CN113930487B

CN113930487B - 一种新型多样本多片段dna甲基化检测方法

Info

Publication number: CN113930487B
Application number: CN202110642369.2A
Authority: CN
Inventors: 陈志伟; 许林浩; 王军; 刘鑫; 叶竹佳; 范建兵
Original assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Current assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2041-06-09
Also published as: CN113930487A; WO2022001948A1; US20240240244A1

Abstract

本发明提供了一种新型多样本多片段DNA甲基化检测方法，包括以下步骤：S1、提取样本基因组DNA或游离DNA，对提取的DNA使用重亚硫酸盐进行处理，然后使用特异性引物对处理好的DNA进行依赖甲基化多重PCR扩增；S2、多重PCR产物处理和纯化：对步骤S1获得的多重PCR产物用酶或磁珠进行处理，然后纯化；S3、对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测。上述检测方法可以同时对多样本多基因的DNA甲基化进行检测，对起始DNA量要求低，非常适用于低拷贝数的甲基化片段检测，具有灵敏度高、特异性好、准确度高、检测限低以及检测成本低等优点，且整个检测流程和后续的数据分析步骤更简单更科学。

Description

一种新型多样本多片段DNA甲基化检测方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种新型多样本多片段DNA甲基化检测方法。

背景技术

DNA甲基化可以调控基因表达，因此检测DNA甲基化至少可以为解释基因表达的调控提供一些线索。其次，DNA甲基化已证实参与一系列重要生物学过程，包括早期胚胎发育、基因组印记、X染色体失活、重复序列的沉默以及癌症的发生发展转移。此外，研究表明，DNA甲基化一个非常重要的应用，是可以作为肿瘤的早期筛查和预后的生物标志物。

人类大约有30亿个碱基对，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸上。基因组中大约有2800万个CpG位点，这些CpG位点中，大约60～80％被甲基化，而在一些特定的区域，比如启动子，存在CpG位点富集的序列(CpG岛)，CpG岛通常未被甲基化。但是在肿瘤细胞中，整体甲基化水平降低至20～50％，与正常细胞相比，即可能有10～60％的CpG位点的甲基化状态发生了改变，特别是抑癌基因上，也就是大约280～1680万个CpG位点。

现有的DNA甲基化检测方法主要包括全基因组的DNA甲基化检测和特异性位点甲基化检测。全基因组的DNA甲基化检测主要用于研究层面、寻找差异化甲基化位点等，又可分为基于高通量测序和基于芯片的全基因组DNA甲基化检测方法。特异性位点甲基化检测主要用于转化医学层面，包括甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)、焦磷酸测序和质谱检测。

在实际临床应用和操作过程中，检测基质中的DNA含量一般较少，例如在癌症早筛检测中，血浆中的ctDNA(circulating tumor DNA)含量，在游离DNA(cfDNA)的占比较低(可低至0.01％)。cfDNA的浓度在健康个体血浆中，每毫升约含有0至100ng，平均浓度大约为30ng/mL。而且ctDNA片段长度，一般约为166bp(死亡细胞裂解)或者150-250bp(癌细胞外囊泡分泌)。在此种条件下，传统的通过杂交的方式捕获DNA后再进行高通量测序的方法灵敏性和特异性差。且基于全基因组的甲基化测序方式，流程复杂、后续分析复杂、捕获成本较高。其他通过PCR的方法，比如BSP的方法，因为引物不包含CpG位点，虽然可以测到甲基化，但有两点问题，一是由于不能包含CpG位点，一般的C经过BS转化变成T，所以在实际操作中，特别是CpG岛里面设计引物较困难，存在GC含量低，PCR实际效率差，非特异性产物过多的情况；二是针对于痕量的甲基化片段，因为PCR没有选择性，非甲基化的信号往往会将这部分信号湮没，比如一段序列可能正常细胞分泌了99％但都没有甲基化，而癌细胞就分泌了1％发生甲基化了，所以如果用BSP可能99％因为无法区分噪音还是真实信号，1％这部分信息就会丢失掉。使用MSP，或芯片，仅能覆盖有限的CpG位点(一般目标只有1个位点)，灵活度低。一般CpG岛区域有较多位点会被甲基化，传统方法不能够知道一段序列内的多个位点的CpG情况。

发明内容

基于此，本发明提供一种新型多样本多片段DNA甲基化检测方法，所述检测方法可以同时对多样本多基因的DNA甲基化进行检测，整个检测流程和后续的数据分析步骤简单科学，对起始DNA量要求低，非常适用于低拷贝数的甲基化片段检测，且具有灵敏度高、特异性好、检测限低以及检测成本低等优点。

具体技术方案为：

一种多样本多片段DNA甲基化检测方法，包括以下步骤：

S1、提取样本基因组DNA或游离DNA(cell-free DNA)，对提取的DNA使用重亚硫酸盐进行处理，然后使用特异性引物对处理好的DNA进行依赖甲基化多重PCR(MethylationDependent Multiplex PCR)；其中针对不同基因或不同甲基化位点使用不同的特异性PCR引物；

S2、多重PCR产物处理和纯化：对步骤S1获得的多重PCR产物用核酸内切酶或者DNA片段分选磁珠进行处理，然后进行纯化；

S3、对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测。

本发明所述依赖甲基化多重PCR扩增(Methylation Dependent Multiplex PCR)是指在同一个PCR扩增体系中同时针对多个感兴趣甲基化位点及其附近50-300bp区域进行的PCR扩增，其中感兴趣甲基化位点可位于引物上或扩增子内部。

本发明所述特异性PCR引物是指针对感兴趣的甲基化位点，或其旁边的CpG位点进行设计的引物；所述特异性PCR引物包含亚硫酸氢钠处理后成功转化的甲基化的CpG位点，以保证对甲基化DNA进行特异性扩增。

本发明检测方法可以同时对多样本多基因的DNA甲基化水平进行检测，针对不同基因或不同甲基化位点使用不同的特异性PCR引物，针对不同的样本在检测时使用特异的标签序列来进行区别。

在其中一些实施例中，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98℃ 30s-5min；10-25个循环(98℃ 15s，60±10℃ 15s-10min，68-72℃ 15s-5min)；68-72℃ 0-15min。

在其中一些实施例中，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应优化条件为：98℃30s-5min；10-25个循环(98℃ 15s，60±5℃ 15s-10min，72℃ 15s-5min)；72℃ 0-15min。

在其中一些实施例中，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应优化条件为：98℃30s-5min；10-25个循环(98℃ 15s，60±5℃ 15s-5min，72℃ 15s-5min)；72℃ 0-15min。

在其中一些实施例中，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的扩增方法为降落PCR法。发明人经过研究法发现，在本发明检测体系中使用降落PCR法进行依赖甲基化多重PCR，能有效提高依赖甲基化多重PCR反应的特异性，降低非特异性扩增产物。

在其中一些实施例中，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98℃ 30s；5-10个循环(98℃ 15s，65±3℃(每个循环下降0.2-0.8℃)15s，72℃ 15s)；10-25个循环(98℃ 15s，60±10℃ 15s-10min，68-72℃ 15s-5min)；72℃ 0-15min。

在其中一些实施例中，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98℃ 30s；5-10个循环(98℃ 15s，65±3℃(每个循环后下降0.2-0.8℃)15s，72℃ 15s)；10-25个循环(98℃ 15s，60±5℃ 15s-10min，68-72℃ 15s-5min)；72℃ 0-15min。

在其中一些实施例中，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98℃ 30s；5-10个循环(98℃ 15s，65±3℃(每个循环后下降0.2-0.8℃)15s，72℃ 15s)；10-25个循环(98℃ 15s，60±5℃ 15s-5min，68-72℃ 15s-5min)；72℃ 0-15min。

在其中一些实施例中，优选步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98℃30s；5-10个循环(98℃ 15s，65±3℃(每个循环后下降0.2-0.8℃)15s，72℃ 15s)；15-20个循环(98℃ 15s，60±3℃ 15s，72℃ 15s)；72℃ 15min。

