CN105331718A - 检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒 - Google Patents
检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒，其中基因芯片包括：包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括在基质上设置的真菌28SrRNA通用探针和鉴定真菌的种特异性探针。利用设计的引物对待检测样品基因组DNA进行PCR扩增，并用上述基因芯片进行杂交，然后使用判读软件Baio？Array？Doctor？V？2.0分析鉴定杂交结果。本发明的优点是：能够快速、准确、可靠的检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中的一种或几种病原菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是多位点基因检测芯片，尤其是适用于中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的快速诊断的集成检测方法。
背景技术
中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)感染是神经系统主要疾病谱之一，临床多表现为脑膜(脑)炎症状，如发热、头痛、呕吐、意识障碍及脑膜刺激征等，病死率和致残率高，早期明确的病原学诊断是临床正确抗感染治疗的关键。真菌性病原体是引起CNS感染的众多病原微生物中较常见之一。长期以来，临床微生物实验室用于诊断真菌性CNS感染病原体的方法主要包括脑脊液涂片镜检与培养鉴定等表型方法、脑脊液免疫学检测方法及基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术(如RT-PCR，多重PCR，荧光定量PCR等)，鲜有利用真菌18/28SrRNA基因结构特点构建基因芯片来鉴定病原体的报道。
脑脊液涂片镜检和培养等表型方法目前仍是各临床实验室诊断中枢神经系统感染最常用的检测手段，从中发现致病菌是判断感染的“金标准”，但这些常规方法存在如下不足：(1)由于实验室检测方法学原因导致感染病原体无法检测或检测周期过长，滞后于临床需求使确诊困难而错失早期或关键期的治疗机遇：①脑脊液涂片显微镜检查，检出率低，敏感性差；②脑脊液真菌培养所需时间长(4-7天)、培养阳性率低(约10-15％左右)；③受抗生素使用等因素影响、无法实现广谱病原体的筛查和监测。(2)由于病原体无法或快速准确的分离鉴定，导致治疗的盲目性，使耐药菌增加并加重患者负担：①目前使用的全自动真菌鉴定仪在鉴定某些菌时可能出现差错，鉴定准确性值得商榷；②商品化表型鉴定系统数据库有限，很难区分表型相近病原菌；③质谱鉴定仪鉴定目前仍需先获得阳性菌落，直接检测鉴定真菌病原体仍需大量样本来验证。
脑脊液免疫学检测方法(如隐球菌乳胶凝集检测)只能检测特定病原体，不能检测脑脊液中未知真菌和对病原菌进行分类，存在假阳性率高等缺点。PCR检测方法主要采用荧光定量PCR技术和脱氧核糖核酸测序技术，目前这些技术只能针对单个真菌核酸进行检测，通量低；脱氧核糖核酸测序技术操作复杂，不便于在检验科实验室常规开展，其结果的判定亦存在一定错误的风险，需多拷贝双向测序。而目前众多基因芯片多以硝酸纤维膜和尼龙膜等不同载体和地高辛、胶体金显色等方法制备，虽有基于真菌16SrRNA微型寡合苷酸芯片检测脑脊液病原菌的研究，但存在致病菌覆盖不全面、缺少大样本临床验证数据等不足，鲜有真菌病原体诊断性芯片的报道。
目前临床微生物实验室采用的传统培养鉴定存在诸多客观缺点，如依靠表型鉴定、敏感性低、检测周期长、易受抗生素应用等各方面的限制，鉴定准确性亦值得商榷，不能满足临床快速诊断的要求。目前进行菌种分型的方法主要有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、测序、序列特异性引物PCR、荧光定量PCR等方法，不仅操作繁琐、检测周期长、通量小，且检测过程影响因素多、不易控制，不能同时对多种病原体进行分型，难以满足临床检验的要求，使临床至今无法开展中枢神经感染真菌病原体的广谱、集成检测。
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，其主要原理是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)以一定顺序和密度固定在载体(如载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜、塑料片等)上形成阵列，与实际样本(或核酸扩增产物)进行杂交反应，通过杂交信号分析可高通量获得所有待检基因的信息。该技术以其高通量、快速、准确性高等优点为感染病原学诊断提供了一条新的解决途径，对患者感染性疾病的临床治疗、预后评估具有重要作用。
真菌核糖体RNA(rRNA)包括5S、5.8S、18S、28SrRNA，以多拷贝形式存在于所有真核染色体基因中。国内外有利用真菌内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS)基因结构特点用于真菌鉴定的报道。但未见有基于真菌rRNA的芯片技术用于临床检测脑脊液真菌的研究。目前市场上最主要的基因芯片产品是以点样等方法制备的用于基因表达检测的中、低密度基因芯片。基因芯片的一个重要发展趋势是芯片制备、样品处理、杂交、检测以及数据分析的标准化，提高基因芯片的准确性和可靠性。因此，如何即保证检测高通量，又保证芯片性能优越性是其的瓶颈问题之一。而利用基于真菌28SrRNA基因的多位点芯片检测多种中枢神经感染真菌病原体，发挥其操作简单、通量大、结果准确等特点，对于临床分析中枢神经感染真菌病原体及种类具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒，利用基于真菌28SrRNA基因的多位点芯片检测多种中枢神经感染真菌病原体的问题。
