CN112831604A - 基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，属于微生物检测技术领域。所述病原微生物检测引物组包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n‑1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56。本发明还公开了包含所述引物组的病原微生物检测试剂盒，以及利用引物组或试剂盒对病原微生物检测的多重PCR扩增方法。利用本发明检测病原微生物，具有病原覆盖全面、灵敏度高、检测通量高、成本低等优势，能够辅助临床精准识别常见病原体，涵盖细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒、寄生虫、支原体衣原体等，具有重要的临床应用价值。

Description

基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体地，涉及基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法。
背景技术
我国目前感染性疾病诊断水平亟待提升，2017年统计数据显示，我国传染性疾病发病率和死亡率分别为509.54(1/10万)和1.43(1/10万)，依然保持上升趋势。相对于全球而言，我国的感染性疾病诊疗水平偏低，HIV、TB患病率和死亡率分别为3.6(1/10万)和0.76(1/10万)，与发达国家差距较大。在我国每年感染性疾病患者中，超过3亿的患者需使用病原检测手段检查进一步辅助诊断，其中危重感染病人人数超1000万人，比如重症肺炎发病人数每年约400万，脓毒血症约560万，新发脑膜炎约85万。针对这些感染类型较为复杂的危重感染病例，目前常规检测手段的无法满足治疗需求。除此之外，新发现病原微生物，以及耐药性不断增强甚至出现多重耐药的病菌涌现，使得临床医生的经验性治疗或常规治疗时常会出现无效的现象。因此，快速明确病原体是有效控制感染的基础。如SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒、寨卡病毒及埃博拉病毒感染等、这类疾病的传染性极强，可能会造成世界性大流行，因此对此类病原体快速、准确地检测为新型诊断技术创造了巨大的市场。据统计，2017 年全球微生物诊断行业市场规模为161.6亿美元，增速为4.75％，我国仅为14亿美元左右，增速低于2％，未来发展空间巨大。
传统的病原微生物鉴定技术主要分为两类：基于培养的方法例如形态学观察、细胞生理生化特征、细菌培养分型、基因芯片、自动化微生物分析系统等；基于特异引物/探针/抗体的方法例如抗原抗体反应、PCR反应检测以及各种特异性的病原微生物快速检测系统等。这些技术在日常病原微生物确证中发挥了重要作用，但也存在一定的不足：前者需要依赖培养、周期长、鉴定精度低；后者需要一定的微生物序列先验知识、无法实现高通量检测等。
基于宏基因组二代测序的病原微生物检测(mNGS)，是一种不依赖培养，借助二代测序平台快速测序直接从环境/临床样品中提取全部微生物的核酸序列，进一步与各个物种的基因组序列对比，从而得知样品中微生物的种类和比例的高通量测序方法，可广泛分析临床样本微生物组(细菌、真菌、病毒)。相比传统培养方法，mNGS拥有更高敏感性以及更快的检测速度，但是在实际应用中，还有一些难以解决的问题，这也限制其广泛应用：
1.无法准确区分检出微生物是定植菌、背景菌、致病菌；
2.mNGS技术对于胞内菌、真菌两类微生物检测敏感性较低：由于测序成本的限制，mNGS需尽量排除人源细胞的干扰。因此针对胞内感染菌如结核分枝杆菌、军团菌等，由于其在体液内密度较低而导至检测敏感性偏低；同时mNGS对于具有较厚细胞壁的病原体及真菌核酸提取效率较低，导至检出率和敏感性较低。
3.对RNA病毒检测难度大：RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测还存在一定的困难。
4.标准难以统一：从测序结果的可靠程度来讲，不同的测序公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度、覆盖度、丰度、估测浓度、置信度，各有千秋，尚无统一标准。
5.高宿主背景：一般样本类型如血液、肺泡灌洗液、痰液、胸腹水等，宿主基因组污染比例一般在80％以上，这就导致测到的微生物序列非常少，很大一部分数据都无法有效利用。
6.高成本：目前mNGS单项检测(DNA或RNA)，终端收费相对较昂贵，如非危难、重症患者，一般难以接收检测。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和 SEQ IDNo.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56，具体地，所述病原微生物检测引物组包括：
由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成的第1引物对，靶标病原为副百日咳博德特氏菌；
由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4组成的第2引物对，靶标病原为百日咳博德特氏菌；
由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6组成的第3引物对，靶标病原为回归热螺旋体；
由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8组成的第4引物对，靶标病原为类鼻疽伯克霍尔德菌；
由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10组成的第5引物对，靶标病原为肺炎衣原体；
由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12组成的第6引物对，靶标病原为鹦鹉热衣原体；
由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14组成的第7引物对，靶标病原为沙眼衣原体；
由SEQ ID No.15和SEQ ID No.16组成的第8引物对，靶标病原为艰难梭菌；
由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18组成的第9引物对，靶标病原为白喉棒状杆菌；
由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20组成的第10引物对，靶标病原为具核梭杆菌；
