CN111269995A - 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法，该引物组包括至少60对引物对，每对引物对由正向引物与反向引物组成，引物对选自SEQ ID NO：1~154所示核苷酸；任选地，该引物组用于在同一反应体系中，对病原体的特异序列进行多重PCR靶向扩增。本发明的用于检测病原体的引物组，能够一次性检测至少20种靶标，特异性较强，成本显著低于基于宏基因组测序的方法，并且最快24小时得到检测结果，大大缩短了检测周期。
Description
技术领域
本发明涉及病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
病原微生物在临床上的传统诊断方法主要包括：(1)镜检。凡在形态和染色性上具有特征的致病菌，直接涂片染色后显微镜观察有助于初步诊断。(2)细菌培养。选择适宜的培养基、pH、培养时间、温度等，提供特定细菌生长所需的必要条件。(3)生化试验。细菌生化反应是依据各种细菌具有不同的酶系统，对营养物质的分解所产生的代谢产物不同，以此来鉴别细菌。(4)血清学鉴定。根据相应抗原与抗体反应的特异性，采用含有已知特异抗体的免疫血清，对其分离的待检测菌进行属、种和血清型鉴定。(5)抗原抗体检测。原理是用已知的特异性抗体测未知的细菌抗原成分。(6)分子生物学方法。随着分子生物学技术的应用，微生物学的检测技术从生物学检查进展到分子生物学的鉴定，不同种的病原微生物具有不同的基因序列，故可通过检测病原微生物的特异性基因序列的存在与否进行检测。常用的方法主要有核酸杂交和聚合配链反应(PCR)等。
当前，应用于临床实验室病原检测的分子生物学技术主要包括基于病原微生物DNA或RNA的检测技术如分子杂交、核酸扩增的方法；基于宏基因组二代测序的方法；以及以DNA序列分析、基因芯片和以蛋白质组学为基础的质谱检测技术等。以各技术的代表产品为例详细说明：(1)基于荧光定量PCR技术，以法国梅里埃的FiliArray系列为例，其中的脑炎脑膜炎症候群病原体检测试剂盒可在1小时内完成检测，一次性可检测的病原体较少。该技术根据不同物种DNA独特的溶解曲线在高分辨精度下对其进行鉴别，局限于溶解曲线的特异性及芯片的大小，导致漏检的风险较高。并且增加病原种类的可能性不高。(2)基于多重RT-PCR技术，Luminex脑脊液细菌多重检测试剂盒(
液相芯片法)、脑脊液病毒多重检测试剂盒(
液相芯片法)正在进入临床推广阶段，该试剂盒基于多重RT-PCR技术，虽然检测周期短、成本较低，但覆盖的病原体较少，漏检的风险较高。(3)基于宏基因组二代测序技术，以华大基因的PMseq产品为例，该产品可以在24h内鉴定近8千种病原，可以尽可能地检出未知病原，但数据利用率低、检测成本较高，且由于是无偏向测序，检出病原种类较多，难以精准定位致病病原。
发明内容
本发明提供一种用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法，能够一次性检测至少20种靶标，特异性较强，成本低。
根据第一方面，一种实施例中提供一种用于病原体的引物组，包括至少60对引物对，每对上述引物对由正向引物与反向引物组成，上述引物对选自SEQ ID NO：1～154所示核苷酸。任选地，上述引物组用于在同一反应体系中，对上述病原体的特异序列进行多重PCR靶向扩增。
作为本发明的优选方案，上述引物组包括选自SEQ ID NO：1～154所示的77对引物对中的61对、62对、63对、64对、65对、66对、67对、68对、69对、70对、71对、72对、73对、74对、75对、76对或77对引物对。需要说明的是，上述引物对可以在SEQ ID NO：1～154所示的77对引物对中成对地任意选择，由于引物必须成对使用，因此以“一对”作为一个选择单元，例如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2构成一对编号为CSF08976的引物，其余以此类推。本发明中选自SEQ ID NO：1～154所示的77对引物对能够检测27种脑炎脑膜炎病原体，如表1中的脑炎脑膜炎病原体和对应的靶标引物序列所示，前25种脑炎脑膜炎病原体中每一种均对应3对引物对，在具体检测应用中，如果要检测某种病原体，需要选择至少一对对应于该病原体的引物对，可以选择2对或3对，优选3对。因此，本发明中引物组包括至少60对引物对，例如，引物组包括60对引物对的情况下，这60对引物对可以是任意选择的，例如可以是SEQ ID NO：1～120共60对引物对，用于检测表1中的27种病原体中的前20种；也可以是其他任意60对引物对，在某些病原体具有3对可选择的引物对，但仅选择1对或2对的情况下，60对引物对能够检测大于20种病原体，最多可以检测27种病原体。本发明最优选的技术方案是，选择SEQID NO：1～154所示的77对引物对，用于检测表1中的全部27种脑炎脑膜炎病原体。
作为本发明的优选方案，上述引物组还包括用作内参的引物序列SEQ ID NO：155～156。
根据第二方面，一种实施例中提供一种用于检测病原体的试剂盒，包括第一方面的引物组。
作为本发明的优选方案，上述试剂盒还包括多重PCR靶向扩增试剂组分、末端修复试剂组分、接头连接试剂组分、文库PCR扩增试剂组分、逆转录试剂组分中的一种或多种。
作为本发明的优选方案，上述多重PCR靶向扩增试剂组分包括靶向扩增缓冲液和靶向扩增酶，优选地，上述靶向扩增酶是Ex Taq聚合酶。
作为本发明的优选方案，上述末端修复试剂组分包括末端修复缓冲液和末端修复酶，优选地，上述末端修复酶包括T4 DNA聚合酶、T4PNK和rTaq。
作为本发明的优选方案，上述接头连接试剂组分包括连接缓冲液、连接酶和接头序列；优选地，上述连接酶是T4 DNA连接酶；优选地，上述接头序列如SEQ ID NO：157～158所示。
作为本发明的优选方案，上述文库PCR扩增试剂组分包括PCR反应酶-缓冲液混合液和PCR反应引物；优选地，上述PCR反应酶-缓冲液混合液是KAPA HIFI热启动预混液；上述PCR反应引物如SEQ ID NO：159～160所示。
作为本发明的优选方案，上述逆转录试剂组分包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT和dNTP；优选地，上述逆转录酶是Super ScriptⅡ逆转录酶。
根据第三方面，一种实施例中提供一种用于扩增病原体的多重PCR反应体系，包括如第一方面的引物组、Ex Taq聚合酶、dNTP和Ex Taq聚合酶的缓冲液。任选地，上述反应体系还包括如SEQ ID NO：155～156所示的内参引物。
根据第四方面，一种实施例中提供一种第一方面的引物组、第二方面的试剂盒、或第三方面的反应体系在检测脑炎和/或脑膜炎病原体中的应用。任选地，上述病原体选自阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、单增生李斯特菌、屎肠球菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、头葡萄球菌、结核分枝杆菌属、布鲁氏菌属、人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型、人疱疹病毒3型、人疱疹病毒4型、人疱疹病毒5型、人疱疹病毒6型、新型隐球菌、格特隐球菌、人双埃可毒属、肠道病毒属至少任意二十种以上。