在其中一些实施例中，更优选地，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98℃30s；10个循环(98℃ 15s，65±3℃(每个循环下降0.5℃)15s，72℃ 15s)；15个循环(98℃ 15s，60±3℃ 15s，72℃ 15s)；72℃ 15min。发明人经过研究发现，此多重PCR扩增反应条件下能成功检测到目标基因的数目最多。

在其中一些实施例中，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应酶为Phusion DNA聚合酶、Q5酶、Hieff酶、KAPA DNA聚合酶、Pfu酶、SuperFi酶、相应可兼容尿嘧啶的聚合酶、优选为PhusionU酶、KAPAU酶、Q5U酶、HieffU酶。

在其中一些实施例中，优选步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应酶为PhusionDNA聚合酶。

在其中一些实施例中，更优选地，所述依赖甲基化多重PCR的反应酶为Phusion UHot Start DNA聚合酶。使用Phusion U Hot Start DNA聚合酶能更好地提高本发明检测方法依赖甲基化多重PCR反应的特异性，降低非特异性扩增产物。

在其中一些实施例中，所述降落PCR法为巢式PCR法。

在其中一些实施例中，所述步骤S1中同时对不同基因和参考序列进行依赖甲基化多重PCR。

在其中一些实施例中，所述参考序列选自参考序列1～4中的至少一种：

参考序列1：以SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26为特异性PCR引物进行PCR扩增的片段在EPHA3基因中所对应的序列；

参考序列2：以SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28为特异性PCR引物进行PCR扩增的片段在KBTBD4基因中所对应的序列；

参考序列3：以SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30为特异性PCR引物进行PCR扩增的片段在PLEKHF1基因中所对应的序列；

参考序列4：以SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32为特异性PCR引物进行PCR扩增的片段在SYT10基因中所对应的序列。

在其中一些实施例中，所述参考序列选自参考序列1～4中的至少两种。使用至少两种所述参考序列可以使检测结果更稳定，使不同样本之间的检测结果比较更准确。

在其中一些实施例中，所述不同基因的序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列中的至少一种。

在其中一些实施例中，针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列中的至少一种的依赖甲基化多重PCR扩增的反应条件为：98℃ 30s；10个循环(98℃ 15s，65±3℃(每个循环下降0.2～0.8℃)15s，72℃ 15s)；15～20个循环(98℃ 15s，60±3℃ 15s，72℃ 15s)；72℃15min。

在其中一些实施例中，优选针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列中的至少一种的依赖甲基化多重PCR扩增的反应条件为：98℃ 30s；10个循环(98℃ 15s，65±3℃(每个循环下降0.5℃)15s，72℃ 15s)；15个循环(98℃ 15s，60±3℃ 15s，72℃ 15s)；72℃15min。

在其中一些实施例中，步骤S2所述核酸内切酶处理条件为：37±1℃处理10-15min，处理体系中核酸内切酶的终浓度为1-10U/uL。

在其中一些实施例中，步骤S2所述核酸内切酶处理条件为：37±1℃处理10-15min，处理体系中核酸内切酶的终浓度为3.5-4.5U/uL。

在其中一些实施例中，优选步骤S2所述核酸内切酶处理条件为：37±1℃处理10min，处理体系中核酸内切酶的终浓度为4U/uL。

在其中一些实施例中，所述核酸内切酶为T4核酸内切酶。

在其中一些实施例中，步骤S2所述DNA片段分选磁珠为XP磁珠。

在其中一些实施例中，步骤S2所述纯化为使用磁珠法进行纯化。

在其中一些实施例中，所述磁珠法进行纯化使用的磁珠为XP磁珠。发明人经过研究发现，在本发明检测方法中，使用XP磁珠可获得更好的纯化效果。

在其中一些实施例中，步骤S3利用测序法对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测。

在其中一些实施例中，步骤S3所述测序法包括以下步骤：(1)将步骤S2获得的纯化产物同时进行3'末端修复和3'末端添加碱基A；(2)将步骤(1)获得的产物与测序接头连接；(3)使用接头引物对步骤(2)获得的连接产物进行PCR扩增，得到测序文库；(4)将不同样本制备所得文库按照相同的摩尔数混合，测序。

在其中一些实施例中，所述步骤(3)中PCR扩增的循环数为3-7。优选地，所述步骤(3)中PCR扩增的循环数为7。

在其中一些实施例中，所述步骤(3)中还包括对测序文库进行纯化和质检。

在其中一些实施例中，使用XP磁珠对测序文库进行纯化。

在其中一些实施例中，所述测序法包括二代测序技术与三代测序技术。二代测序技术原理为大规模平行测序(massive parallel sequencing,MPS)，三代测序技术为单分子测序技术。

在其中一些实施例中，所述二代测序技术可以是基于DNA聚合酶合成测序技术(Sequencing by synthesis technology，SBS)、基于DNA连接酶连接测序技术(Sequencingby ligation technology,SBL)。

在其中一些实施例中，所述三代测序技术可以是单分子实时荧光测序技术、纳米孔测序技术、纳米门测序技术、基于DNA水解测序技术。

本发明将上述步骤S3通过测序法对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测的多样本多片段DNA甲基化检测方法命名为依赖甲基化的扩增和测序法(Methylation-Dependent Amplification and Sequencing,MeDAS)。

在其中一些实施例中，步骤S3利用通用阵列法对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测。所述通用阵列(universal array)是指将已知的目标DNA片段(可以是甲基化片段)和未知的核酸序列之间的一方以有序的阵列固定到特定载体上，通过序列互补杂交原理，并将杂交的结果以荧光技术和模式识别分析来检测的技术。检测时不同样本使用特异的标签序列进行区别。

在其中一些实施例中，所述通用阵列可以是微阵列技术(microarray)、珠阵列技术(bead array)、xMAP(Multi-Analyte Profiling)技术、nCounter技术。

在其中一些实施例中，所述样本为生物体液、细胞或组织。

在其中一些实施例中，所述生物体液为人体在正常或病理状态下各个器官和组织分泌的液体。

在其中一些实施例中，所述生物体液为血液、尿液、唾液、汗液、脑脊液、胸腔积水、腹积水。

在其中一些实施例中，所述生物体液优选为血清、血浆、玻璃体、痰、尿、眼泪、汗液、唾液等。

本发明还提供了一种DNA甲基化检测试剂盒。

具体技术方案为：

一种DNA甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列中的至少一种序列的特异性PCR引物，所述引物为：

针对SEQ ID NO.1的特异性PCR引物为SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ IDNO.10所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.2的特异性PCR引物为SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQID NO.12所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.3的特异性PCR引物为SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQID NO.14所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.4的特异性PCR引物为SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQID NO.16所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.5的特异性PCR引物为SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQID NO.18所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.6的特异性PCR引物为SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQID NO.20所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.7的特异性PCR引物为SEQ ID NO.21所示的上游引物和SEQID NO.22所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.8的特异性PCR引物为SEQ ID NO.23所示的上游引物和SEQID NO.24所示的下游引物。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括以下特异性PCR引物中的至少一种：

由SEQ ID NO.25所示的上游引物和SEQ ID NO.26所示的下游引物组成的特异性PCR引物；

和/或，由SEQ ID NO.27所示的上游引物和SEQ ID NO.28所示的下游引物组成的特异性PCR引物；

和/或，由SEQ ID NO.29所示的上游引物和SEQ ID NO.30所示的下游引物组成的特异性PCR引物；

和/或，由SEQ ID NO.31所示的上游引物和SEQ ID NO.32所示的下游引物组成的特异性PCR引物。

在其中一些实施例中，所述试剂盒包括上述特异性PCR引物中的至少两种。

在其中一些实施例中，所述试剂盒包括上述四种特异性PCR引物。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括Phusion DNA聚合酶、T4核酸内切酶、DNA纯化磁珠。