由SEQ ID No.21和SEQ ID No.22组成的第11引物对，靶标病原为流感嗜血杆菌；
由SEQ ID No.23和SEQ ID No.24组成的第12引物对，靶标病原为幽门螺杆菌；
由SEQ ID No.25和SEQ ID No.26组成的第13引物对，靶标病原为肺炎克雷伯菌；
由SEQ ID No.27和SEQ ID No.28组成的第14引物对，靶标病原为嗜肺军团菌；
由SEQ ID No.29和SEQ ID No.30组成的第15引物对，靶标病原为单核球增多性李斯特菌；
由SEQ ID No.31和SEQ ID No.32组成的第16引物对，靶标病原为脓肿分枝杆菌；
由SEQ ID No.33和SEQ ID No.34组成的第17引物对，靶标病原为鸟型分支杆菌；
由SEQ ID No.35和SEQ ID No.36组成的第18引物对，靶标病原为牛型结核菌；
由SEQ ID No.37和SEQ ID No.38组成的第19引物对，靶标病原为结核分枝杆菌；
由SEQ ID No.39和SEQ ID No.40组成的第20引物对，靶标病原为肺炎支原体；
由SEQ ID No.41和SEQ ID No.42组成的第21引物对，靶标病原为淋病奈瑟氏菌；
由SEQ ID No.43和SEQ ID No.44组成的第22引物对，靶标病原为恙虫病东方体；
由SEQ ID No.45和SEQ ID No.46组成的第23引物对，靶标病原为铜绿假单胞菌；
由SEQ ID No.47和SEQ ID No.48组成的第24引物对，靶标病原为酿脓葡萄球菌；
由SEQ ID No.49和SEQ ID No.50组成的第25引物对，靶标病原为嗜麦芽窄食单胞菌；
由SEQ ID No.51和SEQ ID No.52组成的第26引物对，靶标病原为酿脓链球菌；
由SEQ ID No.53和SEQ ID No.54组成的第27引物对，靶标病原为肺炎链球菌；
由SEQ ID No.55和SEQ ID No.56组成的第28引物对，靶标病原为微小脲原体；
由SEQ ID No.57和SEQ ID No.58组成的第29引物对，靶标病原为副溶血性弧菌；
由SEQ ID No.59和SEQ ID No.60组成的第30引物对，靶标病原为创伤弧菌；
由SEQ ID No.61和SEQ ID No.62组成的第31引物对，靶标病原为烟曲霉；
由SEQ ID No.63和SEQ ID No.64组成的第32引物对，靶标病原为米曲霉；
由SEQ ID No.65和SEQ ID No.66组成的第33引物对，靶标病原为白色念珠菌；
由SEQ ID No.67和SEQ ID No.68组成的第34引物对，靶标病原为热带念珠菌；
由SEQ ID No.69和SEQ ID No.70组成的第35引物对，靶标病原为近平滑念珠菌；
由SEQ ID No.71和SEQ ID No.72组成的第36引物对，靶标病原为新型隐球菌；
由SEQ ID No.73和SEQ ID No.74组成的第37引物对，靶标病原为格特隐球菌；
由SEQ ID No.75和SEQ ID No.76组成的第38引物对，靶标病原为耶氏肺孢子菌；
由SEQ ID No.77和SEQ ID No.78组成的第39引物对，靶标病原为马尔尼菲蓝状菌；
由SEQ ID No.79和SEQ ID No.80组成的第40引物对，靶标病原为荚膜组织胞浆菌；
由SEQ ID No.81和SEQ ID No.82组成的第41引物对，靶标病原为球形马拉色菌；
由SEQ ID No.83和SEQ ID No.84组成的第42引物对，靶标病原为微孢子菌；
由SEQ ID No.85和SEQ ID No.86组成的第43引物对，靶标病原为裴氏着色真菌；
由SEQ ID No.87和SEQ ID No.88组成的第44引物对，靶标病原为串珠镰刀菌；
由SEQ ID No.89和SEQ ID No.90组成的第45引物对，靶标病原为人博卡病毒；
由SEQ ID No.91和SEQ ID No.92组成的第46引物对，靶标病原为人细小病毒；
由SEQ ID No.93和SEQ ID No.94组成的第47引物对，靶标病原为EB病毒；
由SEQ ID No.95和SEQ ID No.96组成的第48引物对，靶标病原为巨细胞病毒；
由SEQ ID No.97和SEQ ID No.98组成的第49引物对，靶标病原为轮状病毒；
由SEQ ID No.99和SEQ ID No.100组成的第50引物对，靶标病原为单纯疱疹病毒；
由SEQ ID No.101和SEQ ID No.102组成的第51引物对，靶标病原为人腺病毒；
由SEQ ID No.103和SEQ ID No.104组成的第52引物对，靶标病原为人多瘤病毒；
由SEQ ID No.105和SEQ ID No.106组成的第53引物对，靶标病原为乙型肝炎病毒；
由SEQ ID No.107和SEQ ID No.108组成的第54引物对，靶标病原为细环病毒；
由SEQ ID No.109和SEQ ID No.110组成的第55引物对，靶标病原为水痘-带状疱疹病毒；
由SEQ ID No.111和SEQ ID No.112组成的第56引物对，靶标病原为传染性软疣病毒。
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID No.(2n-1)所示的每条正向扩增引物的5'端连接有SEQ ID No.113所示的正向通用引物，SEQ ID No.2n所示的每条反向扩增引物的5'端连接有SEQ ID No.114所示的反向通用引物，n＝1～56。
在本发明的一些实施方案中，所述病原微生物检测引物组还包括接头序列引物对，包括SEQ ID No.116所示的正向接头引物和SEQ ID No.117-123任一所示的反向接头引物。
本发明第二方面提供一种基于靶向测序的病原微生物检测试剂盒，包括本发明第一方面任一所述的病原微生物检测引物组。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶。
在本发明中，所述PCR缓冲液可以是任意能够完成PCR扩增的缓冲液，包括 dNTPs。
在本发明中，所述DNA聚合酶可以是任意能够完成PCR扩增的DNA聚合酶。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括样本总DNA提取试剂、PCR扩增产物纯化试剂。
在本发明中，所述样本总DNA提取试剂可以是任意能够提取样本总DNA的试剂、试剂组合或商品化的试剂盒。例如，可以是利用酶解及化学试剂裂解的试剂、试剂组合或商品化的试剂盒，通过酶解及化学裂解的方法，消化样本中的蛋白质，裂解细胞，从而释放出核酸。其中，所述酶包括但不限于蛋白酶K，所述化学试剂包括但不限于异硫氰酸胍。