根据第五方面，一种实施例中提供一种用于检测病原体的建库方法，包括采用第一方面的引物组对样本核酸提取物进行多重PCR靶向扩增；然后对上述多重PCR靶向扩增的产物进行测序文库构建。该建库方法中建库步骤没有特别限定，只要使用本发明的多重PCR靶向扩增的产物为材料可以按照现有任何建库方法进行。
作为本发明的优选方案，上述样本来自于脑脊液。
作为本发明的优选方案，上述核酸提取物为RNA，上述方法还包括，在上述多重PCR靶向扩增之前，对上述RNA进行逆转录。
根据第六方面，一种实施例中提供一种非诊断目的的检测病原体的方法，该方法包括对第五方面得到的测序文库进行高通量测序获得测序数据，然后对上述测序数据进行分析以获取病原体检测结果。
本发明的检测病原体的方法是非诊断目的的，例如使用该方法研究病原菌感染的人群所在地域分布情况，人群年龄与病原菌种类情况等与。
作为本发明的优选方案，上述对测序数据进行分析，包括：
(a)对上述测序数据进行过滤；
(b)将过滤后的测序数据比对靶标序列数据库，然后筛选比对结果；
(c)任选地，将未比对到上述靶标序列数据库的测序数据比对到宿主参考基因组；
(d)根据靶标序列数据库的比对结果，统计检出靶标的指标；
(e)获取靶标检出序列数，并判断每种病原体是否检出；和
(f)输出检测结果。
作为本发明的优选方案，上述步骤(a)过滤去除下列序列中的至少之一：(a)与接头序列共有连续10bp以上碱基的序列；(b)读段长度低于预定阈值的序列；上述预定阈值优选为50～55bp；(c)序列中质量值小于5的碱基数占序列总碱基数的比值大于50％的序列。
作为本发明的优选方案，上述步骤(b)基于下列中的至少之一筛选比对结果：(a)保留上述测序数据中比对长度占比大于90％的序列；(b)保留上述测序数据中错配碱基数小于5％的序列；(c)保留具有比对特异性的序列，其中上述具有比对特异性的序列为唯一比对序列或多比对结果中满足次优比对分值除以最优比对分值小于0.8的序列，其中上述唯一比对序列是唯一比对到上述病原微生物基因组一个位置上的序列；
作为本发明的优选方案，上述步骤(c)中序列比对长度占比达到80％，判断为宿主序列。
作为本发明的优选方案，上述步骤(d)中上述检出靶标的指标包括：标准化比对序列数、标准化唯一比对序列数。
作为本发明的优选方案，上述步骤(e)中根据如下标准判断每种病原体是否检出：对每种靶标，检出值大于检测阈值为检出；对每种病原体，3个靶标中2个以上靶标检出时为该病原体检出，1-2个靶标中1个以上靶标检出时为该病原体检出；阴性对照中也检出该病原体，则该病原体属于假阳性结果。
本发明的用于检测病原体的引物组，能够一次性检测至少20种靶标，特异性较强，成本显著低于基于宏基因组测序的方法，并且最快24小时得到检测结果，大大缩短了检测周期。
附图说明
图1为本发明一个实施例中在包含多菌株的物种中选择共有特异性目标片段的原理示意图；
图2为本发明一个实施例中扩增产物的安捷伦2100质控结果；
图3为本发明一个实施例中新型隐球菌在一个批次内所有脑脊液样本的检出结果情况。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明提供了一种用于检测病原体的引物组、试剂盒、反应体系和建库方法，能够提高检测速度，最快24小时提供检测结果，显著优于现阶段的培养法；提高检测通量，一次性检测至少20种靶标，最多可检测27种靶标，显著高于目前商业化试剂盒的检测通量；降低检测成本，预期检测成本150-200元/样本，显著低于基于宏基因组测序产品的成本。
本发明基于数据库分析和实验验证提供一组多重靶向扩增引物，具体而言，基于目前全球公布的人源序列(3.0G)、1494种细菌(5.1G)、73种真菌(1.7G)、2700种病毒(71M)，从中提取本发明涉及的27种靶标(阴沟肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，嗜麦芽窄食单胞菌，鲍曼不动杆菌，单增生李斯特菌，屎肠球菌，脑膜炎奈瑟球菌，肺炎链球菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，头葡萄球菌，结核分枝杆菌属，布鲁氏菌属，人单纯疱疹病毒1型，人单纯疱疹病毒2型，人疱疹病毒3型，人疱疹病毒4型，人疱疹病毒5型，人疱疹病毒6型，新型隐球菌，格特隐球菌，人双埃可毒属，肠道病毒属)所有完整基因组序列，对于完整基因组数小于5条，则提取所有基因组序列构建成检测靶标数据库。为准确定性，选择的目标片段须为该物种特异区域，即其它物种不包含该片段序列。若鉴定目标为属水平或者复合群水平，目标片段须为该属/复合群水平特异区域，即除该属或复合群内物种，其它物种不包含该片段序列。保证种水平特异性的同时，选择的目标片段应被该物种下尽可能多的株序列所包含，如图1所示，若某物种A包含菌株1、菌株2、菌株3和菌株4，则选择它们共有的“高共有率区域”作为目标片段。
目标片段筛选后，相应区域的引物设计使用软件如Primer Premier5.0、AmpliseqDesigner进行设计。同时利用菌株进行引物验证筛选出27种靶标引物，得到一组能够在同一个反应体系中进行多重靶向扩增的引物组，经验证其特异性良好，没有交叉扩增现象，互相之间没有彼此干扰存在，该引物组序列如下表1所示，其中引物序列SEQ ID NO：1～154用于扩增27种脑炎脑膜炎病原体的目标片段；引物序列SEQ ID NO：155～156用作内参引物。
表1靶标引物序列
以下通过一个实施例对本发明进行详细描述，需要说明的是，该实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
对已经使用传统检测方法(培养、镜检、抗原抗体检测)确认检测结果的50例临床脑脊液样本，按照如下流程进行检测：
1.样本核酸提取(采用天根生物科技有限公司DP438微量样品基因组DNA/RNA提取试剂盒，操作步骤详见试剂盒说明书)。
2.样本核酸逆转录及纯化
2.1.取质控合格的步骤1获得的核酸样本10μL，加入3μL 5X First Strandbuffer和2.5μL N6 Primer(6-碱基随机引物，20μM)。
2.2.PCR仪上65℃孵育5min，之后立即置于冰上。
2.3.按以下表2配置反应体系，并将配置的反应体系加入到上一步反应体系中：
表2
| 组分 | 体积 |
| dNTP Mix(10mM) | 1 |
| DTT(0.1M) | 0.5 |
| RNase抑制剂(40U/μL) | 0.5 |
| Super ScriptⅡReverse Transcriptase(200U/μL) | 0.5 |
| 总量 | 2.5 |
2.4置于PCR仪中，运行以下程序：25℃10min；42℃60min；70℃15min；4℃∞。
2.5.将逆转录产物转移至新的300μL八连管中，加入36μL Ampure XP Beads(2倍体积)，在漩涡混合器小心混匀，短暂离心后室温放置5min，之后置于96孔磁力架上2min，小心吸弃液体。
2.6.小心加入180μL 80％乙醇，将八联管换一个方向置于磁力架以充分洗涤磁珠(将八联管来回调换至少2次)，洗涤之后静置1min，吸弃乙醇。
2.7.重复步骤2.6一次。