在其中一些实施例中，优选所述Phusion DNA聚合酶为Phusion U Hot Start DNA聚合酶。

在其中一些实施例中，优选所述DNA纯化磁珠为XP磁珠。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括测序文库构建试剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述检测方法引入依赖甲基化多重PCR技术，能快速对感兴趣的甲基化区域进行特异性扩增富集，并且还对依赖甲基化多重PCR技术进行了优化：先使用高保真聚合酶进行依赖甲基化多重PCR扩增，再进一步利用核酸内切酶或DNA片段分选磁珠处理多重PCR产物，然后进行纯化。发明人发现，通过上述优化能有效去除依赖甲基化多重PCR扩增产物中的非特异性产物，避免非特异性产物对后续检测的影响，例如避免非特异性产物在测序过程中产生杂信号和占据测序深度，有效提高后续检测结果的准确性，降低检测限。尤其是当使用Phusion U DNA聚合酶进行依赖甲基化多重PCR时，可以更好地提高本发明依赖甲基化多重PCR反应的特异性。此外，本发明检测方法还使用了合适的参考序列，通过参考序列来对不同甲基化比例的样本的检测结果进行标准化，能平行比较出甲基化的差别，进一步提高检测结果的准确性和可靠性。

本发明通过引入依赖甲基化多重PCR技术并对依赖甲基化多重PCR扩增方法和产物处理方法进行优化，克服了现有甲基化检测方法对起始DNA含量要求高，以及现有多重PCR扩增产物不适用于直接进行后续高通量检测的缺陷，具有灵敏度高、特异性好、准确性高、检测限低和检测成本低的优点，可以检测出0.05％甲基化水平，且检测流程和数据分析步骤更简单更科学，尤其适用于对低拷贝数的甲基化片段进行检测。

附图说明

图1本发明检测方法的流程示意图。

图2为实施例3中SEQ ID NO.5所示序列的两个CpG site的信息。

图3为实施例3中本发明检测方法对SEQ ID NO.5所示序列的两个CpG site的LOQ检测结果图。

图4为实施例3中亚硫酸氢盐修饰后测序法对SEQ ID NO.5所示序列的两个CpGsite的LOQ检测结果图。

图5为实施例4中本发明检测方法和亚硫酸氢盐修饰后测序法对样本CpG位点1ch5_40681550的检测结果图。

图6为实施例4中本发明检测方法和亚硫酸氢盐修饰后测序法对样本CpG位点2ch5_40681569的检测结果图。

图7为使用Q5U酶和Phusion U酶进行依赖甲基化多重PCR扩增获得的产物中二聚体比例检测结果图。

图8为使用传统PCR法和Touchdown PCR法进行依赖甲基化多重PCR扩增获得的产物中二聚体比例和目标测序量比例检测结果图。

图9为使用XP beads和Smart Beads纯化依赖甲基化多重PCR扩增产物后纯化产物中二聚体比例检测结果图。

图10为使用XP beads和Column纯化依赖甲基化多重PCR扩增产物后纯化产物中二聚体比例和目标测序量比例检测结果图。

图11为使用不同多重PCR扩增循环数进行依赖甲基化多重PCR扩增的检测效果对比图。

图12为实施例5中17个靶点在内的不同甲基化浓度的标品上的信号进行很好的线性拟合结果示意图。

图13为实施例6中的ROC Curve结果示意图。

图14为实施例7中的ROC Curve结果示意图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本发明所述测序，包括二代测序技术与三代测序技术。二代测序技术原理为大规模平行测序(massive parallel sequencing,MPS)，在其中一些实施例中，二代测序技术可以是：1.基于DNA聚合酶合成测序技术(Sequencing by synthesis technology，SBS)：代表公司为Illumina(可逆终止测序，reversible terminator sequencing)、Thermo Fisher/Life Technologies(Ion Torrent)，GenapSys，罗氏诊断(454焦磷酸测序)；2.基于DNA连接酶连接测序技术(Sequencing by ligation technology,SBL)，代表公司为华大基因/Complete Genomics(复合探针-锚定分子连接，cPAL)、Thermo Fisher/AppliedBiosystems(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection,SOLiD)。三代测序技术为单分子测序技术，在其中一些实施例中，三代测序技术可以是：单分子实时荧光测序技术(SMRT,Pacific Biosciences)、纳米孔测序技术[Oxford Nanopore Technologies(ONT),Genia Technologies and Stratos Genomics(罗氏诊断)]、纳米门测序技术(Nanogate,Quantum Biosystems)、基于DNA水解测序技术(Sequencing by de-synthesis,pyrophosphorolysis,Base4)。

本发明所述通用阵列(universal array)是指将已知的目标DNA片段(可以是甲基化片段)和未知的核酸序列之间的一方以有序的阵列固定到特定载体上，通过序列互补杂交原理，并将杂交的结果以荧光技术和模式识别分析来检测的技术。在其中一些实施例中，通用阵列可以是：1.微阵列技术(microarray)，代表公司为Affymetrix(Thermo Fisher)/Agilent等；2.珠阵列技术(bead array)，代表公司为Illumina等；3.xMAP(Multi-AnalyteProfiling)技术,代表公司为Luminex等；4.nCounter技术,代表公司为NanoString等。

本发明提供的检测方法的检测流程图如图1所示。

实施例1

本实施例一种多样本多片段DNA甲基化检测方法，包括以下步骤：

S1、提取样本基因组DNA或游离DNA，对提取的DNA使用采用EZDNA Methylation-Gold(ZYMO)试剂盒进行处理，然后使用特异性引物对处理好的DNA进行依赖甲基化多重PCR(Methylation Dependent Multiplex PCR)；PCR反应使用的酶为高保真酶，可选用PhusionDNA聚合酶(例如Phusion Hot Start II DNA Polymerase，Phusion U Hot Start DNAPolymerase)、Q5酶(例如

Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase,

HotStart High-Fidelity DNA Polymerase)、Hieff酶(例如

HG热启动多重PCR酶)、KAPA DNA聚合酶(例如KAPA HiFi Uracil+Kit，KAPA2G快速热启动DNA聚合酶)、Pfu酶或SuperFi酶，本实施例优选Phusion U Hot Start DNA Polymerase；PCR反应扩增方法为降落PCR法；其中针对不同基因或不同甲基化位点使用不同的特异性PCR引物；

S2、多重PCR产物处理和纯化：可选方法1：对步骤S1获得的多重PCR产物用T4核酸内切酶进行处理，处理条件为：37±1℃处理10-15min，处理体系中酶的终浓度为1～10U/uL(优选处理条件为：37±1℃处理10min，处理体系中酶的终浓度为4U/uL)；将酶处理后的PCR产物进行纯化，所述纯化方法为XP磁珠纯化法；可选方法2：直接使用DNA片段分选磁珠进行处理和纯化，其中磁珠为XP磁珠。

S3、利用测序法对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测：(1)将步骤S2获得的纯化产物同时进行3'末端修复和3'末端添加碱基A；(2)将步骤(1)获得的产物与测序接头连接；(3)使用接头引物对步骤(2)获得的连接产物进行PCR扩增，PCR循环数为3-7轮(优选为7轮)，对扩增产物进行纯化，获得测序文库，对测序文库进行质检和定量；(4)将不同样本制备所得文库按照相同的摩尔数混合，利用IlluminaMiSeq/MiSeqDx/NextSeq/NextSeqDx平台对文库进行测序。

本实施例提供的检测方法命名为依赖甲基化的扩增和测序法(Methylation-Dependent Amplification and Sequencing,MeDAS)，能同时对多样本多基因的DNA甲基化进行检测，整个检测流程和后续的数据分析步骤简单科学，对起始DNA量要求低，非常适用于低拷贝数的甲基化片段检测，且具有灵敏度高、特异性好、检测限低以及检测成本低等优点。表1为本发明MeDAS法与现有的甲基化检测方法的特征比较：