在本发明中，所述PCR产物纯化试剂可以是任意能够对DNA片段进行纯化的试剂、试剂组合或商品化的试剂盒。在本发明的一些实施方案中，所述PCR产物纯化试剂为磁珠纯化试剂。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括对照DNA。在本发明的一些具体实施方案中，所述对照DNA为确定分子总数的人工合成DNA片段，其分子总数为 104-105个/ml，其序列为无任何物种同源性。在本发明的一些优选实施方案中，所述对照DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.115所示。
本发明的第三方面提供一种基于靶向测序的病原微生物检测方法，包括以下步骤：
S1，获得待测样本的总DNA；
S2，以步骤S1获得的总DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组进行多重 PCR扩增；
S3，以步骤S2获得的多重PCR扩增产物以及对照DNA作为模板，利用权利要求3所述的接头序列引物对进行添加接头PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
S4，对步骤S3获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
S5，将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S6，利用下述公式计算病原微生物近似浓度C：
C＝N×P/2M×102/mL
其中，N为对照DNA浓度，M为对照DNA reads数，P为准确比对上特定病原微生物靶标的reads数。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S1后，步骤S2前，进一步包括对获得的待测样本的总DNA进行质控检测，当获得的总DNA的OD260/280在1.7-2.0之间， OD260/230在1.8-2.2之间；并且总DNA浓度大于1ng/μL，总量大于100ng时，质控合格。
在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，所述多重PCR扩增的体系为：25μL体系中，所述引物组2μL，总DNA模板7.5μL，2×MuLtiplex PCR Buffer 12.5μL， MuLtiplex DNAPolymerase 1μL，对照DNA 2μL。
在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，所述多重PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，循环1次；98℃变性15sec，60℃退火5min，68℃延伸40sec，循环8 次；68℃后延伸10min，循环1次；4℃保存。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S2之后，步骤S3之前，进一步包括对多重 PCR扩增产物进行纯化的步骤，以去除扩增产物中杂质及非特异扩增片段。在本发明的一些具体实施方案中，利用磁珠对所述多重PCR扩增产物进行纯化。在本发明的一些优选实施方案中，纯化3次。
在本发明的一些实施方案中，步骤S3中，所述添加接头PCR扩增的体系为：50μL 体系中，正向接头引物1μL，反向接头引物1μL，多重PCR扩增产物22μL， 2×MuLtiplex PCRBuffer 25μL，MuLtiplex DNA Polymerase 1μL。
在本发明的一些实施方案中，步骤S3中，所述添加接头PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，循环1次；98℃变性15sec，60℃退火40sec，68℃延伸30sec，循环22次；68℃后延伸10min，循环1次；4℃保存。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S3中，进一步包括对接头PCR扩增产物进行纯化的步骤，去除扩增产物中杂质及非特异扩增片段。在本发明的一些具体实施方案中，利用磁珠对所述接头PCR扩增产物进行纯化。在本发明的一些优选实施方案中，纯化3次。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S3之后，步骤S4之前，进一步包括对所述测序文库进行质控的步骤。在本发明的一些具体实施方案中，片段大小为200～500bp，浓度>1nM的测序文库为合格测序文库，可用于高通量测序。在本发明的一些优选实施方案中，AgilientBioanalyer 4200测定文库片段大小；在本发明的另一些优选实施方案中，使用Q-PCR方法检测文库浓度，所使用qPCR引物对包括SEQ ID No.124所示的正向qPCR引物和SEQID No.125所示的反向qPCR引物。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S4中，利用基于桥式扩增原理的高通量测序平台对步骤S3中获得的测序文库进行测序，包括但不限于Illumina MiSeq、MiniSeq、iSeq、NextSeq、HiSeq、NovaSeq。在本发明的一些实施方案中，利用Illumina MiSeq 测序平台对步骤S3中获得的测序文库进行测序。在本发明的一些具体实施方案中，将测序文库稀释至1nM，与浓度为0.1N的NaOH等量混合后，静置5min，双链DNA 即在NaOH作用下变性为单链，然后单链DNA结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，使用Illumina MiSeq测序，测序读取碱基长度为75～600bp同，优选地为300bp。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S4之后，步骤S5之前，进一步包括对测序数据进行质控中的步骤。在本发明的一些具体实施方案中，所述质控是指使用fastqc 去除低质量及过短序列，并进行过滤。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S5中，病原微生物靶标序列数据库是指对应微生物靶标的完整序列及其索引。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S5中，所述准确比对是指相似性大于95％。
在本发明中，所述病原微生物检测方法是基于非诊断和治疗目的的方法。
