KR20200004267A - 조류인플루엔자 바이러스 검사용 조성물 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 칩 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법 - Google Patents

조류인플루엔자 바이러스 검사용 조성물 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 칩 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 고병원성을 판별하기 위한 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 조성물, 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 고병원성을 판별용 키트 또는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 조성물 및 휴대용 실시간 RT-PCR 장비를 함께 이용함으로써 보다 신속하고 정확한 비용 효율적인 조류인플루엔자 바이러스 진단 및 검출이 가능하다.

Description

조류인플루엔자 바이러스 검사용 조성물 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 칩 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법{A composition and RT-qPCR based chip for detecting avian influenza viruses and method for detecting avian influenza viruses using the same}
본 발명은 조류인플루엔자 바이러스를 검사하는 프라이머 조성물 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법에 관한 것이다.
조류인플루엔자 바이러스는 NP(nuleocapsid) 단백질과 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분되고, 이중 A형은 다시 HA (hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형의 아형으로 분류되며 NA (Neuraminidase) 단백질의 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류된다. 일반적으로, HA 단백질과 NA 단백질은 조류인플루엔자 바이러스의 분류에 있어 혈청형을 결정하는 항원 단백질로서 이들 단백질을 각각 코딩하는 HA 유전자 및 NA 유전자의 아형 판별에 의해 조류인플루엔자 바이러스의 감별이 이루어진다.
조류인플루엔자 바이러스 중 H5형과 H7형에서 나타나는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스는 가금류에 감염시 높은 폐사율을 보이며 국가적으로 많은 경제적 피해를 주는 것으로 알려져 있으며, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스와 더불어 H9형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스는 산란계 농가 등에서 많은 피해를 일으킬 뿐 아니라 사람으로의 감염에 대한 보고가 이루어지고 있다. 특히, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1형은 아시아지역을 중심으로 인체감염이 이루어지고 있으며, 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 H9N2형도 인수공통감염의 보고가 있어 공중보건학적인 위해가 큰 것으로 알려져 있다.
따라서, 조류인플루엔자 바이러스의 감염 확산 방지를 위해 이들 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 여부를 조기에 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 진단 시스템이 필요한 실정이다. 특히, 현재 국내 양계농장에는 많은 폐사를 동반하는 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스가 만연되어 있고 고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 피해가 심각한 점을 고려할 때 이의 재발에 대비하여 조류인플루엔자 바이러스를 조기에 신속하게 진단할 수 있는 새로운 진단법 개발이 요구된다고 하겠다.
이와 관련하여 종래의 조류인플루엔자 바이러스(avina influenza virus: AIV) 진단방법으로는 SPF 종란에서 바이러스 배양 후 혈구응집 반응으로 증식 여부를 확인하여 진단하는 방식, 또는 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction) 방법이나 NASBA 방법을 이용하여 조류인플루엔자 바이러스의 RNA를 증폭한 후 유전자 염기서열 분석을 실시하여 혈청형 및 병원성을 판별하는 방식을 들 수 있으나, 이들 진단방식을 사용할 경우 진단 소요시간이 최소 2일에서 길게는 7일 정도의 기간이 소요되어 공중보건학적인 위해가 큰 조류인플루엔자 바이러스의 감염 확산을 조기에 차단하는 방역학적 요구에는 부응하지 못하는 한계가 있었다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2011-0028188호에서는 실시간 다중 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 일반 인플루엔자 Ａ와 신종 인플루엔자의 동시 검출방법을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제10-2011-0114978호에서는 멀티플렉스 실시간 RT-PCR을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법을 개시하고 있다. 이들 종래기술들은 리얼타임 방식의 RT-PCR 증폭방법을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 RNA 유전자 증폭 및 아형 판별을 함으로써 비교적 단시간에 대량으로 분석이 가능하지만, 멀티플렉스 방식으로는 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형 판별과 병원성 분석을 동시에 할 수 없는 한계와 확장성의 제한이 있었다. 특히, 리얼타임 PCR과 같은 분자생물학적 방법을 이용한 조류인플루엔자 바이러스 유전자 진단 방법은 프라이머 및 프로브 부착부위에 변이가 발생시 위음성의 결과가 초래할 수 있는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 고병원성 H5형 조류인플루엔자 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머 쌍을 개발하고 이를 휴대가능한 실시간 RT-PCR 장치 및 유전자 칩에 적용함으로써 보다 신속하고 비용 경제적인 조류인플루엔자 바이러스 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus)의 혈청형 및 고병원성을 판별하는 프라이머 쌍 및 프로브를 제공하는 데 있다
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 고병원성을 판별하는 키트를 제공하는 데 있다
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 고병원성을 판별 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 해결하기 위하여,
본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 4 및 서열번호 6로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 8 및 서열번호 9으로 이루어진 프라이머 쌍 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 고병원성 판별을 위한 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.