表1本发明MeDAS法与现有的甲基化检测方法的比较

表中，MeDAS代表Methylation-Dependent Amplification and Sequencing；MSP代表Methylation Specific PCR；BSP代表Bisulfite Sequencing PCR。

从表1可知，与现有技术相比，本发明提供的MeDAS技术具有通量高、灵敏度高、特异性好、检测限低以及检测成本低等优点。

实施例2

本实施例一种DNA甲基化检测试剂盒，包括针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列的甲基化水平检测试剂，所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列如表2所示：

表2 SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列

上述试剂盒包含以下组分：

(1)针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列的特异性PCR引物，所述特异性PCR引物具体如表3所示：

表3针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列的特异性PCR引物

(2)针对参考序列1-4(Ref1-4)的特异性PCR引物：

具体如表4所示：

表4参考序列1-4具体的特异性PCR引物信息

(3)Phusion U Hot Start DNA Polymerase、T4核酸内切酶、Agencourt AMPureXP beads。

上述试剂盒提供的针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列的特异性PCR引物是发明人经过大量研究和分析后设计得到的，所述检测引物既能保证依赖甲基化多重PCR扩增的灵敏度和特异性，又不会影响后续测序的深度，在2个拷贝～0.05％甲基化检测限上检测到甲基化片段需要的测序深度约小于现有方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)2-3个数量级。

上述试剂盒提供的参考序列1-4(Ref1-4)是发明人经过优化后得出的，在不同样本中表达稳定且不受甲基化水平的影响，非常适合用于对测序数据进行标准化处理，使不同样本间DNA的甲基化水平具有可比性，提高比较结果的准确性和可靠性。

实施例3

本实施例对本发明DNA甲基化检测方法(MeDAS)和亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)的检测效果进行比较。分别利用本发明DNA甲基化检测方法和亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)对实施例2所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列的甲基化情况进行检测。本发明DNA甲基化检测方法使用实施例2所述试剂盒，具体步骤如下：

S1、获得DNA标准品，对DNA标准品使用重亚硫酸盐进行处理，然后对处理好的DNA标准品进行依赖甲基化多重PCR扩增

(1)制备cfDNA mock标准品

1)genomic DNA定量--Qubit HS

a)Qubit溶液配制：

表5 Qubit溶液配方

配方	体积μL
		Qubit dsDNA HS Buffer(QB)	199
Qubit dsDNA HS Reagent(QA)	1
		总体积	200

b)genomic DNA样品的稀释：取1μL DNA样品+9μL EB，将DNA样品稀释10倍，再取1μL稀释后的DNA进行定量。

2)genomic DNA打断

将genomic DNA用EB稀释为约10ng/μL后，取300μL，分别向3支配套打断管(规格为130μL)中各加入50μL(重复两次)，用以下程序进行打断：

表6 cfDNA打断程序

取3μL打断后DNA放4℃保存，待进行浓度测定和2100Bioanalyzer质检。

3)打断后DNA纯化与保存

a)80％乙醇制备

b)纯化步骤：原倍AMPure磁珠室温平衡30min→取240μL与打断后的所有genomicDNA于1.5mL的LoBind管充分涡旋混匀，简单离心→室温孵育5min→上磁力架3-4min至溶液澄清→将上清转移至新的1.5mL LoBind管→重新加入240μl原倍AMPure磁珠→充分涡旋混匀，简单离心→室温孵育5min→上磁力架4min至溶液澄清，吸弃上清→加入1.5mL 80％乙醇洗涤30s，弃上清→加入1.5mL 80％乙醇洗涤30s，弃上清→离心1min，上架至液体澄清，吸余液→开盖晾干至磁珠表面无反光→加100μL EB洗脱，混匀，简单离心，室温孵育2min→上磁力架吸附2min至液体澄清，收集上清至新的1.5mL LoBind管；重复一次洗脱步骤，DNA样品终体积为200μL。

c)保存：-20℃保存。

4)纯化后DNA定量和质检

质检：取1μL纯化后的cfDNA mock样品进行2100Bioanalyzer质检；定量：取1μL进行Qubit HS定量。

(2)混合制备梯度浓度的DNA标准品底物

1)重亚硫酸盐处理基因组DNA制备100％methylation control

采用EZDNA Methylation-Gold(ZYMO)试剂盒处理HG DNA以及cfDNA mock，具体步骤如下：

a)相关Buffer制备：

a.CT Conversion Reagent的制备：添加900uL水，50uL的Μ-Dissolving Buffer，和300uL的M-Dilution Buffer到一管CT Conversion Reagent中，在室温下溶解并且在摇床上摇动I0min；

b.M-WASH BUFFER的制备：加入24mL无水乙醇至M-WASH BUFFER瓶中，并在瓶盖上做好标记；

b)在PCR管中添加：

a.DNA量500ng，根据浓度算好体积，用水来补至20μL；

b.130uL的CT Conversion Reagent：轻弹试管或移液器操作来混合样品；

c)将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作：98℃放置10min，64℃放置14h；

d)将柱子放入Collection Tube中，并加入600uL的M-Binding Buffer，并将步骤2的样品加入到柱子中，盖上盖子将柱颠倒数次来混合样品；

e)全速(>10,000x g)离心30s，弃废液；

f)添加200uL的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30s；

g)添加200uL的M-Desphonation Buffer到柱中并且在室温(20-30℃)下放置15-20min；

h)全速离心30s，弃废液；

i)加200uL的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30s；

j)再添加200uL的M-Wash Buffer，并且离心30s；

h)直接添加25uL的M-Elution Buffer到柱基质中，将柱放置在1.5mL的管中，全速离心来洗脱DNA，得到最终转化产物(-20℃暂时储存，可保存1周)；

i)通过测序分析，通过7-10个CpG、CHG、CHH位点判断标准品中甲基化转化程度。

2)通过0％methylation control和100％methylation control混合制备梯度标准品：0％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、100％。

(3)针对实施例2所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列和参考序列1-4分别进行本发明依赖甲基化多重PCR和Multiplex Bisulfide-specific PCR(多重BSP)。其中，本发明针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列的依赖甲基化多重PCR引物如实施例2所示，针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列的多重BSP引物如表7所示，针对参考序列1-4的引物如实施例2所示。

表7多重BSP引物

本发明依赖甲基化多重PCR扩增体系如表8所示，扩增程序如表9所示：

表8本发明依赖甲基化多重PCR扩增体系

表9本发明依赖甲基化多重PCR扩增程序(Touchdown法)