在本发明中，所述待测样本为受试者体液样本，包括但不限于血液、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液、脓液、胸腹水。
本发明的其他方面还提供本发明第一方面所述的病原微生物检测引物组在制备适用于本发明第三方面所述病原微生物检测方法的试剂盒中的用途。
本发明的有益效果
本发明的引物组、试剂盒和方法，基于靶向测序，即基于多重PCR技术，可在一个反应管内同时扩增56种病原微生物靶标基因，结合高通量测序技术，可检测样本中可能存在的临床常见病原微生物，相对于现有技术，有效效果表现在以下几个方面：
1.病原覆盖全面：本发明的引物组、试剂盒和方法一次检测可覆盖临床常见56种病原微生物，包括细菌、真菌、病毒及支原体、衣原体等；针对临床疑似感染样本，通过检测其中的常见病原微生物，辅助临床精准识别常见病原体，能够制定精准诊疗方案；
2.灵敏度高：本发明的引物组、试剂盒和方法，可检测样本中存在的微量核酸；
3.检测通量高：本发明的引物组、试剂盒和方法因其基于靶向测序，每份样本所需的数据量较低，从而使得一次测序可实现大量样本的检测；
4.成本低：本发明的引物组、试剂盒和方法基于多重PCR技术，仅需一管扩增即可实现多种病原检测，且无宿主干扰，测序成本较低；
5.可相对定量：本发明的引物组、试剂盒和方法，每份样本中测序所得到的对照DNA含量，可作为样本中疑似病原微生物的数量标尺，据此可计算样本中病原体含量。
6.可检测耐药基因：利用本发明的引物组、试剂盒和方法，涵盖耐药基因序列，可通过测序分析检测样本中是否存在耐药基因。
附图说明
图1示出了本发明实施例2中疑似感染肺泡灌洗液4例样本文库片段检测结果， A：Case1-BALF；B：Case2-BALF；C：Case3-BALF和D：Case4-BALF；其中Upper 为Agilent 4200片段分析仪上游marker，大小为1500bp；Lower为Agilent 4200片段分析仪下游marker，大小为25bp。
图2示出了本发明实施例3中疑似感染肺泡灌洗液及血液样本文库片段检测结果，A：Case5-BALF；B：Case5-BLOOD；其中Upper为Agilent 4200片段分析仪上游marker，大小为1500bp；Lower为Agilent 4200片段分析仪下游marker，大小为25bp。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1病原选择与引物设计
本实施例针对以下三类病原设计引物，分别为细菌类病原、真菌类病原和病毒类病原。
其中针对的细菌类病原如表1所示：
表1细菌类病原
副百日咳博德特氏菌 类鼻疽伯克霍尔德菌 单核球增多性李斯特菌 百日咳博德特氏菌 嗜麦芽窄食单胞菌
鹦鹉热衣原体 沙眼衣原体 艰难梭菌 白喉棒状杆菌 具核梭杆菌
流感嗜血杆菌 幽门螺杆菌 肺炎克雷伯菌 嗜肺军团菌 回归热螺旋体
脓肿分枝杆菌 鸟型分支杆菌 牛型结核菌 结核分枝杆菌 肺炎支原体
淋病奈瑟氏菌 恙虫病东方体 绿脓杆菌 酿脓葡萄球菌 肺炎衣原体
酿脓链球菌 肺炎链球菌 微小脲原体 副溶血性弧菌 创伤弧菌
针对的真菌类病原如表2所示：
表2真菌类病原
烟曲霉 米曲霉 白色念珠菌 热带念珠菌 近平滑念珠菌
新型隐球菌 格特隐球菌 耶氏肺孢子菌 马尔尼菲蓝状菌 荚膜组织胞浆菌
球形马拉色菌 微孢子菌 裴氏着色真菌 串珠镰刀菌
针对的病毒类病原如表3所示：
表3病毒类病原
人博卡病毒 人细小病毒 EB病毒 巨细胞病毒 轮状病毒
单纯疱疹病毒 人腺病毒 人多瘤病毒 乙型肝炎病毒 细环病毒
水痘-带状疱疹病毒 传染性软疣病毒
针对每一种病原微生物(靶标)，分别设计正向(F)和反向(R)两条扩增引物，分别如表4所示：
表4病原微生物扩增引物
Figure BDA0002935055170000111
Figure BDA0002935055170000121
Figure BDA0002935055170000131
Figure BDA0002935055170000141
使用时，每条正向扩增引物的5'端与正向通用引物 5'-CCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID No.113)连接；每条反向扩增引物的5'端与反向通用引物5'-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID No.114)连接。其中正向扩增引物为识别病原靶标并扩增的序列，正向通用引物和反向通用引物序列为Illumina测序平台接头序列。
将上述引物组制备成试剂盒，可用于基于靶向测序的病原微生物检测。
实施例24份肺泡灌洗液样本病原微生物检测
收集4份疑似感染病人的肺泡灌洗液样本：Case1-BALF、Case2-BALF、Case3-BALF和Case4-BALF。4位患者临床症状疑似呼吸道感染，临床培养结果阴性，且其他检测未明确感染类型及病原微生物种类。
利用实施例1的引物组或试剂盒，对其肺泡灌洗液样本进行检测，并加入平行质控。具体实施步骤如下：
1.总DNA提取
样本总DNA的提取采用总DNA提取试剂盒(美格医学)，按照说明书中的步骤进行提取：
(1)取400μL肺泡灌洗液样本至到2mL的离心管中，加入40μL Lysis Enzyme、 400μL缓冲液PM及5μL RNA Carrier，涡旋均匀，轻轻颠倒混匀，56℃孵育10min。
(2)加入预冷乙醇(96-100％)400μL，轻轻颠倒混匀样本，室温放置5min，短暂离心以去除管盖内壁的液滴。
(3)上一步所得溶液转移至吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤一次。
(4)吸附柱中加入500μL缓冲液PW1(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
(5)吸附柱中加入600μL漂洗液PW2(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤1次。
(6)12000rpm离心2min，将将吸附柱转入一个干净的离心管中，室温放置5min。向吸附膜中间位置悬空滴加30μLNuclease-Free Water，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中即提取得到样本总DNA。
2.总DNA质控
(1)取1μL DNA，使用Nanodrop 1000微量紫外分光光度计进行检测，记录 A260/A280及A260/A230值；
(2)取5μL DNA，使用Qubit 3.0定量平台进行检测，记录测得DNA浓度。