2.8.短暂低速离心(时间稍长磁珠晾干的时间可能更短)后小心吸弃乙醇，室温晾干(时间长短与室内湿度有关，一般为5min)至磁珠表面哑光。
2.9.加入22.5μL EB溶液，在漩涡混合器小心混匀，短暂离心，室温静置5min；置于磁力架上2min，小心吸取溶液至新的1.5mL离心管中。
3.靶向扩增PCR及纯化
3.1.多重扩增体系在行业中普遍共识是扩增靶标越多对体系要求越严格，本发明经过优化构建了最优的反应体系，能满足78重以上的反应。本实施例的反应体系如下表3所示，其中引物组序列如表1所示：
表3
| 组分 | 体积(μL) |
| 2.9逆转录产物 | 9.1 |
| 10X Ex Taq buffer | 3 |
| dNTP(2.5mM) | 4 |
| Ex Taq酶(5U/μL) | 0.4 |
| 靶标正向引物组合(1pmol/μL) | 0.75 |
| 靶标反向引物组合(1pmol/μL) | 0.75 |
| 内参引物F(0.2pmol/μL) | 1 |
| 内参引物R(0.2pmol/μL) | 1 |
| 总体积 | 20 |
3.2.配置好体系后加入到AXYGEN 0.2ml PCR透明薄壁管(鼓盖，型号PCR-02D-C)中，置于PCR仪(VERITI)，运行以下程序：99℃2min；99℃15s，60℃2min，40个循环；4℃∞。
3.3.将PCR产物转移至新的300μL八连管中，加入1倍体积Ampure XP Beads，在漩涡混合器小心混匀，短暂离心，室温静置5min后置于磁力架上2min，小心吸弃液体。
3.4.小心加入180μL 80％乙醇，将八联管换一个方向置于磁力架以充分洗涤磁珠(将八联管来回调换至少2次)，洗涤之后静置1min，吸弃乙醇。
3.5.重复步骤3.4.一次。
3.6.短暂低速离心(时间稍长磁珠晾干的时间可能更短)后小心吸弃乙醇，室温晾干(时间长短与室内湿度有关，一般为5min)至磁珠表面哑光。
3.7.加入45.5μL EB溶液，在漩涡混合器小心混匀，短暂离心，室温静置5min；置于磁力架上2min，小心吸取溶液至下一步末端修复体系中。
4.多重PCR产物文库构建(基于华大基因BGISEQ-500测序平台)
4.1.按照如下表4的反应体系配制反应混合物，进行末端修复反应：
表4
4.2.置于PCR仪中，运行以下程序：37℃10min；65℃15min；4℃∞。
4.3.末端修复后，加入2μL Ad153标签序列接头(Barcode Adapter)(5μM)，其中Ad153标签序列接头序列为：
5’-/Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATGTCATAAATCAACTCCTTGGCTCACA-3’(SEQ ID NO：157)，
5’-TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTTAGTT-3’(SEQ ID NO：158)；
4.4.按照如下表5比例配制反应混合物，进行接头连接：
表5
| 组分 | 体积(μL) |
| 末端修复后DNA+Ad153接头 | 52 |
| 10x PNK buffer | 3 |
| ATP(100mM) | 0.8 |
| 50％PEG 8000 | 12 |
| 无核酸酶的水 | 11.2 |
| T4 DNA连接酶(600U/μL) | 1 |
| 总量 | 80 |
4.5.置于PCR仪中23℃孵育20min。
4.6.将接头连接后产物转移至新的300μL八连管中，加入40μL Ampure XP Beads(0.5倍体积)，在漩涡混合器小心混匀，短暂离心，室温静置5min后置于磁力架上2min，小心吸弃液体。
4.7.小心加入180μL 80％乙醇，将八联管换一个方向置于磁力架以充分洗涤磁珠(将八联管来回调换至少2次)，洗涤之后静置1min，吸弃乙醇。
4.8.重复步骤4.7.一次。
4.9.短暂低速离心(时间稍长磁珠晾干的时间可能更短)后小心吸弃乙醇，室温晾干(时间长短与室内湿度有关，一般为5min)至磁珠表面哑光。
4.10.加入23.5μL EB溶液，在漩涡混合器小心混匀，短暂离心，室温静置5min。
4.12.置于磁力架上2min，小心吸取溶液至下一步PCR反应体系中。
4.13.按照如下表6的反应体系配置引物扩增体系：
其中，Ad153引物F序列为：5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3’(SEQ ID NO：159)；
Ad153引物R序列为：5’-/Phos/GAACGACATGGCTACGA-3’(SEQ ID NO：160)。
表6
| 组分 | 体积(μL) |
| 接头连接后产物 | 21 |
| KAPA HIFI Hot Start Ready Mix(2x) | 25 |
| Ad153引物F(20μM) | 2 |
| Ad153引物R(20μM) | 2 |
| 总量 | 50 |
4.14.将上述反应体系按以下程序进行PCR反应：98℃2min；98℃15s，56℃15s，72℃30s，10个循环；72℃5min；4℃∞。
4.15.将PCR产物转移至新的300μL八连管中，加入50μL Ampure XP Beads(1倍体积)，在漩涡混合器小心混匀，短暂离心，室温静置5min后置于磁力架上2min，小心吸弃液体。
4.16.小心加入180μL 80％乙醇，将八联管换一个方向置于磁力架以充分洗涤磁珠(将八联管来回调换至少2次)，洗涤之后静置1min，吸弃乙醇。
4.17.重复步骤4.16.一次。
4.18.短暂低速离心(时间稍长磁珠晾干的时间可能更短)后小心吸弃乙醇，室温晾干(时间长短与室内湿度有关，一般为5min)至磁珠表面哑光。
4.19.加入22.5μLEB溶液，在漩涡混合器小心混匀，短暂离心，室温静置5min。
4.20.置于磁力架上2min，小心吸取溶液至新的1.5ml离心管中。
5.使用安捷伦2100进行检测(操作步骤请见安捷伦2100核酸片段分析试剂盒说明书)。
6.检测结果：如图2所示，目的峰值在200-300bp区间范围内(270bp左右为内参峰)，该结果证明所构建的文库满足上机测序的要求。
7.测序上机，操作步骤请见BGISEQ-500RS高通量测序试剂盒(SE50)V3.0。
8.数据分析：
(1)数据过滤
方面一：过滤与接头序列共有连续10bp以上碱基的序列。
方面二：过滤读长低于一定阈值(默认50bp)的序列。
方面三：过滤测序质量值小于5的碱基占比大于50％的序列。
(2)靶标序列数据库比对及结果筛选
使用比对软件将过滤后的序列比对靶标序列数据库，然后对比对结果进行筛选，按照以下筛选原则获得高质量比对结果：
原则一：保留比对长度占比大于90％的序列，即单条序列比对上参考序列的长度等于90％序列全长。
原则二：保留错配碱基数小于5％的序列，即比对上部分由于测序错误产生与参考序列不一致的碱基数比例小于5％。
原则三：保留比对特异性的序列，为保证结果精确性，如果一条序列比对上不同靶标区域，根据多比对结果的分值差比(即次优比对除以最优比对小于0.8)进行特异性比对序列筛选，获得“唯一”比对序列。
(3)宿主序列统计
将(1)中过滤后的序列，去除(2)中比对到靶标序列库的序列，再比对到宿主参考基因组文件上。当序列比对长度占比达到80％时则判断为宿主序列。