본 발명의 상기 각 특이 프라이머들은 구성하는 염기의 일부가 변경될 수 있다. 이와 같은 변경은 구성염기 서열의 결실, 부가, 치환, 또는 이들의 조합인 것으로 구현될 수 있으나, 이러한 염기 서열의 변경은 프라이머들의 주형(cDNA 또는 PCR 증폭산물들)과의 특이적 결합을 저해할 수 있기 때문에 그 적용에 있어 상당한 주의를 요한다. 한편, 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 여러 숙주를 거치면서 유전자의 재배열을 통한 변이가 매우 활발하기 때문에 주기적으로 최신의 유행하는 조류 인플루엔자 바이러스의 유전자 서열을 탐색하여 특이 프라이머들에 반영하여야 하며, 이에 따라 필요시 특이 프라이머들의 구성염기 서열의 일부 변경이 불가피하다. 이때에는 반드시 특이성을 훼손하지 않는 범위 내에서 실험적으로 조사되어 변경되어야 한다. 이는 당업자에게는 일반적인 사항이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명에서 제시된 프라이머들의 서열을 유지하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 프라이머 쌍은 바람직하게는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는데 사용하기 위한 것이며, 가장 바람직하게는 구별된 복수의 용기를 이용하는 다중(multiplex) RT-PCR을 실시하기 위한 것이다. 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 아형 및 고병원성 판별을 위한 프라이머 쌍은 각 아형별 특이 프라이머 쌍을 도 21과 같이 용기별로 구분하여 수용하는 다중 PCR방식으로 적용되므로, 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중 RT-PCR에서의 다수의 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감성 및 특이성 저하 문제를 해결할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, H5의 역방향 프라이머의 타겟 영역의 변이를 고려하여 모든 H5을 검출할 수 있도록 2가지의 역방향 프라이머를 제작하였고, H7 프라이머 쌍의 타겟 영역의 변이를 고려하여 모든 H7를 검출할 수 있도록 각각 2개의 결합 프라이머를 제작하였다.
상기 조성물은 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 12 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 13으로 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 14로 이루어진 프로브, 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 15 또는 서열번호 16로 이루어진 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프라이머 쌍에 의해서 증폭된 단편에 상기 프로브가 혼성화됨으로써 추가적으로 조류인플루엔자 바이러스의 아형 및 고병원성을 더 정확하게 판별할 수 있다.
상기 용어, 프로브(probe)는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되어 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), VIC, TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), 또는 Cy5일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 소광물질은 MGB-NFQ, 6-TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)-1, BHQ-2, BH3-3, IBFQ(Iowa black FQ quencher), IABkFQ(Iowa black FQ quencher), IAbRQSp(Iowa black RQ　quencher) 또는 ROX(carboxy-X-rhodamine)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 구체예에서 상기 프로브는 ZENTM 프로브일 수 있고 상기 프로브를 사용함으로써 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체에에서, 상기 H5 및 H7의 프로브는 센스 가닥(sense strand)을 기준으로 프로브를 디자인 할 시 guanine quenched effect로 인한 영향으로 형광의 검출이 어렵기 때문에, 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 기준으로 프로브를 디자인하였고, HPAIV의 프로브는 타겟 영역의 변이를 고려하여 모든 고병원성 H5를 검출할 수 있도록 2개의 프로브를 제작하였다. 또한, 프로브의 민감도 및 특이도를 향상시키기 위해 고병원성 H5 의 2개의 프로브 일부서열에 LNA(Locked Nucleic Acid) 를 선택적으로 수식하였다.