其中，总DNA质控合格的标准是：OD260/280在1.7-2.0之间，OD260/230在1.8-2.2之间；DNA浓度大于1ng/μL，总量大于100ng。
从4例样本中提取得到的样本总DNA均通过质控。质控结果如下：
样本 A260/A280 A260/A230 Qubit浓度 核酸总量
Case1-BALF 1.82 1.96 5.62 168.6
Case2-BALF 1.76 1.95 10.20 306.0
Case3-BALF 1.89 1.89 9.13 273.9
Case4-BALF 1.97 1.90 6.61 198.3
3.靶标基因多重PCR扩增
(1)按如下反应体系配制靶标基因多重PCR扩增体系：
Primer Mix(浓度为2μM)2μL，模板DNA7.5μL，2×MuLtiplex PCR Buffer(Phusion U Multiplex PCR Master Mix，赛默飞，F562L)12.5μL，MuLtiplex DNAPolymerase(Phusion U Multiplex PCR Master Mix，赛默飞，F562L)1μL，对照DNA 2μL。混合均匀后，短暂离心。
其中，对照DNA的序列如下：
GACAAAGATTCTCATATTTAAACTCAGTTGATTAATAGGATAAGTTTGACACG GAGACTATTCTATAAACCATTGCAAGAATGCCTTAAGAATGCAAGAATGCGGAAG GGATTCGTGTCTATTCTACCTAGCTAAGCTTTACAACTTACCTCCTGAACGGACTT CATCATGTTGCTTCGCGTTCCGTGAGGTAGTGACTT(SEQ ID No.115)。
其浓度为7.5×104/mL。
(2)按如下条件设置靶标基因多重PCR扩增程序：
94℃预变性5min，循环1次；98℃变性15sec，60℃退火5min，68℃延伸40sec，循环8次；68℃后延伸10min，循环1次；4℃保存。
4.靶标基因多重PCR扩增产物纯化
PCR扩增产物纯化使用AMPure XP磁珠，按照说明书中的步骤进行：
(1)将AMPure XP磁珠提前30min从4℃冰箱中取出，颠倒混匀后静置使其温度平衡至室温。
(2)待AMPure XP磁珠充分混匀后，向1.5mL低吸附EP管加入25μL无菌水和 55μLAMPure XP磁珠，转移全部PCR产物至EP管中，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min。
(3)将管置于磁力架上约2min，直至液体澄清，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
(4)加入200μL 80％乙醇，静置30sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
(5)加入200μL 80％乙醇，静置30sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠，短暂离心。置于磁力架上约2min，待磁力架吸附磁珠后，用20μL移液器将管底残留液体吸取，不要吸到磁珠。
(6)室温晾干2-5min，至磁珠表面不反光，注意勿让磁珠晾干至出现裂痕。
(7)从磁力架上取下EP管，加入52μL无菌水，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min，短暂离心，将管置于磁力架上2min直至液体澄清，小心吸取50μL上清，并转移至新的1.5mL无菌EP管中。
(8)加入40AMPure XP磁珠，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min。
(9)将管置于磁力架上2min，直至液体澄清。小心吸取85μL上清至新的1.5mL 无菌EP管中，注意不要吸到磁珠。
(10)向上清中加入10μL涡旋振荡后的AMPure XP磁珠，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min。
(11)将管置于磁力架上约2min，直至液体澄清。用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
(12)加入200μL 80％乙醇，静置30sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
(13)加入200μL 80％乙醇，静置30sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠置于磁力架上2min，待磁力架吸附磁珠后，用20μL移液器将管底残留液体吸取。
(14)室温晾干2-5min，至磁珠表面不反光，注意勿让磁珠晾干至出现裂痕。
(15)从磁力架上取下EP管，加入24μL无菌水，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min，短暂离心。将管置于磁力架上2min直至液体澄清。
(16)小心转移22μL上清至0.2mL PCR反应管中，注意不要吸到磁珠。
5.接头序列PCR扩增
(1)以纯化后的多重PCR扩增产物作为模板，按如下反应体系配制靶标基因多重PCR扩增体系：
Adp Primer F 1μL，Adp Primer R 1μL，模板22μL，2×MuLtiplex PCR Buffer 25μL， MuLtiplex DNA Polymerase 1μL，其中，
正向接头引物Adp Primer F的序列如下(5'-3')：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCT(SEQ IDNo.116)
反向接头引物Adp Primer R的序列如下(5'-3')：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(N)6-12GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC T-CTTCCGATCT