(4)靶标注释分析
根据靶标序列数据库的比对结果，对检出靶标统计以下指标：
(a)标准化比对序列数(SDMRN)：比对上该靶标区域的标准化序列数。
(b)标准化唯一比对序列数(SDSMRN)：唯一比对到该靶标区域的标准化序列数，本实施例用“检出序列数”表示该指标，表示该靶标区域的检出序列数量。
(5)自动化解读结果
根据步骤(4)，获得样本中每个病原的靶标检出序列数，根据解读逻辑自动化判断每种病原是否检出，生成检测结果表。解读逻辑如下：
(a)对每种靶标，检出值大于检测阈值即为检出，该检测阈值为10。
(b)对每种病原，如果有3个靶标，2个以上靶标检出时该病原检出；如果有1-2个靶标，1个以上靶标检出时该病原检出。
(c)如果阴性对照中也检出该病原，则该病原属于假阳性结果，不报告检出。
在检测结果表中，只展示病原靶标检出序列数之和大于10的结果。
(6)结果可视化
靶标检测结果可视化，统计每个有检出的靶标在同批次样本中的检出情况，判断是否存在批次内污染情况。图3展示新型隐球菌在一个批次内所有脑脊液样本的检出结果，可以看出，该新型隐球菌在其它样本内未明显检出，因此可以排除交叉污染，进一步确认检出该新型隐球菌。
9.检测结果
50例临床样本中，传统方法检测阳性28例，阴性22例，本发明方法检测阳性29例，阴性21例。经过第三方检验公司使用一代焦磷酸测序法进行验证，验证方法大致如下：使用靶标的特异引物或者通用引物(例如16s/18s/its)在需要验证的样本中扩增，扩增出来的片段进行焦磷酸测序，测序获得扩增产物的核酸序列，将核酸序列比对到NCBI数据库，根据比对结果获得该核酸序列的归属注释信息。验证结果显示传统检测结果与本发明检测结果不一致的11例样本中6例支持本发明检测结果正确，2例支持传统检测方法结果正确，2例样本无足够的样本满足第三方验证要求，1例样本不在本发明检测靶标范围内。所以本发明的正确率为45/47＝95.74％，而传统的检测方法正确率只有41/47＝87.23％。结果如表6和7所示。
表6检测结果
表7检测结果详情
以上结果说明，本发明的引物及方法可用于脑炎脑膜炎病原体检测，检测结果准确可信。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州华大基因医学检验所有限公司，深圳华大基因股份有限公司，深圳华大临床检验中心
<120> 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法
<130> 18I26851
<160> 160
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctaccacaag ggcagagttg aga 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgccagtcca attttaacct ttctc 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcacagatat cgaaaatctg ttctga 26
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgccacgtta tagcttgaaa tattattact 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcaagacagg gcatgtcgaa 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcctgtaca aatacacgtt atcgct 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtttaaacg ccacgagcag ta 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcagtcgata agtccagcca aa 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctacgacaac atgttcgccg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aaaaccgcct ggatcgccc 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgatgaagc gcaacatcac c 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccctgatagt cattgatgtc gttg 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggtgatcag gtcgcagtta tc 22
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtctattgca agatgtgtca taggct 26
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaaaacgcac acaaacgtca aaatt 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gggatttgcg agattgcttt tga 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cggtcaatgg tgggatgtac at 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gggttttctg cttttcaagc tgaac 25
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gctggcctgt tcgtcatcat 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cggacagctt cagttcaacg 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccgaccatgc ccttcgaat 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tacccacagt gtagccgctc 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gaactgcgag cgagacctt 19
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cacaaccaca cgttaccgat c 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
taatgagctc agcattgccc aaa 23
