CN114196779A - 基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明基于多重PCR，结合高通量的Nanopore纳米孔测序技术，可检测临床样本中可能存在的所有细菌、真菌。本发明提供一种基于靶向序列的病原微生物的检测方法，通过临床样本核酸提取、鉴定序列靶向扩增、产物末端修复、连接标签、连接测序接头、测序与数据分析等步骤，在6‑8小时即可完成病原微生物的检测。配套的试剂盒包括相应步骤所需试剂。该方法相比较现有技术，无需去除宿主基因组，核酸提取简单，病原覆盖全面，灵敏度高，检测通量高，检测速度快，鉴定更准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒。
背景技术
近年来，造成人类感染的病原微生物日益复杂，种类增多，抗菌药物滥用致使细菌耐药，病原微生物已成为全球关注的焦点。在我国每年感染性疾病患者中，超过1亿的患者需要使用病原检测手段检查进行辅助治疗，其中危重感染病人人数超千万。针对这些感染类型较为复杂的危重感染病例，目前常规检测手段难以满足治疗需求。除此之外，新发现的病原微生物，以及耐药性不断增强的病原的出现，使得临床医生的经验性治疗会出现无效的现象。因此，快速明确病原菌是有效控制感染的基础。
传统的病原微生物鉴定技术分为培养和非培养两类，临床公认的“金标准”是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高，并且不是每种病原体都可以培养。不依赖培养的方法比如涂片镜检、抗体抗原免疫等，在采样当天即可报告结果。这些方法的时效性强，但在敏感性和特异性上存在较明显的劣势，而且传统的微生物鉴定方法对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。
基于宏基因组的病原微生物检测技术(mNGS)是一种不依赖传统的微生物培养，也无需特异性扩增，直接对临床样本中的核酸进行无差别、无选择性的高通量测序，然后与已知的微生物序列数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)。相比传统检验方法，mNGS拥有更高的敏感性及更快的检验速度，但在实际应用中，还有一些难以解决的问题，这也限制了其广泛应用：1)无法准确区分检出微生物是定制菌、背景菌、致病菌。2)mNGS技术对于胞内菌、真菌等核酸提取效率低的微生物检测敏感性较低。同时对于低浓度的胞内感染菌如结核分枝杆菌、军团菌的检测敏感性偏低。3)高宿主背景：一般样本类型如血液、肺泡灌洗液、痰液等，宿主基因组污染比例通常在80％以上，这导致检测到的微生物序列非常少，绝大部分数据都无法有效利用。4)标准难以统一：从测序结果的可靠程度来讲，不同的测序公司，对于结果数据采用不同的报告方式，如深度、覆盖度、丰度、置信度，各不相同，尚无统一标准。5)高成本：目前mNGS检测终端收费想多昂贵，如非危重症患者，一般难以接受检测。
纳米孔测序(Nanopore Targeted Sequencing)方法是一种代表性的基因检测技术，该方法不依赖于传统的微生物培养，能够快速、客观地检测出临床样本中的疑似致病微生物(包括细菌、真菌和病毒)。该检测项目基于第三代单分子测序(Nanopore)平台，是新一代单分子实时测序技术，其以单分子DNA(RNA)通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。其主要特点是读长更长，平均读长可达20kb,最长可达到Mb级别；结合高效的基因组核酸提取和建库方式，测序结果经过生物信息学处理分析后与专业医学微生物数据库进行比对分析，可以获得样本中所有微生物的种属信息以及所携带的耐药和毒力基因信息。该方法检测范围广，可高效检测静脉血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液及其他体液、组织等多种临床样本中的致病微生物，适用于不明原因发热、疑难感染和急危重症的诊断。
纳米孔靶向测序的测序速度快，在2个小时的测序及可以得到满足病原微生物分析的数据，同时通过靶向扩增的方式，可以无需进行人源基因组DNA的去除，就可以达到对病原微生物的富集。同时如果适配本发明开发快速建库技术，即可以在4-6个小时获得检测结果，非常适用于急危重症的诊断。
发明内容
对于病原微生物的检测，目前通用的方法是采用二代测序平台进行宏基因组的测序，该平台存在测序时间长、测序读长短，测序结果存在大量人源基因组DNA污染、测序数据量高且测序结果较难解读的问题。
针对目前的技术瓶颈，本发明的目的在于开发基于靶向测序的病原微生物检测方法以及配套试剂盒，在6-8小时即可完成病原微生物的检测，可以在病原微生物的检测应用中实现快速即时检测。
为达到上述技术目的，本发明通过对检测靶标采用通用性鉴定引物，可以实现对所有细菌及真菌的检测。具体技术方案如下：
基于靶向测序的病原微生物检测方法，包括以下步骤：
1)对病原微生物感染的样本中的DNA和RNA分别进行提取，混合所得DNA和RNA得到总核酸，作为待测样本；
或者，直接提取微生物感染的样本中的总核酸作为待测样本；
本步骤的原理是靶向富集，可以特异性的提高测序数据中病原微生物的比例，所以在提取时无需进行人源基因组DNA的去除。提取方法可以是同时进行DNA和RNA提取的方法，优选使用明德自动化提取仪的磁珠法进行核酸的提取。提取方法参照试剂盒说明书和仪器使用说明书，提取时间约0.5h。
2)鉴定序列靶向扩增：以总核酸为模板，针对细菌设计的特异性引物，和/或针对真菌设计的特异性引物进行PCR扩增；