其中，(N)6-12为样本识别条码，相应地，Adp Primer R的序列有以下几种(5'-3')：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCT(SEQID No.117)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGT GTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.118)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACG TGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.119)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGAC GTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.120)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.121)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.122)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.123)
(2)按如下条件设置添加接头PCR扩增程序：
94℃预变性5min，循环1次；98℃变性15sec，60℃退火40sec，68℃延伸30sec，循环22次；68℃后延伸10min，循环1次；4℃保存。
6.接头序列PCR扩增产物纯化
同样使用Phusion U Multiplex PCR Master Mix(赛默飞，F562L)试剂盒(厂家、规格)，操作步骤(1)-(7)同步骤4中对多重PCR扩增产物的纯化步骤(1)-(7)，不同的是：步骤(2)中向1.5mL低吸附EP管加入40μLAMPure XP磁珠；
(8)加入35AMPure XP磁珠，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min。
(9)将管置于磁力架上约2min，直至液体澄清。用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
(10)加入200μL 80％乙醇，静置30sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
(11)加入200μL 80％乙醇，静置30sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠置于磁力架上2min，待磁力架吸附磁珠后，用20μL移液器将管底残留液体吸取。
(12)室温晾干2-5min，至磁珠表面不反光，注意勿让磁珠晾干至出现裂痕。
(13)从磁力架上取下EP管，加入22μL无菌水，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min，短暂离心。将管置于磁力架上2min直至液体澄清。
(14)小心转移20μL上清至0.2mL PCR反应管中，注意不要吸到磁珠。
7.文库质控
(1)使用AgilientBioanalyer 4200测定文库片段大小，质控片段大小分别为：316bp、 319bp、312bp、300bp，如图1所示。
(2)使用Q-PCR方法检测文库浓度，所使用qPCR引物序列为：
qPCR Primer F(5'-3')：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID No.124)
qPCR Primer R(5'-3')：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID No.125)
其文库浓度>1nM为合格文库，文库检测结果如表5所示：
表5疑似感染肺泡灌洗液样本4例文库浓度检测
序号 文库浓度(nM) 文库体积(μL)
Case1-BALF 28.00 20
Case2-BALF 19.20 20
Case3-BALF 7.99 20
Case4-BALF 24.10 20
由此可知，4例样本的文库均为合格文库。
8.高通量测序
质控合格文库稀释至1nM，与浓度为0.1N的NaOH等量混合后，静置5min，双链DNA即在NaOH作用下变性为单链，然后单链DNA结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，使用Illumina MiSeq测序，测序读取碱基长度为300bp。
9.数据分析
(1)测序数据使用fastqc去除低质量及过短序列；过滤后剩余序列使用blast与病原微生物靶标序列数据库比对，统计准确比对上相应靶标的reads数，相似性大于 95％即认为准确比对上；识别病原微生物靶标序列cutoff值为准确比对reads数大于2。
(2)计算病原微生物浓度；其中对照DNA理论浓度为N(7.5×104/mL)，测序所得到的对照DNA reads数为M，阳性样本中检出某一特定病原微生物靶标基因测序所得到的reads数为P，则依据以下公式计算该病原微生物近似浓度C：
C＝N×P/2M×102/mL
结果如表6所示：
表6疑似感染肺泡灌洗液4例检测结果
Figure BDA0002935055170000191
Figure BDA0002935055170000201
实施例3同一患者肺泡灌洗液及血液样本病原微生物检测
收集疑似感染病人的血液及肺泡灌洗液样本1例，患者临床症状疑似呼吸道感染及血流感染，临床血培养及痰培养结果阴性，且其他检测未明确感染类型及病原微生物种类。
利用实施例1的引物组或试剂盒，对其肺泡灌洗液及血液样本进行检测，并加入平行质控。
总DNA提取及质控、多重PCR扩增及扩增产物纯化、接头序列PCR扩增及扩增产物纯化、文库质控、高能量测序以及数据分析方法均与实施例2相同。
其中文库质控中，质控片段大小分别为：321bp、323bp，如图2所示。文库检测结果如表7所示：
表7疑似感染肺泡灌洗液及血液样本文库浓度检测
序号 样本类型 文库浓度(nM) 文库体积(μL)
Case5-BALF 肺泡灌洗液 27.8 20
Case5-BLOOD 血液 13.2 20
由此可知2例样本的文库均为合格文库。
利用测序、比对，计算得到的病原微生物浓度如表8所示。
表8疑似感染肺泡灌洗液及血液样本检测结果
Figure BDA0002935055170000202
Figure BDA0002935055170000211
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，其特征在于，包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56。
2.根据权利要求1所述的病原微生物检测引物组，其特征在于，每条正向扩增引物的5'端连接有SEQ ID No.113所示的正向通用引物，每条反向扩增引物的5'端连接有SEQ IDNo.114所示的反向通用引物。