本发明的一个目的是提供一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针包括在基质上设置的真菌28SrRNA通用探针和鉴定真菌的种特异性探针,所述鉴定真菌的种特异性探针为SEQIDNO：1-NO：4所示的碱基序列的DNA片段，所述真菌28SrRNA通用探针为SEQIDNO：5所示的碱基序列的DNA片段。
进一步地，上述鉴定真菌的种特异性探针5’端含有氨基修饰的聚dT串，所述氨基修饰的聚dT串为16聚的聚脱氧胸苷酸。
进一步地，该基因芯片还包括SEQIDNO：6所示的标记有生物素点的DNA序列。
进一步地，所述固相载体为修饰玻片或硅片。
本发明的另一目的还在于提供一种用于检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述基因芯片。
进一步地，所述试剂盒还包括SEQIDNO：7-NO：8所示的引物序列。
进一步地，所述引物的5’端带有标记基团，所述标记基团包括：地高辛分子、生物素分子、荧光素及其衍生物分子、Cy3，Cy5、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。
本发明还提供了一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于：包括如下步骤：
(1)用常规方法制备模板DNA；
(2)用权利要求6所述引物序列将步骤(1)中制备的模板DNA通过PCR反应进行扩增，获得5’端带有标记基团DNA扩增产物；
(3)将步骤(2)中DNA扩增产物与杂交缓冲液混合；
(4)将步骤(3)中所得混合液与权利要求3所述的基因芯片上面分布的DNA探针、Bio进行杂交反应；
(5)完成步骤(4)杂交反应后，检测基因芯片的杂交信号，根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。
进一步地，在所述步骤(4)前先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
进一步地，所述步骤(2)中PCR反应的步骤，还包括：
1)94℃预变性5分钟；2)94℃变性45s；3)58℃退火45s；4)72℃延伸60s，重复2)-4)30次；5)最后72℃延伸7min的反应步骤。
本发明适用于从脑脊液等临床标本中直接提取病原菌DNA用于PCR扩增，靶基因用于杂交检测，可用于疑似真菌性感染的病原体筛查。本发明以固体材料载体为基质，便于生产和操作；用真菌通用引物PCR方法扩增靶基因，避免了费时的培养阶段，大大缩短了检测时间(约4小时左右)；利用标记的靶序列和基质上的寡核苷酸探针进行杂交的鉴定方法较基于生理和生化的鉴定方法更准确，增加了检测准确度，且不受培养条件和真菌生理状态的影响；无论菌“死活”，基因芯片检测结果均提供重要临床价值。该技术方法不仅能在较短的时间明确真菌的存在与否，还可判读临床常见感染性疾病病原菌，为存在真菌感染而早期临床表现不明显的疾病的早期诊断提供了依据，避免了抗生素的滥用。随着特异性探针数量的增多，其对更多的样本或混合感染的样本进行检测的能力也将越来越高，检测时间会越来越短，这将为临床诊断提供一种全新、快速、灵敏的真菌检测鉴定方法。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例二所述的本发明基因芯片的6条探针的排布示意图，其中代表标记有生物素点的DNA序列(Bio)。
图2表示白念珠菌分析结果的图。
图3表示热带念珠菌分析结果图。
图4光滑念珠菌分析结果的图。
图5表示新型隐球菌分析结果图。
图6表示存在真菌(毕赤酵母菌)分析结果图。
图7基因芯片的工作原理示意图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例加以说明，这些实施例是为了说明而不是以任何形式限制本发明。
实施例一探针的设计和制备(以白色念珠菌为例)
1.序列获得：登录Genbank检索白色念珠菌标准样本测序得到碱基序列，选择真菌的16SrRNA基因为靶序列；
2.探针设计：考虑到探针长度、GC％及Tm值等因素，本发明通过PrimerPriemer5.0软件设计探针，设计出如SEQIDNO：1所示的碱基序列的DNA片段；
进一步的，为了减少杂交时的空间位阻，本发明在上述碱基序列5’端增加氨基修饰的聚dT串；
具体的，上述氨基修饰的聚dT串用16聚的聚脱氧胸苷酸；
3.基因探针的合成：人工合成(委托生工生物工程(上海)有限公司)上述设计的探针。
实施例二基因芯片的合成
1.设计真菌芯片点样模式：每个探针重复3个点，制成如图1所示的3*3DNA微阵，图示中各探针对应编号见表1。
表1真菌探针对应编号
表1图1中具体数字编号对应菌种
基因芯片的点样：
1)在上海百傲科技股份有限公司生产的iArrayer基因芯片点样仪上按芯片模式图，设置点样程序；
2)将稀释好的100uM探针溶液与上海百傲科技股份有限公司的点样缓冲液以一定比例混合，按照点样程序加入到384孔板的指定位置；
3)将醛基基片依次放置在点样仪的点样平台上；
4)将点样板置于点样仪中，启动点样程序，完成芯片点样；
5)将基因芯片恒温恒湿条件下静置12小时。
6)质检：将基因芯片依次置于显微镜下观察，阵列应整齐、完整，无漏点。