本方法针对细菌采用了两组特异性引物，针对真菌采用一组特异性引物，即提高了扩增效率，也使得两端序列可以相互验证，使得鉴定结果更为准确。如图1本发明的原理图所示，图中引物组1为真菌特异性引物，引物组2为细菌特异性引物。扩增体系如下：
表1鉴定序列靶向扩增体系
| 组分 | 体积 |
| 多重扩增酶混合液(2X) | 7.5μl |
| 引物组(2μM) | 2μl |
| dd H2O | 1.75μl |
| 样本核酸 | 3.75μl |
| 总体积 | 15μl |
将配制好的反应体系混匀后，瞬时离心，在PCR仪上进行扩增反应：
表2鉴定序列靶向扩增反应条件
所述特异性引物如下：
表3鉴定序列靶向扩增的特异性引物
3)产物末端修复：用磁珠纯化步骤2)的PCR产物，纯化后进行Qubit浓度测定，取20-50ng扩增产物进行末端修复，反应后磁珠纯化洗脱；
使用常规的纯化磁珠进行0.8X纯化，26μl dd H2O洗脱。具体流程参考纯化磁珠的使用说明书，优选使用诺维赞或翊圣的纯化磁珠。纯化完成后进行Qubit浓度测定。
取20-50ng扩增产物进行末端修复操作，体系为：末端修复缓冲液3.5μl，末端修复酶混液1.5μl，补水至总体积30μl。反应条件为：20℃10分钟；65℃10分钟。反应完成后30μl磁珠纯化，11μl dd H2O洗脱。
4)连接标签：用步骤3)末端修复后得到的洗脱液，加入Barcode进行标签连接；连接体系为：末端后洗脱液10μ，Barcode 2μl，连接反应混合液12μl。反应条件为：25℃反应10min。反应完成后24μl磁珠纯化,10μl dd H2O洗脱。Qubit浓度测定。
5)测序接头的连接：用磁珠纯化步骤4)中的反应产物，纯化完成后进行Qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本等量混合，连接反应后得到测序文库；
混合后的总量在50-150ng即可进行后续连接反应。体系如下：
表4测序接头连接反应体系
| 组分 | 体积 |
| 待测序样本(50-150ng) | 32μl |
| 连接酶缓冲液(5X) | 10μl |
| 测序接头 | 3μl |
| 连接酶 | 5μl |
| 总体积 | 50μl |
将配制好的反应体系混匀后，瞬时离心，20℃连接反应10min，反应结束后即连接上测序接头。连接产物按照Nanopore官方的测序流程进行上机反应。连接与上机反应耗时约0.5h。
6)测序与数据分析：测序产生的数据在病原微生物分析软件上进行同步分析，测序时间达到1～2h即可以检出主要的病原微生物，具体分析流程参考明德病原微生物分析软件使用说明书。
具体的，上述基于靶向测序的病原微生物检测方法中的样本为血液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、口腔拭子或脓液。
所述样本提取核酸总量不少于50pg，无需去除人源基因组，使用常规的磁珠法等自动化仪器提取核酸即可。
本发明还提供一种利用上述方法检测病原微生物的试剂盒，具体包括如下几部分试剂：
1)鉴定序列靶向扩增试剂，包括多重扩增酶混合液和由鉴定细菌的两组引物和鉴定真菌的一组引物构成的特异性引物组，具体如下：
细菌的两组引物为：
Primer1F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，
Primer1R：GACTACCAGGGTATCTAATC；
Primer2F：GGATTAGATACCCTGGTA，
Primer2R：GGTTACCTTGTTACGACTT；
真菌的一组引物为：
Primer 3F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，
Primer 3R：TCCTCCGCTTATTGATATGC；
2)产物末端修复试剂：末端修复缓冲液和末端修复酶混液；
3)连接标签扩增试剂，包括Barcode引物和连接反应混合液；
4)连接测序接头试剂，包括连接酶缓冲液(5X)，测序接头和连接酶。
本发明基于多重PCR，结合高通量的nanopore纳米孔测序技术，可检测临床样本中可能存在的所有细菌、真菌，相对于现有技术，有效效果表现在以下几个方面：
1)样本提取简单：提取核酸时无需去除宿主基因组，使用常规的磁珠法等自动化仪器提取的DNA即可以满足后续建库测序的要求；
2)病原覆盖全面：本发明采用通用引物组，理论上可检测所有的细菌真菌感染；
3)灵敏度高：本发明采用的引物组、试剂盒和方法，可检测样本中的存在的微量核酸，检测下限最低可达4个cfu的提取；
4)检测通量高：一次可实现大量样本的检测；
5)检测速度快：采用靶向测序方法，单样本所需的数据量较低，同时Nanopore纳米孔测序速度快，整个检测流程可缩短至8h。
6)鉴定更准确：纳米孔测序技术的长读长能完整覆盖扩增序列，无需组装，可以更为精准的鉴定出病原微生物的种属。
附图说明
图1为本发明的原理图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1本发明方法标准品检测限试验
对于临床应用，检测限时判定实验效果的关键指标，目前已有的流程在检出限上需要提取时微生物的数目达到20个cfu以上才能正常检出，对于标准的微生物菌株，进行以下的20、10、4个cfu数的检测测试，具体检测结果如下：
表5标准品检测限实验结果
微生物标准品是稀释至100cfu/mL的微生物菌液，包括白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、光滑念珠菌，在进行核酸提取时分别取200uL、100uL、40uL的标准菌液进行提取，提取后按照本发明的方法进行病原微生物的检测，均可正常构建文库并测序。测试结果表明，在4个cfu下进行提取检测，100％可以正常检出，表明流程具有极低的检出性能。