3.根据权利要求2所述的病原微生物检测引物组，其特征在于，还包括接头引物对，包括SEQ ID No.116所示的正向接头引物和SEQ ID No.117-123任一所示的反向接头引物。
4.一种基于靶向测序的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的病原微生物检测引物组。
5.根据权利要求4所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本总DNA提取试剂、PCR扩增产物纯化试剂。
7.根据权利要求4-6任一所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对照DNA，所述对照DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.115所示。
8.一种基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，获得待测样本的总DNA；
S2，以步骤S1获得的总DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组进行多重PCR扩增；
S3，以步骤S2获得的多重PCR扩增产物以及对照DNA作为模板，利用权利要求3所述的接头引物对进行PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
S4，对步骤S3获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
S5，将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S6，利用下述公式计算病原微生物近似浓度C：
C＝N×P/2M×102/mL
其中，N为对照DNA浓度，M为对照DNA reads数，P为准确比对上特定病原微生物靶标的reads数。
9.根据权利要求8所述的病原微生物检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述多重PCR扩增的体系为：25μL体系中，所述引物组2μL，总DNA模板7.5μL，2×MuLtiplex PCR Buffer12.5μL，MuLtiplex DNA Polymerase 1μL，对照DNA 2μL。
10.根据权利要求9所述的病原微生物检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述多重PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，循环1次；98℃变性15sec，60℃退火5min，68℃延伸40sec，循环8次；68℃后延伸10min，循环1次；4℃保存。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113444773A (zh) * 2021-08-17 2021-09-28 黑龙江省牡丹江林业中心医院 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒
CN113462749A (zh) * 2021-06-01 2021-10-01 广州东盛生物科技有限公司 一种高灵敏扩增子建库试剂盒以及建库方法和应用
CN114196779A (zh) * 2021-12-27 2022-03-18 武汉明德生物科技股份有限公司 基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒
CN115873992A (zh) * 2022-11-04 2023-03-31 武汉贝纳科技有限公司 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用
CN115976281A (zh) * 2022-11-18 2023-04-18 中国农业大学 一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的引物组及应用
CN116144811A (zh) * 2022-12-21 2023-05-23 迪飞医学科技(南京)有限公司 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒
CN116287330A (zh) * 2022-12-30 2023-06-23 中国科学院生态环境研究中心 一种可检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量pcr芯片及其检测方法
CN115992267B (zh) * 2022-07-15 2023-11-03 中国医学科学院北京协和医院 一种高通量高精度检出多种病原菌的引物组、试剂盒及方法
CN117025808A (zh) * 2023-10-09 2023-11-10 美格医学检验所(广州)有限公司 一种病原微生物检测引物组合、试剂盒和检测方法
CN117025809A (zh) * 2023-10-09 2023-11-10 美格医学检验所(广州)有限公司 结核分歧杆菌复合群鉴定引物组合、试剂盒、方法和系统

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013086201A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Dowd Scot E Universal or broad range assays and multi-tag sample specific diagnostic process using non-optical sequencing
US20160108461A1 (en) * 2006-09-14 2016-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
CN108517350A (zh) * 2018-04-09 2018-09-11 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 多种病原体靶向建库试剂盒
CN110964840A (zh) * 2018-09-30 2020-04-07 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测5种血流感染病原体的引物组、试剂盒及建库方法
CN111269995A (zh) * 2018-12-04 2020-06-12 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法