如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；Derisi，JL等于1997年在《科学》278(5338)：680-686发表的“探讨基因组内基因表达的代谢和遗传控制”(Dersi,JL,IyerVR,BrownPO.Exploringthemetablicandgeneticcontrolofgeneexpressiononagenomicscale.Science.1997；278(5338):680-686)及马立人等主编的生物芯片，化学工业出版社。
实施例三引物合成
1.序列获得：登录Genbank对白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、新生隐球菌的DNA序列检索、分析；
2.引物设计：通过PrimerPriemer5.0软件设计出SEQIDNO：7-NO：8所示碱基序列的引物；
进一步的，所述引物的5’端修饰标记基团；
具体的，用地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3，Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)标记上述引物；
3.引物序列的合成：人工合成(委托生工生物工程(上海)有限公司)上述设计的引物。
实施例四基因芯片工作原理
设计的引物扩增后产生的扩增片段的3’端与固定在芯片上的特异性探针互补，5’端带有标记基团。若探针为与该扩增产物3’端互补的探针，该扩增产物的一端与芯片上的特异性探针杂交，而另一端带有标记基团，将标记基团进行显色处理，即可检测到信号，否则检测不到信号。图7是基因芯片的工作原理示意图。
实施例五检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的试剂盒及操作方法
在利用含有上述制备好的基因芯片和引物的试剂盒检测真菌性中枢神经系统感染患者脑脊液中病原菌的方法中，本发明对检测步骤、检测条件等因素均作了一系列的实验摸索，如真菌模板DNA模板PCR反应混合物中各成分比例，杂交温度，杂交时间等及主要试剂配方，如杂交液，洗液等(配方详见以下实施例)。其中PCR反应混合物中的各个成分，尤其引物浓度，Buffer的选择，Taq酶浓度，荧光素的种类及用量，及模板浓度均为多次对比实验后得到的最优组合。PCR所采用的退火温度、时间及延伸时间，循环数目亦为梯度实验后选出的优良条件。PCR扩增经过1)94℃预变性5分钟；2)94℃变性45s，3)58℃退火45s4)72℃延伸60s，重复2)-4)30次；4)最后72℃延伸7min的过程。检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的试剂盒的实验流程亦为优化后结果。以下为利用上述试剂盒检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的较佳实施例，具体说明如下：
1.阳性对照组样品的制备
(1)应用TIANGEN酵母菌基因组DNA提取试剂盒提取阳性对照菌基因组DNA
1)取无菌生理盐水配制的白假丝酵母菌(ATCC10231)和新生隐球菌(ATCC204092)菌液5ml，将菌液制成0.5麦氏单位，采用10倍连续稀释法，使菌悬液浓度分别为102-108CFU/ml；
2)12,000rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清；
3)酵母酶法破除细胞壁：向菌体中加入600μl山梨醇buffer，加入大约50ULyticase，充分混匀，30℃处理30min。4000rpm(～1500×g)离心10min，弃上清，收集沉淀；
4)向沉淀中加入200μl缓冲液GA重悬沉淀，充分混匀，振荡15sec，室温放置5min；
5)加入20μlProteinaseK溶液，混匀；
6)加入220μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，直至溶液变清亮；
7)加220μl无水乙醇，充分颠倒混匀；
8)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
9)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
10)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中，重复操作1次；
11)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
(2).PCR扩增模板DNA
本发明试剂盒中扩增液包含了上下游引物(生物素标记)以及PCR反应所需的各种试剂(如dNTP、Mgcl2、H2O、Buffer等)，Taq酶另管提供。将扩增液中加Taq酶、抽提好的靶DNA通过PCR反应将靶DNA片段迅速扩大，用于杂交和显色反应。25μl扩增反应体系组成为：扩增液(22μl)+2μl抽提产物(DNA)+1μlTaq酶。
表2.真菌PCR扩增体系配方
| 试剂名称 | 用量 |
| 10×Buffer | 2.5μl |
| dNTP(各2.5mM) | 2.5μl |
| 上游引物(10uM) | 0.3μl |
| 下游引物(10uM) | 1μl |
| DDW | 15.7μl |
| Total | 22μl |
将以上混合液放入到PCR仪中，执行以下程序：
2、阴性对照组样品的制备
同上述的阳性对照组样品的制备，用5ml无菌生理盐水代替模板DNA进行操作。