또한 상기 조성물과 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 M 유전자를 식별하는 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 프라이머 쌍 및/또는 서열번호 19로 이루어진 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
상기 M 유전자는 시판되는 검사용 키트에서 조류인플루엔자 유전자들 중 양성 대조군으로서 널리 사용되는 유전자(GenBank Accession Number: GU122038.1)로, 인플루엔자 A 바이러스 세그먼트 7의 매트릭스 단백질 유전자를 의미한다(Influenza A virus segment 7 matrix protein 1 (M1) and matrix protein 2 (M2) genes, partial cds). 상기 M 유전자를 양성 대조군으로 이용하는 것은 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 증폭이 정상적으로 이루어졌는지 여부를 확인할 수 있고, 혼성화된 다른 프로브들의 신호가 정확한 아형을 나타내는 신호인지를 확인할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 조류인플루엔자 바이러스 유전자에 대하여 양성 대조군인 M 유전자에 대한 PCR 산물이 생성되지 않는 경우나, 상기 PCR 산물과 프로브 반응에 의해 혼성화 신호가 발생하지 않은 경우 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 유전자 증폭 과정의 문제가 있음을 확인할 수 있다. 또한, M 유전자 프로브에서 혼성화 신호가 발생하지 않았음에도 불구하고 다른 프로브들에서 혼성화 신호가 발생하는 경우 이는 잘못된 신호로 판단할 수 있다. 즉, 양성 대조군에 대한 PCT을 통해여 상기 프라어미 쌍 및 프로브에 의한 조류 인플루엔자 바이러스 아형 및 고병원성의 판별이 정확하게 이루어졌는지를 검증할 수 있어 본 발명의 신뢰도를 높일 수 있다.
본 발명은 또한 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 4 및 서열번호 6로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 8 및 서열번호 9으로 이루어진 프라이머 쌍 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 고병원성 판별용 키트을 제공한다.
상기 키트는 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 12 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 13으로 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 14로 이루어진 프로브, 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 15 또는 서열번호 16로 이루어진 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프라이머 쌍에 의해서 증폭된 단편에 상기 프로브가 혼성화됨으로써 추가적으로 조류인플루엔자 바이러스의 아형 및 고병원성을 더 정확하게 판별할 수 있다.
또한 상기 키트는 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 M 유전자를 식별하는 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 프라이머 쌍 및/또는 서열번호 19로 이루어진 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트는 마이크로어레이칩 또는 PCR 증폭 키트를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 PCR 증폭 키트는 도 21에 나타낸 바와 같은 형태로 제작될 수 있고, 상기 키트는 특히 휴대용 PCR 장비에서도 실험실에서도 정확성 및 민감도에서 차이가 없이 조류 인플루엔자의 아형 및 고병원성을 조기에 신속하게 판별할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 키트는 상술한 본 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한,
(1) 종란접종 및 분변으로부터 조류인플루엔자 바이러스 시료를 준비하는 단계; 및
(2) 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 4 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 8 및 서열번호 9으로 이루어진 프라이머 쌍 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료를 PCR을 이용하여 증폭하는 단계;
(3) 상기 특정 프라이머 쌍에 의해 증폭된 PCR 산물의 생성 여부에 따라 조류인플루엔자 바이러스의 아형 및 고병원성을 식별하는 단계;를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별 방법을 제공한다.
상기 방법은 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 12 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 13으로 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 14로 이루어진 프로브, 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 15 또는 서열번호 16로 이루어진 프로브로 상기 PCR 산물에 혼성화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 M 유전자를 식별하는 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 M 유전자를 식별하는 서열번호 19로 이루어진 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법에서 조류인플루엔자 바이러스 시료는 RNA일 수 있고, PCR은 RT-PCR 일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따르면, 당업계에 공지의 방법에 따라 조류의 종란접종 또는 분변으로부터 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA를 함유한 추출액에 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브가 포함된 조성물 또는 키트를 이용하여 다중 RT-PCR을 실시한 후에 얻어진 산물(반응액)에 대하여 통상적으로 알려진 공지된 방법으로 증폭산물의 생성 여부 및 그 크기에 근거하여 조류 인플루엔자 바이러스의 검출 및 이의 아형 및 고병원성을 동시에 판별할 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 본 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명은 휴대용 RT-PCR 장비에 적합하도록 제된 프라이머 쌍 및 프로브를 제작함으로써 조류 인플루엔자 바이러스 진단을 장소에 구애됨이 없이 신속하게 수행할 수 있고 특정 아형을 식별하는 프라이머 쌍 및 프로브마다 구별된 용기를 사용하여 다중 PCR에 적용함으로써 비용 경제적이며, 특정 아형 및 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 진단 민감성 및 특이성를 높였다.
도 1은 H5형에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 일반적인 RT-PCR 이용한 H 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 2는 H5형에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 휴대용 실시간 RT-PCR 장비를 이용한 H 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 3은 M 유전자 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 일반적인 RT-PCR장비를 이용한 M 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 4는 M 유전자 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 휴대용 실시간 RT-PCR장비를 이용한 M 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 5는 H7형에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 일반적인 RT-PCR 이용한 H 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 6은 H7형에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 휴대용 실시간 RT-PCR 장비를 이용한 H 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 7는 H9형에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 일반적인 RT-PCR 이용한 H 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 8은 H9형에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 휴대용 실시간 RT-PCR 장비를 이용한 H 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 9는 고병원성 H5형에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 일반적인 RT-PCR 이용한 H 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 10은 고병원성 H5형에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브와 휴대용 실시간 RT-PCR 장비를 이용한 H 유전자 증폭 및 표준곡선을 도시한다.