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggttgggcat attcaaattg attggc 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cttaaagcga atggcggatt ca 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tgagccactt cgttttggtc at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cgtcaaacac gtggcgatga ta 22
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cccatacata acatgatctt caacttcg 28
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
aaataaatgt gcgagcctca cc 22
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gataaaccaa ttgccgacaa tttatcc 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gggacacatg caatatcaag cct 23
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gcgcttgctt catccgtttt ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccatctctat ggagaaaatc tgcca 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tagcttgcgt ttcgtgtgtc ta 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gggagcaaaa ggtccaaata ctttt 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gtgagtaaca ccggaagaag gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tccatttgca tctactacaa ttcctgt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
atacgccgtt caagcaacaa atac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ggtaacgtct cataaatatc tgatagcct 29
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
caccagttac agtgatggac aca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gcacaagaag agtgggacag aaaata 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ccacatcggg tctctggttt tt 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ataaagcggc aaattcaact gtacg 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
tcatgaatac cggatgcagc ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ggtgtcggtg gtgttgca 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gcaaacagat acgtccgcaa a 21
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
attggatgga agtgcggaaa ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ctagcggacc tcagacagaa ggt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
cgactcatca agaatttaga gacaggt 27
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gcaaacttca cgaataactc cactaca 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atggccgttt tgatcaatat atgtatcca 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcatatttgc gtccaatatt tctataccc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgattatggc tgcacagtct catc 24
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<213> 人工序列
<400> 57
cactgcgtcc atctcgaaga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgctgcacca gaaagatctc aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
cccatccagc tgtgatgaca at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
tagcgacagg tcctcttacg aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
gtaatcccac tttcaaaaac acgct 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
gacctaaggg aggtcctgga at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
tgaagcggct tcaggtgaaa ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
cttcttcagc aggacatccc aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
gcaacgtatg attctgatat gactgga 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