3、临床样品的制备
(1).脑脊液培养阳性分离真菌基因组DNA的提取同上述阳性对照组样品的制备；
(2).临床疑似感染脑脊液样本DNA的提取利用QIAampUCPPathogenMiniKit试剂盒。将1.5ml脑脊液加入PathogenLysisTube中，13400r/min离心5min，弃上清，加入试剂盒配套缓冲液ATL(含试剂DX)悬浮颗粒，涡旋振荡器振荡10分钟，短暂离心，吸取400μl上清液于无菌EP管中，后续实验操作按QIAampUCPPathogenMiniKit说明书进行。按阳性对照组样品PCR扩增条件，扩增得到带有生物素标记的临床样本核酸DNA。
4.杂交
采用上海百傲科技股份有限公司出品的杂交显色试剂盒(BST03021)，在全自动杂交仪：BSE03011中，按以下方法进行：
(1)杂交反应液配制：吸取190μl杂交缓冲液，上述步骤1-3中制备的扩增产物各10μl，混匀。
(2)按表3设置反应程序和分装各试剂，运行程序，杂交显色反应自动进行。
表3.杂交体系和反应程序
(3)取出基因芯片，做好标记
5.芯片杂交信号的检测：
将杂交并洗涤完毕的基因芯片放入到生物芯片识读仪检测，用基因芯片图像分析软件BaioArrayDoctorV2.0进行图像扫描与数据分析，输出结果。如图2-6所示，为利用本发明提供的试剂盒检测的结果扫描图片。
本发明适用于从脑脊液等临床标本中直接提取病原菌DNA用于PCR扩增，靶基因用于杂交检测，可用于疑似真菌性感染的病原体筛查。本发明以固体材料载体为基质，便于生产和操作；用真菌通用引物PCR方法扩增靶基因，避免了费时的培养阶段，大大缩短了检测时间(约4小时左右)；利用标记的靶序列和基质上的寡核苷酸探针进行杂交的鉴定方法较基于生理和生化的鉴定方法更准确，增加了检测准确度，且不受培养条件和细菌生理状态的影响；无论菌“死活”，基因芯片检测结果均提供重要临床价值。该技术方法不仅能在较短的时间明确真菌的存在与否，还可判读临床常见感染性疾病病原菌，为存在真菌感染而早期临床表现不明显的疾病的早期诊断提供了依据，避免了抗生素的滥用。随着特异性探针数量的增多，其对更多的样本或混合感染的样本进行检测的能力也将越来越高，检测时间会越来越短，这将为临床诊断提供一种全新、快速、灵敏的真菌检测鉴定方法。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针包括在基质上设置的真菌28SrRNA通用探针和鉴定真菌的种特异性探针,所述鉴定真菌的种特异性探针为SEQIDNO：1-NO：4所示的碱基序列的DNA片段，所述真菌28SrRNA通用探针为SEQIDNO：5所示的碱基序列的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片，其特征在于：上述鉴定真菌的种特异性探针5’端含有氨基修饰的聚dT串，所述氨基修饰的聚dT串为16聚的聚脱氧胸苷酸。
3.根据权利要求1所述的检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片，其特征在于：该基因芯片还包括SEQIDNO：6所示的标记有生物素点的DNA序列。
4.根据权利要求1所述的检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片，其特征在于：所述固相载体为修饰玻片或硅片。
5.一种用于检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述基因芯片。
6.根据权利要求5所述的用于检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SEQIDNO：7-NO：8所示的引物序列。
7.根据权利要求6所述的用于检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的试剂盒，其特征在于：所述引物的5’端带有标记基团，所述标记基团包括：地高辛分子、生物素分子、荧光素及其衍生物分子、Cy3，Cy5、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。
8.一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于：包括如下步骤：
(1)用常规方法制备模板DNA；
(2)用权利要求6所述引物序列将步骤(1)中制备的模板DNA通过PCR反应进行扩增，获得5’端带有标记基团DNA扩增产物；
(3)将步骤(2)中DNA扩增产物与杂交缓冲液混合；
(4)将步骤(3)中所得混合液与权利要求3所述的基因芯片上面分布的DNA探针、Bio进行杂交反应；
(5)完成步骤(4)杂交反应后，检测基因芯片的杂交信号，根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。
9.根据权利要求8所述的检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的方法，其特征在于：在所述步骤(4)前先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
10.根据权利要求8所述的检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR反应的步骤，还包括：
1)94℃预变性5分钟；2)94℃变性45s；3)58℃退火45s；4)72℃延伸60s，重复2)-4)30次；5)最后72℃延伸7min的反应步骤。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |