NDM均阴性。引物为5’端标记生物素的KPC-2F/3’端标记地高辛的KPC-2R和5’端标记生物素的NDM-9F的/3’端标记FAM的NDM-9R多重PCR扩增产物，使用胶体金免疫侧流层析试纸条检测的结果。

图9采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板,以KPC为引物的单重PCR特异性检测结果。Lane M为DL2000DNA Marker；Lane 1为KPC阳性菌液、Lane 2为KPC阳性标准、Lane3为NDM阳性菌液,Lane 4为NDM阳性标准，Lane 5为阴性对照，引物为KPC-2F/KPC-2R单重PCR扩增结果。

图10采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板,以NDM为引物的单重PCR特异性检测结果。Lane M为DL2000DNA Marker；Lane 1为NDM阳性菌液、Lane 2为NDM阳性标准、Lane3为KPC阳性菌液,Lane 4为KPC阳性标准，Lane 5为阴性对照，引物为NDM9F/NDM9F单重PCR扩增结果。

图11采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR引物特异性检测结果。Lane M为DL2000DNA Marker；Lane 1为KPC阳性菌液、Lane 2为NDM阳性菌液、Lane 3为KPC和NDM阳性菌液混合液；Lane 4为KPC阳性标准、Lane 5NDM阳性标准、Lane 6为KPC和NDM阳性标准，引物为KPC-2F/KPC-2R和NDM9F/NDM9F多重PCR扩增结果。

图12采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR引物特异性检测结果。Lane M为DL2000DNA Marker；Lane 1为标准菌株肺炎克雷伯菌(ATCCBAA1705)、Lane 2为标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、Lane 3为标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、Lane 4为标准菌株铜绿假单胞菌(ATCC27853)、Lane 5为标准菌株粪肠球菌(ATCC29212)，引物为KPC-2F/KPC-2R和NDM9F/NDM9F多重PCR扩增结果。

图13显示采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR检测灵敏度。Lane M为DL2000DNA Marker；Lane 1-6为梯度稀释的KPC和NDM模板多重PCR扩增电泳结果：Lane1：KPC浓度为7.6×10⁵copies/reaction、NDM浓度为5×10⁵copies/reaction；Lane 2:KPC浓度为7.6×10⁴copies/reaction、NDM浓度为5×10⁴copies/reaction；Lane 3：KPC浓度为7.6×10³copies/reaction、NDM浓度为5×10³copies/reaction；Lane 4：KPC浓度为7.6×10²copies/reaction、NDM浓度为5×10²copies/reaction；Lane 5：KPC浓度为7.6×10¹copies/reaction、NDM浓度为5×10¹copies/reaction；Lane 6：KPC浓度为7.6×10⁰copies/reaction、NDM浓度为5×10⁰copies/reaction。

图14显示模拟临床样本，临床收集的不含待测基因的痰液样本稀释上述KPC基因和NDM基因的细菌培养物作为模板的多重PCR检测灵敏度。Lane M为DL2000DNA Marker；Lane 1-6为梯度稀释的KPC和NDM模板多重PCR扩增电泳结果：Lane 1：KPC浓度为7.6×10⁵copies/reaction、NDM浓度为5×10⁵copies/reaction；Lane 2:KPC浓度为7.6×10⁴copies/reaction、NDM浓度为5×10⁴copies/reaction；Lane 3：KPC浓度为7.6×10³copies/reaction、NDM浓度为5×10³copies/reaction；Lane 4：KPC浓度为7.6×10²copies/reaction、NDM浓度为5×10²copies/reaction；Lane 5：KPC浓度为7.6×10¹copies/reaction、NDM浓度为5×10¹copies/reaction；Lane 6：KPC浓度为7.6×10⁰、NDM浓度为5×10⁰copies/reaction。

图15显示采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR检测41份临床标本中的1-24例检测结果。Lane M为DL2000DNA Marker；Lane 1-24为临床标本检测结果。

图16显示采用碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM作为模板的多重PCR检测41份临床标本中的25-41例检测结果。Lane M为DL2000DNA Marker；Lane 25-41为临床标本检测结果。