BSP检测体系如表10所示，检测程序如表11所示：

表10多重BSP检测体系

表11多重BSP检测程序

S2、PCR产物处理和纯化

(1)对上述的依赖甲基化多重PCR产物用T4核酸内切酶进行处理，处理条件为：37±1℃处理10min，处理体系终T4核酸内切酶的终浓度为4U/uL；

(2)将T4核酸内切酶处理后的不同样本的PCR产物分别使用Agencourt AMPure XPbeads纯化，具体步骤如下：

a)将AMPure XP beads置于室温下平衡至少30min；

b)向1.5mL离心管中加入50ng待建库的DNA，再加入90uL(1.8X)AMPure XP beads，在Vortex上混勾并室温放置5min；

c)将离心管放在磁力架上直至溶液澄清(大约3-5min)；

d)保持离心管在磁力架上，小心弃掉离心管中的上清；

e)继续保持离心管在磁力架上，加入200μL的80％乙醇；

f)将管子放置1min，使所有beads沉淀，弃掉乙醇，重复e)+f)一次；

g)简单离心，上架至液体澄清，吸余液，在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失；

h)加55uL EB洗脱，混匀，室温孵育5min；

j)简单离心，上架吸附3-5min至液体澄清，收集上清(共50uL，挑选个别样本2uL测Qubit后再补齐50uL)。

S3、利用测序法对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测

使用NEB文库制备试剂盒Z1901S/L进行文库构建，不同样本使用特异的标签序列进行区别，具体步骤如下：

(1)将步骤S2获得的纯化产物同时进行3'末端修复和3'末端添加碱基A。

将上一步得到的DNA纯化产物按下表在1.5mL离心管中配制末端修复和加A反应体系：

表12末端修复和加A反应体系

反应程序如下：20℃,30min→65℃,30min→4℃,hold，热盖：85℃，体积60μL。

(2)将3'末端添加碱基A的产物连接测序接头，以便获得测序接头连接产物。

将上一步得到的产物直接按下表在1.5mL离心管中配制连接反应体系：

表13测序接头连接反应体系

反应程序如下：20℃,15min→4℃,hold，关闭热盖，体积100μL。

反应完后使用Agencourt AMPure XP beads纯化，最后用20uL EB洗脱DNA并收集上清液(15uL)。

(3)将测序接头连接产物进行PCR扩增，其中PCR循环数为7轮，获得测序文库，反应体系如下：

表14 Indexing PCR反应体系

反应程序如下：98℃,30s→7个循环【98℃,10s→65℃,75s】→65℃,5min→4℃,hold，热盖105℃，体积50μL。

反应完后使用Agencourt AMPure XP beads纯化，最后用35uL EB洗脱DNA并收集上清液(30uL)。

定量：制备得到的文库用

2.0(Invitrogen)进行定量，-20℃保存。

2100质检：用于2100检测的文库浓度范围：100pg/uL-10ng/uL，按说明书《5.2100_HighSensitivityDNA_QSG》进行操作。

(4)二代高通量测序

将不同样本制备所得文库按照相同的摩尔数混合，然后进行二代高通量测序，包括以下步骤：

1)样品Pooling

用Qubit测量文库的质量浓度(ng/uL)，通过2100确定文库的平均长度(bp)，根据以下公式进行质量浓度和摩尔浓度的换算。混合文库上机，现将文库按照上机数据量比例混合，即pooling，再计算混合文库的理论摩尔浓度。

注：YG001-047文库平均长度为350bp。

2)将样品使用Illumina MiSeq PE-300程序进行单末端测序；MiSeq产出的测序结果是fastq形式的DNA序列，通过测序文库标签(Index)、样本标签序列(barcode)将测序序列对应到每个样本，然后计算每个样本所测片段每个CG位点的甲基化状态。

检测结果如下：

(1)本发明检测方法比亚硫酸氢盐修饰后测序法具有更低的LOQ-Hypothesis：本发明检测方法可以检测到0.05％甲基化(平均测序深度仅需100-200X，随浓度上升检测信号呈线性趋势)，而亚硫酸氢盐修饰后测序法检测限在0.5％甲基化之上(测序深度虽然上万X，但仍难以有线性关系出现)。以SEQ ID NO.5所示序列的两个CpG site的检测结果为例，示例位点信息如图2所示，本发明方法检测两个CpG site的LOQ情况如图3所示，测序深度平均每个梯度在100-200X；亚硫酸氢盐修饰后测序法检测相同两个CpG site的LOQ情况如图4所示，测序深度平均每个梯度大于9500X。

(2)本发明检测方法与亚硫酸氢盐修饰后测序法相比具有更低的LOD-Hypothesis：以SEQ ID NO.7所示序列的ch1_63795447(-)和chr1_6379497(-)两个CpG位点为例，在2copies这个LOD梯度，本发明检测方法在上千X测序深度可以稳定检出两个位点的甲基化情况，但是亚硫酸氢盐修饰后测序法即使是在～40000X的深度，仍然无法检出(检测出的C在测序噪音的区间)，具体如表15所示：

表15本发明检测方法与BSP的LOD-Hypothesis

实施例4

本实施例分别利用本发明所述检测方法和亚硫酸氢盐修饰后测序法对3例临床肺癌组织样本及3例对照组织样本的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示8个序列的甲基化水平进行检测，具体检测步骤如下：

S1、提取临床肺癌组织样本及对照组织样本基因组DNA，对提取的DNA使用重亚硫酸盐进行处理，然后对处理好的DNA进行依赖甲基化多重PCR扩增：

利用Qiagen-QIAamp-DNA-FFPE组织试剂盒(Qiagen，Cat#56404)提取样本基因组DNA，提取步骤根据试剂盒说明书进行。提取得到的DNA按实施例3所述方法进行重亚硫酸盐处理以及依赖甲基化多重PCR扩增。

步骤S2和S3同实施例3所述。

检测结果表明，本发明检测方法可以在上千X的测序深度检测到肺癌与正常标本中的甲基化显著差异，而亚硫酸氢盐修饰后测序法则不可以。以SEQ ID NO.5所示序列的两个CpG site(CpG位点1ch5_40681550、CpG位点2ch5_40681569)的检测结果为例(所述两个CpG已知在肺癌组织中甲基化上调)，CpG位点1ch5_40681550的检测结果如图5所示，CpG位点2ch5_40681569的检测结果如图6所示。由图5和图6可知，使用本发明方法，在2000X的测序深度，即可发现检测位点在肺癌组织中标本中有明显的差别，而使用BSP的方法，在10倍的测序深度，即20000X深度，也无法有效检测到正常标本与肺癌标本的差别。

对比例1

本对比例一种DNA甲基化检测方法，除了步骤S1中使用Q5酶进行依赖甲基化多重PCR扩增外，其他与实施例3中本发明DNA甲基化检测方法相同，其中，Q5酶的用量与PhusionDNA聚合酶的用量相同。本发明检测方法在依赖甲基化多重PCR扩增时使用高保真酶Phusion DNA聚合酶(例如Phusion Hot Start II DNA Polymerase，Phusion U Hot StartDNA Polymerase)、Q5酶(例如

Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase,

HotStart High-Fidelity DNA Polymerase)、Hieff酶(例如Hieff

HG热启动多重PCR酶)、KAPA DNA聚合酶(例如KAPA HiFi Uracil+Kit，KAPA2G快速热启动DNA聚合酶)、Pfu酶或SuperFi酶，均能取得较好的多重扩增效果；其中，Phusion DNA聚合酶的多重扩增效果最好，本对比例以Phusion DNA聚合酶(优选Phusion U Hot Start DNA Polymerase)和Q5酶(优选

Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase)为例进行多重扩增效果的比较。

分别利用本对比例DNA甲基化检测方法和实施例3本发明DNA甲基化检测方法中的依赖甲基化多重PCR法对10％甲基化cfDNA mock标准品中50个不同的基因进行依赖甲基化多重PCR扩增，PCR测试统一条件为：98℃ 30s；18个循环(98℃ 15s，60℃ 2min，72℃1min)；72℃ 15min。

通过2100分析，根据片段的长度范围来计算二聚体的比例，并比较两种扩增方法获得的扩增产物中二聚体的比例。

结果如图7所示，结果表明，与使用Q5酶进行依赖甲基化多重PCR扩增相比，使用Phusion DNA聚合酶(实施例3所述本发明检测方法中的依赖甲基化多重PCR法)进行依赖甲基化多重PCR扩增能有效降低扩增产物中二聚体的比例，使多重PCR扩增产物更利于后续的检测。

对比例2

本对比例一种DNA甲基化检测方法，除了步骤S1中使用传统PCR法进行多重PCR扩增外，其他与实施例3中本发明DNA甲基化检测方法相同，所述传统PCR法的反应程序如表16所示：

表16传统PCR法反应程序

分别利用本对比例DNA甲基化检测方法和实施例3本发明DNA甲基化检测方法中的依赖甲基化多重PCR法对100％甲基化cfDNA mock标准品中50个不同的基因进行依赖甲基化多重PCR扩增，比较两种扩增方法获得的扩增产物中引物二聚体的比例以及目标测序量的比例。

