JP5916740B2 - 核酸標的の定量的多重同定 - Google Patents
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Description
本出願は、出典明示によりその全内容が本明細書に組み込まれる、2010年10月14日に出願された「定量的多重化(Quantitative Multiprexing)」と題される、米国仮特許出願第61/393,253号の優先権を主張する。
本発明の一態様によると、リアルタイム核酸増幅システムの定量的能力とハイブリダイゼーションシステムの多重化能力を組み合わせるための方法およびシステムがある。例えば、本明細書において、たとえ核酸配列、種、または株が遠縁または近縁のいずれかであっても、二以上の遺伝子、種、または株を含有するサンプルにおける標的核酸配列、種、または株を定量的に解析するための方法およびシステムが記載される。
Claims (35)
- 複数の標的核酸分子の少なくとも一つをサンプル中に検出するための方法であって、
前記複数の標的核酸分子の各々の第一の増幅領域を同定する段階、ここに、第一の増幅領域は前記複数の標的核酸分子間で保存されるものである;
前記複数の標的核酸分子の各々の第二の増幅領域を同定する段階、ここに、第二の増幅領域は前記複数の標的核酸分子間で保存されないものであり、かつさらに複数の標的核酸分子の各一つについて、第一の増幅領域および第二の増幅領域は核酸分子の異なる位置にあるものである;
増幅反応混合物を生成する段階、前記混合物は少なくとも二つの異なる標的核酸分子、前記第一の増幅領域を増幅するように設計された第一のプライマーペア、前記第二の増幅領域を増幅するように設計された第二のプライマーペア、および前記第一の増幅領域にハイブリダイズするように設計された第一の核酸プローブを含むものである;
前記サンプル中に存在する各標的核酸分子の第一の増幅領域の第一の増幅産物および前記サンプル中に存在する各標的核酸分子の第二の増幅領域の第二の増幅産物を、反応混合物を含む増幅反応において同時に産生する段階、ここに、第一および第二の増幅産物は別個の産物であるものである;
リアルタイムで前記第一の増幅産物の産生を検出する段階、ここに、前記第一の核酸プローブは前記第一の増幅領域にハイブリダイズするものである;および
前記サンプル中に存在する各標的核酸分子の存在を示す、前記第二の増幅産物を検出する段階:
を含む、方法。 - 前記第一の増幅産物を検出する段階が、前記サンプル中に存在する標的核酸分子の量を定量する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の増幅産物を検出する段階が、相補的なプローブへ前記第二の増幅産物をハイブリダイズすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記相補的なプローブが基質に固定される、請求項3に記載の方法。
- 前記基質がマイクロアレイである、請求項4に記載の方法。
- 第二の複数の標的核酸分子の第三の増幅領域を同定する段階、ここに、第三の増幅領域は前記第二の複数の標的核酸分子間で保存されるものである;
前記サンプル中に存在する前記第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の増幅領域の第三の増幅産物を産生する段階;および
リアルタイムで前記第三の増幅産物の産生を検出する段階
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第一の増幅産物および前記第三の増幅産物が、同一の反応において産生される、請求項6に記載の方法。
- 前記サンプル中に存在する標的核酸分子の定量された量および前記サンプル中に存在する各標的核酸分子の検出された存在の両方を解析することにより、前記サンプル中に存在する前記複数の標的核酸分子のそれぞれの定量的多重検出を実施する段階
をさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 前記サンプル中に存在する一以上の標的核酸分子の存在が、前記サンプル中の病原体の存在を示す、請求項1に記載の方法。
- 該方法が前記サンプル中の少なくとも二つの病原体を検出することができる、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプル中に存在する一以上の標的核酸分子の存在が、前記サンプル中の特異的な核酸配列の存在を示す、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルから核酸を精製する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の増幅領域を同定する段階が:
前記複数の標的核酸分子のそれぞれの核酸配列の少なくとも一つのセグメントの配列アラインメントを実施する段階;
前記配列アラインメントに基づいて前記第一の増幅領域を同定する段階;
増幅の間に前記第一の増幅領域を増幅するように構成されている第一のプライマーペアを設計する段階;および
前記領域の増幅の間に前記第一の増幅領域にハイブリダイズできるプローブを設計する段階
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記プローブが、前記第一のプライマーの融解温度および前記第二のプライマーの融解温度よりも少なくとも6℃高い融解温度を有するように設計される、請求項13に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸分子のそれぞれの前記第二の増幅領域を同定する段階が:
前記複数の標的核酸分子のそれぞれの核酸配列の少なくとも一つのセグメントの配列アラインメントを実施する段階;
前記配列アラインメントに基づいて前記第二の増幅領域を同定する段階;および