gcgtgtgatg tcataccacc at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
ggtgcagcaa caggaaaagt ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
gcatttcttc tacaactggt tggtca 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
acaaatttcc atagatacat atcgcagtga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
cttctacaac tggcactaca cgt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
tgattcattt tcagatggtg gtcagt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
cgttagcttc cgcacttgta att 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
ccgcctaatt caatactttc cggaa 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
gtgtagcaac agcgattgtg tt 22
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gccatttttg atttaaacct ttggttatgt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
tatgattcat catggtaaag ctgttcgt 28
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
agttaaatgg gcaccttctg ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
gtatgctgca ttaacaactg aatcagt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
tgcatctgca tcagcaataa ttcg 24
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
cgctgtgccg ttaacacaaa tc 22
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
gggtcatact caccttatgg gaag 24
<210> 87
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
aatcttattt cgagaagctg agggaa 26
<210> 88
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
taacgtatct actctgtaat tcgtcatcgt 30
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
ttaggatttg atgcggcagg tatt 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
agaggtaaac ttgccgcttg tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tctttgagcg gaattgctcg t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
acacaacgac gagtggctta 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
tccaaaagcc ggtactgtta tcc 23
<210> 94
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
ccattgcaga ttccggaagt aac 23
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
tgttgtgggt ggcctttcat ag 22
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gcagaacagg acggtagtgt tc 22
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
actagttggt caaaatgcag gcta 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
cggcgattga tgctttgaat g 21
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
cgcaggctgt tgtatccttc tg 22
<210> 100
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
tggcttggaa agcaatcaat ttagag 26
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
gcttgacgaa ccagcaactt ct 22
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
cccgcttttc atcctgaaaa aca 23
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
aaataaagag ccgtaaccca acca 24
<210> 104
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
ggtggtcatt attctggtat tcctgtg 27
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
cgcgttcgga cgtcttagaa 20
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
ctgcatctgt ttggtgcgtt t 21
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
gtgtgtgtgg gcaaacttca tc 22
<210> 108
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
ccctaacgga ttattgtcct cttgt 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