结果如图8(图中Normal PCR代表传统PCR法，Touchdown PCR代表降落PCR法)所示，结果表明，与使用传统PCR法进行依赖甲基化多重PCR扩增相比，使用降落PCR法(本发明检测方法的依赖甲基化多重PCR法)进行依赖甲基化多重PCR扩增能有效降低扩增产物中二聚体的比例(可降低高达50％的二聚体比例含量)，使多重PCR扩增产物更利于后续的测序检测，提高目标基因测序量的比例(目标基因测序量可提升约40％)。

对比例3

本对比例一种DNA甲基化检测方法，除了步骤S2中使用Smart Beads纯化T4核酸内切酶处理后的依赖甲基化多重PCR扩增产物外，其他与实施例3中本发明DNA甲基化检测方法相同。所述使用Smart Beads纯化多重PCR扩增产物的步骤如下：取50uL DEPC加入至50uLPCR产物→Smarter磁珠室温平衡30min→混匀后取220uL(2.2X)与样品Votex混匀→室温孵育5min→简单离心，上磁力架吸附5min至液体澄清，吸弃上清→200uL80％乙醇漂洗30s，弃上清→200μL 80％乙醇漂洗30s，弃上清→简单离心，上架至液体澄清，吸余液→开盖晾干至磁珠表面无反光→加55uL EB洗脱，混匀，室温孵育5min→简单离心，上架吸附3-5min至液体澄清，收集上清(共50uL，挑选个别样本2uL测Qubit后再补齐50uL)。

分别利用本对比例DNA甲基化检测方法和实施例3本发明DNA甲基化检测方法中的纯化方法对10％甲基化cfDNA mock标准品中50个不同的基因的依赖甲基化多重PCR扩增产物进行纯化，比较两种纯化方法获得的扩增产物中二聚体的比例。

结果如图9所示，结果表明，与使用Smart Beads进行依赖甲基化多重PCR扩增产物的纯化相比，使用XP Beads(本发明检测方法中的纯化方法)进行依赖甲基化多重PCR扩增产物的纯化能有效降低扩增产物中二聚体的比例，使纯化后的多重PCR扩增产物更利于后续的检测。

对比例4

本对比例一种DNA甲基化检测方法，除了步骤S2中使用纯化柱纯化T4核酸内切酶处理后的依赖甲基化多重PCR扩增产物外，其他与实施例3中本发明DNA甲基化检测方法相同。所述使用纯化柱(QIAGEN公司)纯化多重PCR扩增产物的步骤如下：五倍体积bindingsolution加入PCR反应产物并颠倒均匀→转移到DNA recovery column，室温放置2min，8,000rpm离心1min→倒掉收集管中废液→重复一次→加入wash solution洗脱一次，12,000rpm离心1min→加入50uL的elution buffer，放置2min后12,000rpm离心1min。

分别利用本对比例DNA甲基化检测方法和实施例3本发明DNA甲基化检测方法中的纯化方法对10％甲基化cfDNA mock标准品中50个不同的基因的依赖甲基化多重PCR扩增产物进行纯化，比较两种纯化方法获得的扩增产物中二聚体的比例以及目标测序量的比例。

结果如图10(图中Column代表纯化柱纯化组)所示，结果表明，与使用纯化柱进行依赖甲基化多重PCR扩增产物的纯化相比，使用XP Beads(本发明检测方法中的纯化方法)进行依赖甲基化多重PCR扩增产物的纯化能有效降低扩增产物中二聚体的比例，使纯化后的多重PCR扩增产物更利于后续的测序检测，提高目标测序量的比例。

对比例5

本对比例一种DNA甲基化检测方法，除了步骤S1中依赖甲基化多重PCR扩增的循环数不同外，其他与实施例3中本发明DNA甲基化检测方法相同，本对比例进行了2种不同条件的多重PCR扩增，分别为：(1)98℃ 30s；10个循环(98℃ 15s，65℃(每个循环下降0.5℃)15s，72℃ 15s)；17个循环(98℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s)；72℃ 15min；(2)98℃ 30s；10个循环(98℃ 15s，65℃(每个循环下降0.5℃)15s，72℃ 15s)；20个循环(98℃ 15s，60℃15s，72℃ 15s)；72℃ 15min。本发明检测方法在依赖甲基化多重PCR扩增时扩增循环数为15～20时均能实现检测，尤其是当扩增循环数为15时能成功检测到目标基因数目是最多。

分别利用本对比例2种DNA甲基化检测方法和实施例3中本发明DNA甲基化检测方法中的依赖甲基化多重PCR法对不同甲基化cfDNA mock标准品(0.5％、1％、5％和10％)中的153个不同基因进行依赖甲基化多重PCR及后续测序分析比较，结果如图11所示，15个循环数在0.5％、1％、5％和10％的甲基化浓度条件下，能成功检测到目标基因数目明显多余17和20个循环数，其没检测到的目标基因数目是最少的。

实施例5

本实施例对本发明所述DNA甲基化检测方法(MeDAS)在不同甲基化程度的人类细胞系基因组DNA(genomic DNA)的检测效果进行评估，具体实施步骤如下：

(1)制备不同甲基化梯度的基因组DNA标品：0％和100％的人类基因组DNA标品从Zymo公司购买(Cat#D5014),其中0％的标品源为HCT116[DNMT1(-/-)DNMT3b(-/-)]细胞系；100％的标品源为0％的标品进行相关甲基化酶处理获得且经过相关测序验证。25％和50％的标品由0％与100％的标品按比例混合而成；

(2)本实施例针对基因组上32个随机挑选CpG位点进行依赖甲基化多重PCR引物设计，详见下表：

(3)之后，对0％25％50％和100％的标品按实施例3所述方法进行重亚硫酸盐处理以及依赖甲基化多重PCR扩增，步骤S2和S3同实施例3所述。

检测结果表明，本发明检测方法对包含cg16673106，cg25381667，cg24016939，cg22101924，cg21715963，cg16712637，cg15811719，cg14603466，cg14589148，cg13119884，cg12622139，cg12180984，cg07696033，cg06080005，cg04234680，cg03556653，cg0259633117个靶点在内的不同甲基化浓度的标品上的信号进行很好的线性拟合(R^2>0.8)，如图12所示。该结果显示，本发明所述检测方法可以在细胞系基因组DNA上进行相关靶点甲基化程度的高通量、有效检测。

实施例6

本实施例对本发明所述DNA甲基化检测方法(MeDAS)在胃癌患者的血液标本中标志物进行检测评估，用于胃癌的早筛早诊检测，具体实施步骤如下：

1.全血处理：本实施例共对152例胃镜无胃癌的正常人以及109例胃癌病人的血浆样本进行检测

1.1利用EDTAK2抗凝真空采血管(BD，Cat#367525)采集10mL全血，充分混匀，避免出现溶血，并在4-6小时内对全血进行血浆分离处理。

1.2全血于低速离心机进行4℃，1600g，15min离心处理，小心吸取上层血浆，避免吸取中间的白膜层，所得血浆再次于高速离心机进行4℃，16000g，10min离心处理，获得所需样品血浆。

2.对血浆进行cfDNA的提取

具体方法：血浆DNA提取具体操作步骤按照Thermo Fisher公司的MagMAX^TM Cell-Free DNA Isolation Kit说明书进行。

3.对提取的cfDNA进行亚硫酸盐转化

将提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo DNA Methylation-Direct MagPrep的protocol进行，其中，投入的cfDNA范围在5-20ng，本实施例优选在10ng。亚硫酸氢盐转化的产物全部用于进行多重甲基化扩增。

4.对转化后的cfDNA进行特定多个标志物的多重甲基化扩增

转化后的产物全部进行多重甲基化扩增，其中的反应组分为通过组织筛选到的胃癌差异性103种标志物的引物组合，其中浓度在50-200nM，镁离子的浓度在2-5mM，本实施例优选在3mM，dNTP mix浓度在100-600uM，本实施例优选在200uM，采用的酶为KAPA2G FastMultiplex PCR Kit(Roche,Cat#KK5802)。具体的反应条件为：预变性，95℃ 5min,15-30个循环(变性，95℃ 15s,退火，58-66℃，本实施例优选63℃，4min。)，优选20个循环。