图17胶体金免疫侧流层析法结构图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本实施例使用的所有溶剂及试剂均为市售成品，引物为上海生工生物技术有限公司(上海)合成；TaqDNA聚合酶(Code No.:RR001A)购自Takara公司(日本)；T-载体PCR产物克隆试剂盒(Code No.:B522211)购自上海生工生物技术有限公司(上海)；柱式DNA胶回收试剂盒(Code No.:B518131)购自上海生工生物技术有限公司(上海)；微量样品基因组DNA提取试剂盒(Code No.:DP316)购自北京天根生物技术有限公司(北京)；胶体金免疫侧流层析试纸条组装使用的胶体金专业样品垫(Code No.:JY-Y01-09)；NC膜(Code No.:NC-a101-b105)；玻璃纤维素膜(Code No.:JY-J101)；胶体金专业吸水纸(Code No.:JY-X101-104)；底板(Code No.:DB-6)；衔接胶带(Code No.:F0011)均购自上海杰一生物技术有限公司(上海)。

实施例1

1.阳性标准品的制备

(1)DNA模板制备

采用水煮的方法提取含有目的基因细菌培养物的DNA，具体如下：取培养基上分离培养的菌落，加入到500μL无菌去离子水中，振荡混匀，100℃水浴10min，12000rpm离心3min，上清液作为DNA模板，-20℃保存备用。

(2)PCR扩增制备标准品的DNA模板

反应体系(30μL)：在200μL PCR管中，分别加入5.0μL含有目的基因DNA模板，0.3μLRandom Primer(0.1μM)，15μLTaqDNA聚合酶，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，56℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。

分别采用引物对KPC-F(SEQ ID NO.9)/KPC-R(SEQ ID NO.10)和NDM-F(SEQ IDNO.11)/NDM-R(SEQ ID NO.12)分别进行PCR扩增。PCR扩增体系(30μL)：DNA模板5μL、各上游引物和下游引物分别加0.3μL，Taq DNA聚合酶15μL，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，56℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收，并进行测序。

(3)pUCmT载体转化提取质粒

参考pUCmT-载体PCR产物克隆试剂盒(上海生工，Code No.:B522211)说明书，在0.2ml PCR管中配制下列连接体系：依次加入目的基因的胶回收产物6μL(0.2pmoL)；pUCm-TVector1μL(50ng)；10×Ligation Buffer 1μL；50％PEG 4000 1μL；T4DNA Ligase 1μL；Sterilized ddH₂O补足至10μL；最后加入T4DNA Ligase，16℃连接过夜；将100μl大肠杆菌JM109感受态置于冰上解冻，加入连接液，混匀，冰上放置30min；42℃水浴热激90sec，再冰上放置5min；加入900μL s℃培养基，37℃振荡培养1h；4000rpm离心3min，去掉上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌悬液涂布在含20μL IPTG和100μL X-gal的氨苄青霉素抗性的LB平板上；于37℃培养过夜；挑取白色菌落，以基因特异性引物进行PCR扩增，确认载体中插入片段的长度大小，提取质粒后进行测序鉴定(序列分别是：KPC为目的基因的克隆扩增序列为SEQ ID NO.7，NDM为目的基因的克隆扩增序列为SEQ ID NO.8)。

2.阴性标准品的制备

以无核酸序列的无菌去离子水为阴性标准品

3.引物的设计与筛选

由于GeneBank数据库中已发表的碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM基因序列非常众多，为提高引物的适用性和特异性，将数据库中的基因序列按照不同亚型和发现菌株进行分类，利用软件DNAMAN进行序列比对，获得基因保守区。此外，对于多重PCR引物来说，其扩增产物大小应具有差别，否则，无法辨别。因此，我们设计了多对引物，利用单重PCR扩增携带目的基因的菌液模板，对引物进行验证。表1为验证后的PCR引物。