gcctccatcg agataacgtc at 22
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
ggcgaacgaa cggtcaataa aa 22
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
aaagtggttg attgtcatta cggt 24
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
cccaagagac ttccctaaca cg 22
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
cgcttctcgc ctctcttctt c 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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aaaaacagcg agttccgcat g 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
ggaatatgtc aggagctacg tga 23
<210> 116
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtccacaacg tccaagaacc at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
gtggacattg gcgtatgcat tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
ccgagatacg gatttatatc gcctaga 27
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
tgacccatca tccgttttgc at 22
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
accatgggac gttgattcat gg 22
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
tggctctggt gacgttaaat gt 22
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
ccattctgca aggtttacac cct 23
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
ggcatcatcc agattcagaa cattc 25
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
agtctgagga tgagtctaat ttccg 25
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
gcagcagttc tatgagaaga gct 23
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
gccaacatga cttccgtcaa tg 22
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
cgcggtcatc ttttactttt cg 22
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
cttgtatagc cttatttatc ccgatgactt 30
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
tcgttgcatt tcgaacacac tac 23
<210> 130
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
gtcgtcgacg acgtcgttat at 22
<210> 131
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
gtgatacaat gatcttgacg tgtatcg 27
<210> 132
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
gatccctcgt cggcttctc 19
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
cgtctcagca gaaacagaca ca 22
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
gcggagattg accgagatct tg 22
<210> 135
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
cggacaaaaa gtgtttcaag agca 24
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
gcgcatttca accgtctttt gg 22
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
cctatccaga cactgtcacg agt 23
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
cgttttgggc atcaaggcta tg 22
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
ttgacggcgt taaagacacc 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
gggtatggcc gacacttgta 20
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
ccaccacacc ctgattctca tc 22
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
ttgttcaggg tctagcgatc atg 23
<210> 143
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
gttcggtatg caggagtgga tt 22
<210> 144
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
cgcaataagc aatcttatgg attctgac 28
<210> 145
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
tgggtacatt caactgcacg ta 22
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