多重反应体系配制如下：

5.对多重甲基化扩增产物进行文库构建

利用NEB

Ultra^TMII DNA Library Prep Kit for

与

Multiplex Oligos for

(Dual Index Primers Set 1)对多重产物文库构建。相关操作见试剂盒说明书。

6.按照等量的原则，对样本进行pooling处理，并上测序仪测序、进行相关统计分析。

实验结果：选取全部的103个标志物利用随机森林模型进行建模分析，按照7：3的切分，进行100次重复，在99％的特异性下，测试集的1期的检测灵敏度为87.5％，2期的检测灵敏度为92.9％，3期的检测灵敏度为77.8％，4期的检测灵敏度为86.7％，对于所有的结直肠癌样本，检测的整体灵敏度为85.3％。整体的AUC为0.974。表明了这些标志物在该方法下可用于胃癌的早期筛查。具体的ROC Curve请见图13。

实施例7

本实施例对本发明所述DNA甲基化检测方法(MeDAS)在乳腺癌患者的血液标本中标志物进行检测评估，用于乳腺癌的早筛早诊检测，具体实施步骤参照补充本发明实施例2，对30例正常人以及30例乳腺癌病人的血浆样本进行检测。通过组织中筛选到全部的54个甲基化标志物利用随机森林模型进行建模分析，按照7：3的切分，进行100次重复，在99％的特异性下，测试集的11个1期样本的检测灵敏度为54.5％，15个2期样本的检测灵敏度为26.7％，4个3期样本的检测灵敏度为25％。对于所有的乳腺癌样本，检测的整体灵敏度为36.7％。整体的AUC为0.948。表明了这些标志物在该方法下可用于乳腺癌的早期筛查。具体的ROC Curve请见图14。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市基准医疗有限责任公司

<120> 一种新型多样本多片段DNA甲基化检测方法

<150> CN2020106091796

<151> 2020-06-29

<160> 112

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tgccgctaga agcaggcgtc acagtgcccc cagagtgctt gtcagtctta gaaacagagg 60

catcggaaga caagcgt 77

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gctagtcaca gcctggcgcc tggtgtcccc tcccttccca agccccctca gcttttccac 60

tgccaccggc gtacaagcaa gtgc 84

<210> 3

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtcatcggca tgctcagtgc cgtggtcgcc agcatcatcg agtctattgg tgactactac 60

gcctgtgcac ggctgtcc 78

<210> 4

<211> 118

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttgcagcggc ctcagctggc ggggcctcct cccctgcttt cgccacccgg cgcctcgccc 60

ctcgaccccg cggcagctgg gcccgggcgc tctgcttccc tcggcccttt gtggctct 118

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cctcacgctc tttgcagtct atgcgtccaa cgtgctcttt tgcgcgctgc ccaacatggg 60

tctcggtagc 70

<210> 6

<211> 73

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

agcactgcgc tgcgacctag ttttcccttt ggaatcaggt cctctctcct gcgtttacat 60

tggcctctcc cac 73

<210> 7

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ccacatcacg aggcaagaag gaaatggggc cgtcggtccc cgcagaacca ctcatcgccg 60

ggctagag 68

<210> 8

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ccagtgtaac acccagcgct gctgattggc tcccgtctcg gctctgggtc gcctggacac 60

cgtgattgg 69

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

acgcttatct tccgatacct ctatt 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tgtcgttaga agtaggcgtt atagtg 26

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gctaatcaca acctaacgcc taat 24

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gtatttgttt gtacgtcggt ggtagt 26

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ggatagtcgt gtataggcgt agtagtt 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

atcatcgaca tactcaatac cgtaatc 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ttacaacgac ctcaactaac gaaac 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

agagttataa agggtcgagg gaagta 26

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cctcacgctc tttacaatct atacg 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gttatcgaga tttatgttgg gtagc 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

aacactacgc tacgacctaa ttttc 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gtgggagagg ttaatgtaaa cgtag 25

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ctctaacccg acgataaata attctac 27

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

ttatattacg aggtaagaag gaaatgg 27

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

ttaattacgg tgtttaggcg attta 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