表1

4.多重PCR扩增体系的建立

利用上述已筛选的引物进行双标记，5’端标记生物素的KPC-2F(SEQ ID NO.1)/3’端标记地高辛的KPC-2R(SEQ ID NO.2)和NDM-9F(SEQ ID NO.3)的5’端标记生物素/NDM-9R(SEQ ID NO.4)8的3’端标记FAM的多重PCR扩增产物，分别以阳性标准品、阴性标准品、待测标本DNA作为模板，进行多重PCR扩增体系的建立。PCR扩增体系(30μL)：在0.2mL离心管中依次加入Taq DNA聚合酶15μL，上下游引物(10μM)各0.3μL，DNA模板为5μL，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，60℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。

5.凝胶电泳验证

取上述已建立的多重PCR扩增产物5ul，MARKER,DL2000 5ul加样于1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电流400A,时间30min。结果如图5。

6.胶体金免疫层析试纸条的制备

(1)胶体金溶液的制备：取49.5ml去离子水置于处理好的锥形瓶中，加入0.5ml1％的氯金酸，放入微波炉中加热，当溶液沸腾时加入0.8ml的1％柠檬酸钠，继续放入微波炉中加热，变为葡萄酒红色，取下冷却至室温，避光4℃保存备用。

(2)胶体金标链霉亲和素的制备：取50mL胶体金溶液，置于三角锥瓶中，用0.1mol/L的碳酸钾溶液调其PH值至8.5。用移液器吸取220μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液逐滴加入到胶体金溶液中，震荡混匀20min，加入3％的聚乙二醇0.875ml作为稳定剂，混匀15min，封住三角锥瓶的瓶口，4℃保存备用。

(3)胶体金免疫层析试纸条的组装：按照图17组装胶体金免疫层析试纸条。KPC检测线标记浓度为0.025mg/ml的抗地高辛抗体，NDM检测线标记浓度为0.125mg/ml的抗FAM抗体；质控线标记浓度为0.05ml/ml的BSA化生物素，37℃烘干1小时备用，样本检测稀释液采用PBS。具体程序如下：取样本稀释液PBS 40μl于反应管中，加入胶体金链霉亲和素2ul，在加入具有双标记引物扩增的PCR产物2μl，5min以内观察结果，若质控线、KPC检测线、NDM检测线均出现红色，结果为KPC、NDM均阳性；若质控线、KPC检测线出现红色，结果为KPC阳性；若质控线、NDM检测线均出现红色，结果为NDM阳性；若只有质控线为红色，结果为阴性；若质控线不显色，则试纸条失效或扩增出现错误。

7.多重PCR-LF的特异性与灵敏度分析

(1)单重PCR验证双标记引物的特异性

取含有碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的阳性细菌培养物，混匀于无菌去离子水中，取菌液标本1mL，提取混合细菌标本DNA，取5μL DNA提取液利用双标记的KPC引物：5’端标记生物素的KPC-2F(SEQ ID NO.1)/3’端标记地高辛的KPC-2R(SEQ ID NO.2)单重PCR检测KPC，验证引物的特异性，结果如图9；取上述混合细菌标本DNA提取液5μL利用双标记的NDM引物：5’端标记生物素的NDM-9F(SEQ ID NO.3)/3’端标记FAM的NDM-9R(SEQ ID NO.4)单重PCR检测NDM，验证引物的特异性，结果如图2。检测体系为：Taq DNA聚合酶15μL，上下游引物(10μM)均为0.3μL，DNA模板为5μL，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，60℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。将PCR产物进行胶体金免疫侧流层析试纸条检测，结果如图1，双标记的KPC扩增出相应的产物，在胶体金免疫侧流层析试纸条上进行杂交，出现在相应检测线位置，与预期结果一致。双标记的NDM引物扩增出相应产物，在胶体金免疫侧流层析试纸条上进行杂交，出现在相应检测线位置，结果与预期相符。结果表明所设计的引物具有特异性，可用于碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的检测。