도 11 내지 20은 종란접종 또는 분변을 통해 얻은 혈청형 샘플(H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H11, H12 및 고병원성 H5)에 대하여 표 1의 조류인플루엔자 아형별 특이적 프라이머 쌍 및 프로브로 휴대용 실시간 RT-PCR 장비를 이용하여 PCR을 수행하여 유전자를 증폭한 결과를 도시한다.
도 21은 휴대용 실시간 RT-PCR에 사용된 다중 PCR 용기(튜브)를 도시한 것이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다
실시예 1. 조류 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 프라이머 쌍의 제작
미국 국립생물정보센터의 진(gene)뱅크 데이터베이스의 염기서열과 분변 샘플에서 추출한 조류인플루엔자 바이러스를 종란 접종하여 얻은 시료로부터 차세대 염기서열분석을 통해 얻은 HA gene 염기서열을 BioEdit Sequence Alignment Editor의 ClustalW multiple alignment를 이용해 정렬하여 염기서열 변화가 적은 부위를 분석하고 기타 다른 혈청형의 바이러스와 선정부위의 염기서열을 비교 분석하여 H5, H7, H9 및 고병원성 H5형 조류인플루엔자 바이러스에 특이적인 프라이머와 프로브를 제작하였다(표 1).
Figure pat00001
상기 표 1과 같이 실험에 ZENTM 프로브를 TaqMan Probe로 사용하였고, 각 프라이머는 타겟 영역의 변이를 고려하여 특정 아형을 모두 검출할 수 있도록 일부 서열이 변경된 프라이머를 추가로 제작하여 사용하였다. 상기 표 1의 프라이머 서열에서 빨간색으로 표시된 염기들은 변형된 염기쌍을 의미한다.
실시예 2. 표준곡선의 설정 및 기초실험 실시
실시예 1에서 제작된 프라이머 및 프로브를 이용하여 표준곡선 설정을 위해 합성 유전자 연속희석 (10^6 ~ 10^1)을 이용한 기초실험 및 종란접종을 통해 얻은 실제 샘플의 cDNA를 이용한 검증실험을 실험실 내 장비(Quant Studio 3) 및 휴대용 장비(Gene checker UF-150)를 이용하여 하기 표 2 및 표 3의 조건에서 각각 실시하였다. 그 결과를 도 1 내지 도 10에 도시하였다.
Figure pat00002
Figure pat00003
실시예 3. 휴대용 실시간 RT- PCR 장치를 이용하여 H5, H7, H9, 및 고병원성 H5형 조류인플루엔자 바이러스 특이적 진단 확인
종란접종 또는 분변을 통해 얻은 실제 샘플의 RNA를 이용하여 유전자 합성 여부를 통한 바이러스 진단 실험을 실시예 1에서 제작된 표 1의 프라이머 쌍 및 프로브와 휴대용 실시간 RT-PCR 장비 Gene checker UF-150을 사용하여 다음 표 4 및 표 5의 조건에서 수행하였다. 구체적으로 종란접종을 통한 얻은 H2, H3, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H11 및 H12형 11종 및 고병원성 H5형 5종의 샘플, 구강스왑 및 총배설강 스왑을 통한 H9형 각 7종의 샘플에 대해서는 표 4의 조건으로 수행하였다. 그리고 분변을 통해 얻은 고병원성 H5형 13종의 샘플에 대해서는 표 4의 조건으로 수행하였다.