ccaatataac acccaacgct actaa 25

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

ggatttatta ggtgtgtaat gttatggatt 30

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

actccacata aatcttctaa actaaattcc t 31

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

tttgtatgtg gtgggagggt tt 22

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

acaaaaaaac acaccactcc caa 23

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

gtagttttag atggtttttt gagttgga 28

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

cactcccatc ctatcttccc tctata 26

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

gaggtaaatg taggttttta gtgttgattt t 31

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

ctttatcctc ccaatactaa ttattatttc tcc 33

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

gagtgtttgt tagttttaga aatagagg 28

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

ggtaactcca ctccaactta ca 22

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

ttgggaaggg aggggatatt agg 23

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

ccccctctct ttcaacttaa ataaac 26

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

ggggtggggt ataggatagt 20

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

tcccacaatt caataaaaac tacc 24

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

aattggaaaa taaattagag ttataaaggg 30

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

aaacctcctc ccctactttc 20

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

ggtaggtgtt tgggtattgt a 21

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

ggatacctat ttctacaacc actac 25

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

gagagaggat ttgattttaa aggga 25

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

tccaaataca ttcactaaaa catttccaa 29

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

aggtaagaag gaaatggggt 20

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

aactataaac ctaaacccta aaactccc 28

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

ggtttttatt gggttagttt gg 22

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

taaccaccca aaccctacc 19

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

gagtaggtag agtcggggac 20

<210> 50

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

acttctacaa ctaaattcga aaacgtc 27

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

ttttgggcgt agagtagcgg tt 22

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

ctctaaatct cgataaaact cgcat 25

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

acgcgcgtcg gaggatttc 19

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

aatcgccacc cgaacgaacg 20

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 55

ttgtaggtta gggagattac gttt 24

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 56

ctatctctat atctctatct cccg 24

<210> 57

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 57

gcggtttagt atcggtggga gatcgt 26

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 58

taaaccaaaa tcgaaaatcg cgacc 25

<210> 59

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 59

ttacgtcgga ggaggtatta acgaga 26

<210> 60

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 60

cttaaaaatc tacccacaac aacatcgaaa cg 32

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 61

tttttttaga tacgtgcggt 20

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 62

cctctctact aactaaaccc ctttatacta 30

<210> 63

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 63

tcggttaatt aatttgggag gcgaaa 26

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 64

gacgcgatac gactcactcc gcta 24

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 65

gtagtttcgg tagaggcgtt t 21

<210> 66

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 66

ctactaaatt actaaacgaa tcgaaa 26

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 67

ggtttaaaat tcgagaaaat aacg 24

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 68

acgcctcaaa aactccgaaa 20

<210> 69

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 69

gagttatagt gagtcggtta cgtaaatagc ga 32

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 70

attacttatc aacgccgaca aactaccgct 30

<210> 71

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 71

ttacgttatt ggttggaggg tgcg 24

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 72

ctaactaaac cgcgcgaacg 20

<210> 73

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 73

agagttatag tgagtcggtt acgtaaatag cg 32

<210> 74

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 74

cttattactt atcaacgccg acaaactacc gc 32

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 75

gtagttgagt tgtaggatgt aagcg 25

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 76

ccaaacccta ctaaaacccg 20

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 77

tttaaggtag gggattttcg g 21

<210> 78

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 78

aaaatcctat caacccttta aaactcgaa 29

<210> 79

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 79

cgtaggtagg tgaaagtagg c 21

<210> 80

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 80

gaacttcctc tctattcccc c 21

<210> 81

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 81

ttatagaaat taggaggcgc gta 23

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 82

gcaactcctc taaaccgaac 20

<210> 83

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 83

agatattttt aaaaggtagc gaaa 24

<210> 84

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 84

acactacctc tccaacataa aaacg 25

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 85

agttataacg tattgaagtt gcg 23

<210> 86

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 86

ttattataaa cgctcaaatr gaaaaa 26

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 87

gtaggggtag ggattacggt 20

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 88

ttaatctcct aaacaacaat atataaccga 30

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 89

gttttgagtc gtacgcgttg 20

<210> 90

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 90

cttaaaaacc aaaatcctcc ga 22

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 91

tagtagcgcg gagttggttt 20

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 92

actactacca ccgctaccgc 20

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 93

taaagggaat gtggggtttc 20

<210> 94

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 94

cgcttccttc tcttaaacta aaaa 24

<210> 95

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 95

agaatttcgt ttagggtagg gc 22

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 96

gatacgaatt tctaatacgc taacc 25

<210> 97

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 97

atttagattg ttagtagcgg g 21

<210> 98

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 98

aaaacacaaa ccgaaacaaa ac 22

<210> 99

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 99

tataataagg tgatgtgtta ggaagc 26

<210> 100

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 100

aaaacaaaca aaaacaaacg ta 22

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 101

aaagagggga gagagttcgc 20

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 102

ctatatcctc gaccccgatt 20

<210> 103

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 103

agtaatcgta gggtagtgga cgggg 25

<210> 104

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 104

ctctaaaacg aactaccctt aaacgcgcc 29

<210> 105

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 105

aggtacgtga tgaaattttg gt 22

<210> 106

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 106

gaaatttaac gcccaatata aacc 24

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 107

tcgtggaagg aagtacgttt 20

<210> 109

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 109

cgacataaaa ttcaactaaa taaccg 26

<210> 109

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 109

gaattagagc gattcgggac 20

<210> 110

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 110

gtcaaaactc ccgcttcata tt 22

<210> 111

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 111

tagtgagtag agaaagacgt acgaaa 26

<210> 112

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 112

gcctatctac accctatcgc c 21

Claims

1.一种非疾病诊断目的的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取样本基因组DNA或游离DNA，对提取的DNA使用重亚硫酸盐进行处理，然后使用特异性引物对处理好的DNA进行依赖甲基化多重PCR；其中针对不同基因或不同甲基化位点使用不同的特异性PCR引物；

S3、对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测；

步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的扩增方法为降落PCR法；

所述依赖甲基化多重PCR的反应酶为Phusion DNA聚合酶；

步骤S2所述DNA片段分选磁珠为XP磁珠；

所述纯化为使用磁珠法进行纯化，其中磁珠为XP磁珠。

2.根据权利要求1所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述样本包括生物组织样品、细胞样品或流体样品。

3.根据权利要求2所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述样本为血液、玻璃体、痰、尿、眼泪、汗液、唾液。

4.根据权利要求1所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98 ℃ 30 s-5 min；10-25个循环。

5.根据权利要求4所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，每个循环为：98 ℃ 15 s，60±10 ℃ 15 s-10 min，68-72 ℃ 15 s-5 min；68-72 ℃ 0-15 min。

6.根据权利要求4所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98 ℃ 30 s；5-10个循环，每个循环为：98 ℃ 15 s，65±3 ℃，且每一个循环后下降0.2-0.8 ℃，15 s，72 ℃ 15 s；10-25个循环，每个循环为：98℃ 15 s，60±10 ℃ 15 s-10 min，68-72 ℃ 15 s-5 min；72 ℃ 0-15 min。

7.根据权利要求1~6任一项所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤S1中同时对不同基因和参考序列进行依赖甲基化多重PCR。

8.根据权利要求7所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述参考序列选自参考序列1~4中的至少一种：

9.根据权利要求8所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述参考序列选自参考序列1~4中的至少两种。

10.根据权利要求1所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述不同基因的序列选自SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.8所示序列中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，针对SEQID NO.1~ SEQ ID NO.8所示序列中的至少一种的依赖甲基化多重PCR扩增的反应条件为：98 ℃ 30 s；10个循环，98 ℃ 15 s，65±3 ℃，且每个循环后下降0.2~0.8 ℃，15 s，72 ℃15 s；15-20个循环，每个循环98 ℃ 15 s，60±3 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s；72 ℃ 15 min。

12.根据权利要求1所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，步骤S2所述核酸内切酶处理条件为：37±1 ℃处理10~15 min，处理体系中核酸内切酶的终浓度为 1-10 U/uL。

13.根据权利要求12所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述核酸内切酶为T4核酸内切酶。

14.根据权利要求1所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，步骤S3利用测序法或通用阵列法对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测。

15.根据权利要求14所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，步骤S3所述测序法包括以下步骤：（1）将步骤S2获得的纯化产物同时进行3'末端修复和3'末端添加碱基A；（2）将步骤（1）获得的产物与测序接头连接；（3）使用接头引物对步骤（2）获得的连接产物进行PCR扩增，得到测序文库；（4）将不同样本制备所得文库按照相同的摩尔数混合，测序。

16.一种DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求1-15任一项所述多样本多片段DNA甲基化检测方法进行检测，所述试剂盒包括针对SEQ ID NO.1~ SEQ IDNO.8所示序列中的至少一种序列的特异性PCR引物，所述引物为：

针对SEQ ID NO.1的特异性PCR引物为SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.2的特异性PCR引物为SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ IDNO.12所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.3的特异性PCR引物为SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ IDNO.14所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.4的特异性PCR引物为SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ IDNO.16所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.5的特异性PCR引物为SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ IDNO.18所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.6的特异性PCR引物为SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ IDNO.20所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.7的特异性PCR引物为SEQ ID NO.21所示的上游引物和SEQ IDNO.22所示的下游引物；

和/或，针对SEQ ID NO.8的特异性PCR引物为SEQ ID NO.23所示的上游引物和SEQ IDNO.24所示的下游引物。

17.根据权利要求16所述的DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下特异性PCR引物中的至少一种：

18.根据权利要求 16或17所述的DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Phusion DNA聚合酶、T4核酸内切酶、和DNA纯化磁珠。

19.一种DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求1至6中任一项或权利要求12至15中任一项所述多样本多片段DNA甲基化检测方法进行检测，包括针对以下CpG位点中至少一对引物：

针对cg16673106的SEQ ID NO.49和50；

针对cg14477452的SEQ ID NO.51和52；

针对cg12622139的SEQ ID NO.53和54；

针对cg25497529的SEQ ID NO.55和56；

针对cg06080005的SEQ ID NO.57和58；

针对cg14242042的SEQ ID NO.59和60；

针对cg21715963的SEQ ID NO.61.和62；

针对cg07959338的SEQ ID NO.64和65；

针对cg22101924的SEQ ID NO.66和67；

针对cg21542248的SEQ ID NO.68和69；

针对cg25381667的SEQ ID NO.70和71；

针对cg25999722的SEQ ID NO.72和73；

针对cg14589148的SEQ ID NO.74和75；

针对cg24496978的SEQ ID NO.76和77；

针对cg24016939的SEQ ID NO.78和79；

针对cg11679177的SEQ ID NO.80和81；

针对cg03556653的SEQ ID NO.82和83；

针对cg02596331的SEQ ID NO.84和85；

针对cg13119884的SEQ ID NO.86和87；

针对cg23516634的SEQ ID NO.88和89；

针对cg07696033的SEQ ID NO.90和91；

针对cg13552710的SEQ ID NO.92和93；

针对cg24876786的SEQ ID NO.94和95；

针对cg15811719的SEQ ID NO.96和97；

针对cg06123396的SEQ ID NO.98和99；

针对cg00901765的SEQ ID NO.100和101；

针对cg12180984的SEQ ID NO.102和103；

针对cg23753247的SEQ ID NO.104和105；

针对cg07944863的SEQ ID NO.106和107；

针对cg04234680的SEQ ID NO.108和109；

针对cg16712637的SEQ ID NO.110和111；

针对cg14603466的SEQ ID NO.112和113。