tggtacctct gaacacagac gta 23
<210> 147
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
ccctaaagca tgccacatcc tt 22
<210> 148
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcggaagaca tttctgaatt ttgc 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccctgaatgc ggctaatcc 19
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<213> 人工序列
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attgtcacca taagcagcca 20
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caagccagtt atccctgtgg t 21
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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tgtgagccaa ggagttg 17
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<213> 人工序列
<400> 160
gaacgacatg gctacga 17
Claims (10)
1. 一种用于检测病原体的引物组，其特征在于，所述引物组包括至少60对引物对，每对所述引物对由正向引物与反向引物组成，所述引物对选自SEQ ID NO：1~154所示核苷酸；
任选地，所述引物组用于在同一反应体系中，对所述病原体的特异序列进行多重PCR靶向扩增。
2. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括如SEQ ID NO：155~156所示的内参引物。
3.一种用于检测病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR靶向扩增试剂组分、末端修复试剂组分、接头连接试剂组分、文库PCR扩增试剂组分、逆转录试剂组分中的一种或多种；
任选地，所述多重PCR靶向扩增试剂组分包括靶向扩增缓冲液和靶向扩增酶，优选地，所述靶向扩增酶是Ex Taq聚合酶；
任选地，所述末端修复试剂组分包括末端修复缓冲液和末端修复酶，优选地，所述末端修复酶包括T4 DNA聚合酶、T4 PNK和rTaq；
任选地，所述接头连接试剂组分包括连接缓冲液、磷酸激酶、连接酶和接头序列；优选地，所述连接缓冲液中含有聚乙二醇；优选地，所述磷酸激酶是T4 PNK；优选地，所述连接酶是T4 DNA连接酶；优选地，所述接头序列如SEQ ID NO：157~158所示；
任选地，所述文库PCR扩增试剂组分包括PCR反应酶-缓冲液混合液和PCR反应引物；优选地，所述PCR反应酶-缓冲液混合液是KAPA HIFI热启动预混液；所述PCR反应引物如SEQID NO：159~160所示；
任选地，所述逆转录试剂组分包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT和dNTP；优选地，所述逆转录酶是Super Script Ⅱ逆转录酶。
5. 一种用于扩增病原体的多重PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系包括如权利要求1所述的引物组、Ex Taq聚合酶、dNTP和Ex Taq聚合酶的缓冲液；任选地，所述反应体系还包括如SEQ ID NO：155~156所示的内参引物。
6.权利要求1或2所述的引物组、权利要求3或4所述的试剂盒、或权利要求5所述的反应体系在检测脑炎和/或脑膜炎病原体中的应用；
任选地，所述病原体选自阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、单增生李斯特菌、屎肠球菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、头葡萄球菌、结核分枝杆菌属、布鲁氏菌属、人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型、人疱疹病毒3型、人疱疹病毒4型、人疱疹病毒5型、人疱疹病毒6型、新型隐球菌、格特隐球菌、人双埃可毒属、肠道病毒属至少任意二十种以上。
7.一种用于检测病原体的测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1或2所述的引物组对样本核酸提取物进行多重PCR靶向扩增；然后对所述多重PCR靶向扩增的产物进行测序文库构建；
任选地，所述样本来自于脑脊液；
任选地，所述核酸提取物为RNA，所述方法还包括，在所述多重PCR靶向扩增之前，对所述RNA进行逆转录。
8.一种非诊断目的的检测病原体的方法，其特征在于，所述方法包括对权利要求7得到的测序文库进行高通量测序获得测序数据，然后对所述测序数据进行分析以获取病原体检测结果。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述对所述测序数据进行分析，包括：
（a）对所述测序数据进行过滤；
（b）将过滤后的测序数据比对靶标序列数据库，然后筛选比对结果；
（c）任选地，将未比对到所述靶标序列数据库的测序数据比对到宿主参考基因组；
（d）根据靶标序列数据库的比对结果，统计检出靶标的指标；
（e）获取靶标检出序列数，并判断每种病原体是否检出；和
（f）输出检测结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）过滤去除下列序列中的至少之一：（a）与接头序列共有连续10bp以上碱基的序列；（b）读段长度低于预定阈值的序列；所述预定阈值优选为50~55bp；（c）序列中质量值小于5的碱基数占序列总碱基数的比值大于50%的序列；
任选地，所述步骤（b）基于下列中的至少之一筛选比对结果：（a）保留所述测序数据中比对长度占比大于90%的序列；（b）保留所述测序数据中错配碱基数小于5%的序列；（c）保留具有比对特异性的序列，其中所述具有比对特异性的序列为唯一比对序列或多比对结果中满足次优比对分值除以最优比对分值小于0.8的序列，其中所述唯一比对序列是唯一比对到所述病原微生物基因组一个位置上的序列；
任选地，所述步骤（c）中序列比对长度占比达到80%，判断为宿主序列；
任选地，所述步骤（d）中所述检出靶标的指标包括：标准化比对序列数、标准化唯一比对序列数；
任选地，所述步骤（e）中根据如下标准判断每种病原体是否检出：对每种靶标，检出值大于检测阈值为检出；对每种病原体，3个靶标中2个以上靶标检出时为该病原体检出，1-2个靶标中1个以上靶标检出时为该病原体检出；阴性对照中也检出该病原体，则该病原体属于假阳性结果。
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