Figure pat00004
Figure pat00005
그 결과를 도 11 내지 20에 도시하였고, 도 11 및 도 12의 결과와 같이, 표 1의 H5형 검출용 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하는 경우, 오직 H5형 조류인플루엔자 바이러스 샘플에서만 유전자 증폭이 이루어져 H5형 조류인플루엔자 바이러스를 특이적으로 반응하여 진단할 수 있음을 확인하였다. 도 13 및 도 14의 결과와 같이, 표 1의 H7형 검출용 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하는 경우, 오직 H7형 조류인플루엔자 바이러스 샘플에서만 유전자 증폭이 이루어져 H7형 조류인플루엔자 바이러스를 특이적으로 반응하여 진단할 수 있음을 확인하였다. 도 15 및 도 16의 결과와 같이, 표 1의 H9형 검출용 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하는 경우, 오직 H9형 조류인플루엔자 바이러스 샘플에서만 유전자 증폭이 이루어져 H9형 조류인플루엔자 바이러스를 특이적으로 반응하여 진단할 수 있음을 확인하였다. 도 17 및 도 18의 결과와 같이, 표 1의 고병원성 H5형 검출용 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하는 경우, 오직 고병원성 H5형 조류인플루엔자 바이러스 샘플에서만 유전자 증폭이 이루어져 고병원성 H5형 조류인플루엔자 바이러스를 특이적으로 반응하여 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 모든 혈청형의 조류인플루엔자 바이러스에 존재하는 M(matrix) 유전자를 검출하는 표 1의 M 유전자 특이적 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하는 경우, 모든 혈청형 샘플에서 유전자 증폭이 이루어짐을 확인하여 조류인플루엔자 바이러스에 해당함을 확인할 수 있었다.
따라서, 표 1의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용함으로써 H5, H7, H9, 고병원성 H5형 조류인플루엔자 바이러스에 대한 정확하고 신속한 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> A composition and RT-qPCR based chip for detecting avian influenza viruses and method for detecting avian influenza viruses using the same <130> P18U22C1355 <150> KR 10-2018-0077052 <151> 2018-07-03 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5 F_1 <400> 1 ccagaatatg cmtacaaaat tgt 23 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5 R_1 <400> 2 ccagtcgcaa ggactaat 18 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5 R_2 <400> 3 ccagttgcaa ggaccaa 17 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 F_1 <400> 4 gctgattcag aaatggacaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 F_2 <400> 5 gctgactcag aaatgaacaa 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 R_1 <400> 6 ggccatacag tcatcatc 18 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 R_2 <400> 7 ccatgcagtc gtcatc 16 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H9 F_1 <400> 8 atgtgatgat caatgcatgg a 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H9 R_1 <400> 9 aacaagaagg cagcaaac 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPAIV_5 F_1 <400> 10 ccaaatacgt gaagtcaaac a 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPAIV_5 R_1 <400> 11 tgccatcctc cctctataa 19 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5 ZEN probe <400> 12 ttgtggaatg gcatactaga gtttatcgc 29 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 ZEN probe <400> 13 ccagtgccat cttcttcagc attctctctc 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H9 ZEN probe <400> 14 atttattcga ctgtcgcctc atctcttgt 29 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPAIV_5 ZEN probe 1 <400> 15 taagagagag aagaagaaaa agagg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPAIV_5 ZEN probe 2 <400> 16 taagagaaaa gagaagaaaa agagg 25 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M F <400> 17 tgagtcttct aaccgaggt 19 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M R <400> 18 caaaaacatc ctcaagtctc tg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M ZEN probe <400> 19 tcaggccccc tcaaagccga 20

Claims (10)

  1. 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 8 및 서열번호 9으로 이루어진 프라이머 쌍 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 고병원성 판별을 위한 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 12 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 13으로 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 14로 이루어진 프로브, 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 15 또는 서열번호 16로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 M 유전자를 식별하는 서열번호 17 및 서열번호 18으로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 19로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 조성물.
  4. 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 8 및 서열번호 9으로 이루어진 프라이머 쌍 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 고병원성 판별용 키트.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 유전자 칩은 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 12 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 13으로 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 14로 이루어진 프로브, 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 15 또는 서열번호 16로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별용 키트.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 조성물은 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 M 유전자를 식별하는 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 19로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별용 키트.
  7. (1) 종란접종 및 분변으로부터 조류인플루엔자 바이러스 시료를 준비하는 단계; 및
    (2) 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 4 및 서열번호 6로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머 쌍, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 8 및 서열번호 9으로 이루어진 프라이머 쌍 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료를 PCR을 이용하여 증폭하는 단계;
    (3) 상기 특정 프라이머 쌍에 의해 증폭된 PCR 산물의 생성 여부에 따라 조류인플루엔자 바이러스의 아형 및 고병원성을 식별하는 단계;를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 방법은 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 서열번호 12 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 서열번호 13으로 이루어진 프로브, 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 서열번호 14로 이루어진 프로브, 및 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성 H5형을 판별하는 서열번호 15 또는 서열번호 16로 이루어진 프로브로 상기 PCR 산물에 혼성화하는 단계를 더 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 방법은 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 M 유전자를 식별하는 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 방법은 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 M 유전자를 식별하는 서열번호 19로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별방법.
KR1020190080150A 2018-07-03 2019-07-03 조류인플루엔자 바이러스 검사용 조성물 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 칩 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법 KR102276396B1 (ko)

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