实施例2临床血液样品检测
取10例临床血培有明确病原微生物的全血样本，取200uL全血提取核酸后，按照本发明的流程进行建库测序，同时采用其他引物组进行对比测试，对比引物组为16s引物组全长(Primer 1F，Primer 2R)。样本均正常建库且获得测序数据，具体的检测结果如下：
表6不同临床血液样品检测的结果
实施例3临床肺泡灌洗液样本检测
取38例临床肺泡灌洗液样本，取200uL样本提取核酸后，按照本发明的流程进行建库测序，样本均正常建库且获得测序数据，具体的检测结果如下：
表7不同临床肺泡灌洗液样品的检测结果
靶向测序检测结果与常规培养结果一致性达71％(27/38)，部分结果一致性21％(8/38)，仅有3例结果完全不一致，说明本检测流程在面对更复杂的呼吸道样本时仍具有可靠的真菌、细菌检测能力。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对病原微生物感染的样本中的DNA和RNA分别进行提取，混合所得DNA和RNA得到总核酸，作为待测样本；
或者，直接提取微生物感染的样本中的总核酸作为待测样本；
2)鉴定序列靶向扩增：以总核酸为模板，针对细菌设计的特异性引物，和/或针对真菌设计的特异性引物进行PCR扩增；
3)产物末端修复：用磁珠纯化步骤2)的PCR产物，纯化后进行Qubit浓度测定，取20-50ng扩增产物进行末端修复，反应后磁珠纯化洗脱；
4)连接标签：用步骤3)末端修复后得到的洗脱液，加入Barcode进行标签连接；
5)测序接头的连接：用磁珠纯化步骤4)中的反应产物，纯化完成后进行Qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本等量混合，连接反应后得到测序文库；
6)测序与数据分析：测序产生的数据在病原微生物分析软件上进行同步分析，测序时间达到1～2h即可以检出主要的病原微生物。
2.根据权利要求1所述基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于：所述样本为血液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、口腔拭子、脓液。
3.根据权利要求1所述基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于：所述样本提取核酸总量不少于50pg。
4.根据权利要求1所述基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤1)使用常规的磁珠法等自动化仪器提取核酸即可。
5.根据权利要求1所述基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤1)中的总核酸无需去除人源基因组。
6.根据权利要求1所述基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤2)中鉴定序列靶向扩增的配置体系为：提取核酸3.75μl，加入多重扩增酶混合液(2X)7.5μl，2μl引物组(2μM)以及1.75μl ddH2O进行扩增；PCR扩增条件：95℃2min，35个循环(94℃20s，53℃30s，72℃55s)，72℃补充延伸5min。
7.根据权利要求1所述基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤3)中产物末端修复的配置体系为：取20-50ng扩增产物，加入末端修复缓冲液3.5μl，末端修复酶混液1.5μl，补水至总体积30μl；反应条件为：20℃10分钟；65℃10分钟；反应完成后30μl磁珠纯化，11μl dd H2O洗脱。
8.根据权利要求1所述基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤4)的连接体系为：末端后洗脱液10μl，Barcode 2μl，连接反应混合液12μl；反应条件为：25℃反应10min；反应完成后24μl磁珠纯化，10μl dd H2O洗脱，Qubit浓度测定。
9.根据权利要求1所述基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤5)中连接测序接头的反应体系为：32μl待测序样本(50-150ng)，10μl连接酶缓冲液(5X)，3μl测序接头，5μl连接酶；20℃反应10min。
10.一种利用如权利要求1～9任一项所述的方法检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)鉴定序列靶向扩增试剂，包括多重扩增酶混合液和由鉴定细菌的两组引物和鉴定真菌的一组引物构成的特异性引物组，具体如下：
细菌的两组引物为：
Primer1F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，
Primer1R：GACTACCAGGGTATCTAATC；
Primer2F：GGATTAGATACCCTGGTA，
Primer2R：GGTTACCTTGTTACGACTT；
真菌的一组引物为：
Primer 3F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，
Primer 3R：TCCTCCGCTTATTGATATGC；
2)产物末端修复试剂：末端修复缓冲液和末端修复酶混液；
3)连接标签扩增试剂，包括Barcode引物和连接反应混合液；
4)连接测序接头试剂，包括连接酶缓冲液(5X)，测序接头和连接酶。
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