CN111276185A (zh) * 2020-02-18 2020-06-12 上海桑格信息技术有限公司 一种基于二代高通量测序的微生物鉴定分析系统及装置

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160108461A1 (en) * 2006-09-14 2016-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
WO2013086201A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Dowd Scot E Universal or broad range assays and multi-tag sample specific diagnostic process using non-optical sequencing
CN108517350A (zh) * 2018-04-09 2018-09-11 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 多种病原体靶向建库试剂盒
CN110964840A (zh) * 2018-09-30 2020-04-07 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测5种血流感染病原体的引物组、试剂盒及建库方法
CN111269995A (zh) * 2018-12-04 2020-06-12 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法
CN111276185A (zh) * 2020-02-18 2020-06-12 上海桑格信息技术有限公司 一种基于二代高通量测序的微生物鉴定分析系统及装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMAN ANIS等: "Evaluation of Targeted Next-Generation Sequencing for Detection of Bovine Pathogens in Clinical Samples", 《J CLIN MICROBIOL》 *
YU YANG等: "Targeted Sequencing of Respiratory Viruses in Clinical Specimens", 《THE HUMAN VIROME》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462749A (zh) * 2021-06-01 2021-10-01 广州东盛生物科技有限公司 一种高灵敏扩增子建库试剂盒以及建库方法和应用
CN113444773A (zh) * 2021-08-17 2021-09-28 黑龙江省牡丹江林业中心医院 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒
CN113444773B (zh) * 2021-08-17 2023-06-16 黑龙江省牡丹江林业中心医院 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒
CN114196779A (zh) * 2021-12-27 2022-03-18 武汉明德生物科技股份有限公司 基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒
CN115992267B (zh) * 2022-07-15 2023-11-03 中国医学科学院北京协和医院 一种高通量高精度检出多种病原菌的引物组、试剂盒及方法
CN115873992A (zh) * 2022-11-04 2023-03-31 武汉贝纳科技有限公司 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用
CN115873992B (zh) * 2022-11-04 2023-09-26 武汉贝纳科技有限公司 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用
CN115976281B (zh) * 2022-11-18 2023-07-25 中国农业大学 一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的引物组及应用
CN115976281A (zh) * 2022-11-18 2023-04-18 中国农业大学 一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的引物组及应用
CN116144811A (zh) * 2022-12-21 2023-05-23 迪飞医学科技(南京)有限公司 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒
CN116144811B (zh) * 2022-12-21 2024-02-20 迪飞医学科技(南京)有限公司 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒
CN116287330A (zh) * 2022-12-30 2023-06-23 中国科学院生态环境研究中心 一种可检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量pcr芯片及其检测方法
CN116287330B (zh) * 2022-12-30 2023-12-05 中国科学院生态环境研究中心 一种可检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量pcr芯片及其检测方法
CN117025808A (zh) * 2023-10-09 2023-11-10 美格医学检验所(广州)有限公司 一种病原微生物检测引物组合、试剂盒和检测方法
CN117025809A (zh) * 2023-10-09 2023-11-10 美格医学检验所(广州)有限公司 结核分歧杆菌复合群鉴定引物组合、试剂盒、方法和系统
CN117025809B (zh) * 2023-10-09 2024-03-19 广州精微医学科技有限公司 结核分歧杆菌复合群鉴定及耐药位点检测引物组合、试剂盒、方法和系统

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