(2)多重PCR-LF验证双标记引物的特异性

取KPC阳性标准品、NDM阳性标准品、KPC细菌培养物DNA、NDM的细菌培养物DNA，分别取5μL为DNA模板，利用上述已建立的双标记的多重PCR验证体系的特异性，结果如图3；检测体系为：Taq DNA聚合酶15μL，上下游引物(10μM)均为0.3μL，DNA模板为5μL，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，60℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。将PCR产物进行胶体金免疫侧流层析试纸条检测。多重PCR的双标记的为引物5’端标记生物素的KPC-2F(SEQ ID NO.1)/3’端标记地高辛的KPC-2R(SEQ ID NO.2)和5’端标记生物素的NDM-9F(SEQ ID NO.3)/3’端标记FAM的NDM-9R(SEQ ID NO.4)，PCR扩增产物在胶体金免疫侧流层析试纸条上进行杂交，相应检测线呈阳性，结果与预期相符。结果表明所设计的体系具有特异性，可用于碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的检测。

取标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、标准菌株铜绿假单胞菌(ATCC27853)、标准菌株粪肠球菌(ATCC29212)、标准菌株肺炎克雷伯菌(ATCCBAA1705)，分别5μL为DNA模板，利用上述已建立的双标记的多重PCR验证体系的特异性，结果如图12；检测体系为：Taq DNA聚合酶15μL，上下游引物(10μM)均为0.3μL，DNA模板为5μL，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，60℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。将PCR产物进行胶体金免疫侧流层析试纸条检测。多重PCR的双标记的为引物5’端标记生物素的KPC-2F(SEQ ID NO.1)/3’端标记地高辛的KPC-2R(SEQ ID NO.2)和5’端标记生物素的NDM-9F(SEQ ID NO.3)/3’端标记FAM的NDM-9R(SEQ ID NO.4)，PCR扩增产物在胶体金免疫侧流层析试纸条上进行杂交，相应检测线呈阳性，结果(图4)与预期相符。结果表明所设计的体系具有特异性，可用于碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的检测。

(3)多重PCR-LF验证体系的灵敏度

将携带KPC基因和NDM基因的菌液培养物，进行10倍梯度稀释为7个梯度：1.携带KPC基因的菌液7.6×10⁷copies/reaction、携带NDM基因的菌液5×10⁷copies/reaction；2.KPC基因的菌液7.6×10⁶copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁶copies/reaction；3.KPC基因的菌液7.6×10⁵copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁵copies/reaction；4.KPC基因的菌液7.6×10⁴copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁴copies/reaction；5.KPC基因的菌液7.6×10³copies/reaction、NDM基因的菌液5×10³copies/reaction；6.KPC基因的菌液7.6×10²copies/reaction、NDM基因的菌液5×10²copies/reaction；7.KPC基因的菌液7.6×10¹copies/reaction、NDM基因的菌液5×10¹copies/reaction，8.KPC基因的菌液7.6×10⁰copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁰copies/reaction，每个梯度各取5μL作为模板，利用上述建立的多重PCR-LF扩增体系进行检测。结果如图13。检测体系为：Taq DNA聚合酶15μL，上下游引物(10μM)均为0.3μL，DNA模板为5μL，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，60℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。将PCR产物进行胶体金免疫侧流层析试纸条检测。多重PCR的双标记的为引物5’端标记生物素的KPC-2F(SEQ ID NO.1)/3’端标记地高辛的KPC-2R(SEQ ID NO.2)和5’端标记生物素的NDM-9F(SEQ ID NO.3)/3’端标记FAM的NDM-9R(SEQ ID NO.4)，结果如图5携带KPC基因的菌液检测灵敏度为7.6×10²copies/reaction，携带NDM基因的菌液检测灵敏度为5×10²copies/reaction。