増幅の間に前記第二の増幅領域を増幅するように構成されている第二のプライマーペアを設計する段階
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の増幅領域にハイブリダイズできる相補的なプローブを設計する段階をさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 各増幅産物が、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)によって産生される、請求項1に記載の方法。
- 複数の標的核酸分子の少なくとも一つを検出するためのシステムであって、
前記複数の標的核酸分子の少なくとも一つを含むサンプル;
第一のプライマーペア、前記第一のプライマーペアは第一の増幅産物を産生するために前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の領域を増幅することができ、ここに、該第一の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されるものである;
リアルタイム核酸増幅装置、ここに、前記装置は前記第一のプライマーペアを用いて前記第一の増幅産物を産生することができ、かつさらにリアルタイムで前記第一の増幅産物を検出することができるものである;
第二のプライマーペア、前記第二のプライマーペアは第二の増幅産物を産生するために前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域を増幅することができ、ここに、該第二の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されないものであり、複数の標的核酸分子の各一つについて、第一の増幅領域および第二の増幅領域は核酸分子の異なる位置にあるものであり、かつさらに第一および第二の増幅産物は別個の産物であるものである;および
前記第二の増幅産物を検出するための検出デバイス:
を含む、システム。 - 前記第一の領域にハイブリダイズする第一の核酸プローブをさらに含む、請求項18に記載のシステム。
- 前記第二の領域にハイブリダイズする第二の核酸プローブをさらに含む、請求項18に記載のシステム。
- 前記第二の核酸プローブが基質に固定される、請求項20に記載のシステム。
- 前記基質がマイクロアレイである、請求項21に記載のシステム。
- 第三のプライマーペア、前記第三のプライマーペアは第三の増幅産物を産生するために第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の領域を増幅することができ、ここに、該第三の領域は前記第二の複数の標的核酸分子の間で保存されるものである
をさらに含む、請求項18に記載のシステム。 - 前記第二の増幅産物を検出することが、前記サンプル中の病原体の存在を示す、請求項18に記載のシステム。
- 該システムが前記サンプル中の少なくとも二つの病原体を検出することができる、請求項18に記載のシステム。
- 前記第二の増幅産物を検出することが前記サンプル中の特異的な核酸配列の存在を示す、請求項18に記載のシステム。
- 前記サンプルから核酸を精製するための手段をさらに含む、請求項18に記載のシステム。
- 前記第一の核酸プローブが、前記第一のプライマーペアにおけるいずれのプライマーの融解温度よりも少なくとも6℃高い融解温度を有する、請求項19に記載のシステム。
- 前記システムが複数の標的核酸分子の少なくとも一つを前記サンプル中に検出するためのキットである、請求項18に記載のシステム。
- 前記リアルタイム核酸増幅装置がポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)装置である、請求項18に記載のシステム。
- 複数の標的核酸分子の少なくとも一つをサンプル中に検出するためのキットであって、
第一のプライマーペア、前記第一のプライマーペアは第一の増幅産物を産生するために前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の領域を増幅することができ、ここに、該第一の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されるものである;
前記第一の領域にハイブリダイズする第一の核酸プローブ;
第二のプライマーペア、前記第二のプライマーペアは第二の増幅産物を産生するために前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域を増幅することができ、ここに、該第二の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されないものであり、複数の標的核酸分子の各一つについて、第一の増幅領域および第二の増幅領域は核酸分子の異なる位置にあるものであり、かつさらに第一および第二の増幅産物は別個の産物であるものである;および
前記第二の領域にハイブリダイズする第二の核酸プローブ:
を含む、キット。 - マイクロアレイをさらに含む、請求項31に記載のキット。
- 第三のプライマーペア、前記第三のプライマーペアは第三の増幅産物を産生するために第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の領域を増幅することができ、ここに、該第三の領域は前記第二の複数の標的核酸分子の間で保存されるものである、をさらに含む、請求項31に記載のキット。
- 前記サンプルから核酸を精製するための手段をさらに含む、請求項31に記載のキット。
- 前記第一の核酸プローブが、前記第一のプライマーペアにおけるいずれのプライマーの融解温度よりも少なくとも6℃高い融解温度を有する、請求項31に記載のキット。
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