为了验证检测体系可以直接检测临床样本，人工模拟临床样本，用临床收集的不含待测基因的痰液样本稀释上述KPC基因和NDM基因的细菌培养物，进行10倍梯度稀释为7个梯度：1.携带KPC基因的菌液7.6×10⁷copies/reaction、携带NDM基因的菌液5×10⁷copies/reaction；2.KPC基因的菌液7.6×10⁶copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁶copies/reaction；3.KPC基因的菌液7.6×10⁵copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁵copies/reaction；4.KPC基因的菌液7.6×10⁴copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁴copies/reaction；5.KPC基因的菌液7.6×10³copies/reaction、NDM基因的菌液5×10³copies/reaction；6.KPC基因的菌液7.6×10²copies/reaction、NDM基因的菌液5×10²copies/reaction；7.KPC基因的菌液7.6×10¹copies/reaction、NDM基因的菌液5×10¹copies/reaction，8.KPC基因的菌液7.6×10⁰copies/reaction、NDM基因的菌液5×10⁰copies/reaction，采用微量样品基因组DNA提取试剂盒(北京天根，Code No.:DP316)提取模拟临床样本的DNA，每个梯度各取5μL作为模板，利用上述建立的多重PCR-LF扩增体系进行检测。结果如图6。检测体系为：Taq DNA聚合酶15μL，上下游引物(10μM)均为0.3μL，DNA模板为5μL，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，60℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。将PCR产物进行胶体金免疫侧流层析试纸条检测。多重PCR的双标记的为引物5’端标记生物素的KPC-2F(SEQ ID NO.1)/3’端标记地高辛的KPC-2R(SEQ ID NO.2)和5’端标记生物素的NDM-9F(SEQ ID NO.3)/3’端标记FAM的NDM-9R(SEQ ID NO.4)，结果如图6携带KPC基因的菌液检测灵敏度为7.6×10¹copies/reaction，携带NDM基因的菌液检测灵敏度为5×10¹copies/reaction，由于模拟样本的模板是经过提纯浓缩的的DNA，其灵敏度比直接使用同样浓度菌液NDA模板更好。

8.临床样本检测应用

采集2017年8月至2017年9月间南京总医院住院病人41例临床标本，提取细菌DNA，利用上述建立的多重PCR-LF扩增体系进行检测，1-24例样本结果如图7和25-41例样本结果图8。检测体系为：Taq DNA聚合酶15μL，上下游引物(10μM)均为0.3μL，DNA模板为5μL，无菌去离子水补足至30μL。反应条件：95℃5min预热，30个循环包括94℃40s变性，60℃40s，72℃1min，最后72℃延伸5min。将PCR产物进行胶体金免疫侧流层析试纸条检测。多重PCR的双标记的为引物5’端标记生物素的KPC-2F(SEQ ID NO.1)/3’端标记地高辛的KPC-2R(SEQ IDNO.2)和5’端标记生物素的NDM-9F(SEQ ID NO.3)/3’端标记FAM的NDM-9R(SEQ ID NO.4)，PCR扩增产物在胶体金免疫侧流层析试纸条上进行杂交，相应检测线呈阳性，结果与预期相符。结果表明该方法能够特异、灵敏、准确、及时的检测出携带碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的标本。

序列表

<110> 中国人民解放军南京军区南京总医院

<120> 一种PCR-LF技术检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的引物组合物及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacaacaggc atgacggtgg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtccagacgg aacgtggtat c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggcagcaca cttcctatct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgacaacgca ttggcataag 20

<210> 5

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagacaaaac cggaacctgc ggagtgtatg gcacggcaaa tgactatgcc gtcgtctggc 60

ccactgggcg cgcacctatt gtgttggccg tctacacccg ggcgcctaac aaggatgaca 120

agcacagcga ggccgtcatc 140

<210> 6

<211> 270

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtctggcag cacacttcct atctcgacat gccgggtttc ggggcagtcg cttccaacgg 60

tttgatcgtc agggatggcg gccgcgtgct ggtggtcgat accgcctgga ccgatgacca 120

gaccgcccag atcctcaact ggatcaagca ggagatcaac ctgccggtcg cgctggcggt 180

ggtgactcac gcgcatcagg acaagatggg cggtatggac gcgctgcatg cggcggggat 240

tgcgacttat gccaatgcgt tgtcgaacca 270

<210> 7

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcgccgtct agttctgctg tcttgtctct catggccgct ggctggcttt tctgccaccg 60

cgctgaccaa cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga acaggacttt ggcggctcca 120

tcggtgtgta cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt aagttaccgc gctgaggagc 180

gcttcccact gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc cgctgtgctg gctcgcagcc 240

agcagcaggc cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg caaaaatgcg ctggttccgt 300

ggtcacccat ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac ggtggcggag ctgtccgcgg 360

ccgccgtgca atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt gctgaaggag ttgggcggcc 420

cggccgggct gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac cacgttccgt ctggaccgct 480

gggagctgga gctgaactcc gccatcccag gcgatgcgcg cgatacctca tcgccgcgcg 540

ccgtgacgga aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc actggctgcg ccgcagcggc 600

agcagtttgt tgattggcta aagggaaaca cgacca 636

<210> 8

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcggaatgg ctcatcacga tcatgctggc cttggggaac gccgcaccaa acgcgcgcgc 60

tgacgcggcg tagtgctcag tgtcggcatc accgagattg ccgagcgact tggccttgct 120

gtccttgatc aggcagccac caaaagcgat gtcggtgccg tcgatcccaa cggtgatatt 180

gtcactggtg tggccggggc cggggtaaaa taccttgagc gggccaaagt tgggcgcggt 240

tgctggttcg acccagccat tggcggcgaa agtcaggctg tgttgcgccg caaccatccc 300

ctcttgcggg gcaagctggt tcgacaacgc attggcataa gtcgcaatcc ccgccgcatg 360

cagcgcgtcc ataccgccca tcttgtcctg atgcgcgtga gtcaccaccg ccagcgcgac 420

cggcaggttg atctcctgct tgatccagtc gaggatctgg gcggtctggt catcggtcca 480

ggcggtatcg accaccagca cgcggccgcc atccctgacg atcaaaccgt tggaagcgac 540

tgccccgaaa cccggcatgt cgagatagga agtgtgctgc cagacattcg gtgctagctg 600

gcggaaaacc agatcgccaa acca 624

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtatcgccgt ctagttctgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtcgtgttt ccctttagcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtttggcga tctggttttc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggaatggct catcacgatc 20

Claims

1.一种用于多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物包含：用于检测KPC基因的上游引物如SEQ IDNo.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；用于检测NDM基因的上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物如SEQ ID No.4所示；其中用于检测KPC基因的上游引物5’端标记生物素，下游引物3’端标记地高辛；用于检测NDM基因的上游引物5’端标记生物素，下游引物3’端标记FAM。

2.一种用于多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术检测碳青霉烯类耐药基因的A类碳青霉烯酶基因KPC和B类碳青霉烯酶基因NDM的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包含权利要求1所述的引物组合物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中引物浓度均为0.1 μM。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含阳性标准品、阴性标准品、TaqDNA聚合酶、酶扩增八连反应管；所述的阳性标准品由KPC标准品和NDM标准品组成。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的KPC标准品或NDM标准品是以KPC基因或NDM基因为目的基因，通过与pUCm T载体连接转化进行克隆，用于多重PCR的阳性标准品。

6.权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的阴性标准品为无碳青霉烯类耐药基因的核酸提取液的无菌去离子水。

7.一种非疾病诊断目的的用于检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取待测样本DNA；

（2）利用权利要求1所述的引物组合物，进行多重PCR扩增；30 μL扩增体系中 Taq DNA聚合酶15μL、上、下游引物各0.3μL、阳性标准品5μL、阴性标准品5μL、待测菌液DNA 5μL、无菌去离子水补足至30μL；反应条件：95℃ 5 min预热，30个循环包括94℃ 40s变性，60℃40s，72℃ 1min，最后72 ℃延伸5 min；

（3）胶体金免疫侧流层析检测，并读取结果。

8.权利要求7所述的非疾病诊断目的的用于检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术方法，其特征在于，PCR多重扩增产物采用胶体金免疫侧流层析试纸条进行检测，结果若同时出现质控线、KPC检测线、NDM条检测线均为红色，则待测样品中含有KPC基因和NDM基因；结果若出现质控线、KPC检测线为红色，则待测样品中含有KPC基因；若结果质控线、NDM检测线为红色，则待测样品中含有NDM基因；若结果只有质控线为红色，则待测样品结果为阴性。