JP2014501494A - 核酸標的の定量的多重同定 - Google Patents

Abstract

リアルタイム核酸増幅システムの定量的能力およびハイブリダイゼーションシステムの多重化能力を用いる、標的核酸を検出するための方法およびシステムであって、各標的核酸配列内の保存的な配列および特徴的な配列を同定すること；保存的な領域および特徴的な領域を同時に増幅すること；リアルタイムで保存的な領域の増幅をモニターすること；多重同定を介して特徴的な領域のアンプリコンを同定すること；およびリアルタイムのモニタリング情報と標的核酸の多重同定を組み合わせることにより、標的の定量的多重解析を実施することを含む、方法およびシステム。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、出典明示によりその全内容が本明細書に組み込まれる、２０１０年１０月１４日に出願された「定量的多重化（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｕｌｔｉｐｒｅｘｉｎｇ）」と題される、米国仮特許出願第６１／３９３，２５３号の優先権を主張する。

本発明は分子検出に関し、より具体的には、一以上の標的分子の定量的多重検出のための方法およびシステムに関する。

生化学分析は、一般に、研究、臨床、環境および工業の現場で、ある遺伝子配列、抗原、疾患または病原体の存在または量を検出または定量するために用いられる。分析を用いて、宿主生物またはサンプル中に存在する、寄生虫、菌類、バクテリアまたはウイルスなどの生物を同定することが多い。ある条件下では、分析は、感染または疾患の程度を計算し、かつ疾患の状態を経時的にモニターするために用いられうる、定量化の尺度を提供しうる。一般に、生化学分析は、典型的には研究、臨床、環境または工業源に由来するサンプルから抽出された抗原(免疫測定)あるいは核酸(核酸ベースの分析または分子分析)を検出する。

国土安全保障、食品安全および医療診断を含む広範囲の領域にわたり、多数の病原体の定量的同定のための分析に対する需要が増大している。多重定量的分析のための既存の技術は存在するが、これらの技術は多数の病原体の適切な定量的同定を提供することができない。例えば、マイクロアレイはＤＮＡの同定にとって満足のいくレベルの多重化を提供するが、定量的情報をほとんどあるいはまったく提供しない。他方、リアルタイムＰＣＲは高品質の定量的情報を提供するが、多重化のレベルは制限されている。

その他の名称のうち定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（「ｑｒｔ−ＰＣＲ」）としても知られる、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、絶対量または別の入力情報と比較した相対量のいずれかとして、標的ＤＮＡを定量しながら、周知のＰＣＲプロセスを用いて、標的ＤＮＡ分子を同時に増幅するために用いられる、分子生物学的ツールである。標準的なＰＣＲを用いる場合、産物が反応の完了の後に検出される。対照的に、ｑｒｔ−ＰＣＲを実施して、ユーザーはほぼ同じ方法で標的ＤＮＡを増幅するが、ポリメラーゼ連鎖反応の進行とリアルタイムで標的とされるＤＮＡ分子を検出する。リアルタイムでｑｒｔ−ＰＣＲ産物を検出するために用いられる最も一般的な方法のいくつかは、二本鎖ＤＮＡ産物内に組み込まれる非特異的蛍光色素を利用するもの、またはプローブが標的配列とハイブリダイズする時にのみ蛍光を発することができる蛍光レポーターで標識された、配列特異的プローブを用いるものである。これらの方法が採用される場合、例えば、蛍光検出器などのさらなる設備が必要とされるだろう。

配列特異的プローブ法は、標的とされる配列またあるいはそのアンプリコンと実質的に相補的であるヌクレオチド塩基配列を有するプローブの使用を必要とする。選択的分析条件下では、プローブは、実施者がサンプル中の標的とされる配列の存在を検出できるような方法で、標的とされる配列またはそのアンプリコンにハイブリダイズするだろう。効果的なプローブは、標的とされる配列の存在を検出することを干渉できる、任意の核酸配列との非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐように設計される。プローブおよび／またはアンプリコンは、検出ができる標識を含んでもよく、該標識は、例えば、放射性標識、蛍光色素、ビオチン、酵素、電気化学的あるいは化学発光化合物である。

ｑｒｔ−ＰＣＲ産物を定量するために、検出された蛍光はサイクル数に対する対数目盛上にプロットされる。未決定の反応における標的の量は、次いで、既知の量の産物を用いて得られた標準結果と実験結果を比較することにより決定することができる。これは、しかしながら、ｑｒｔ−ＰＣＲ産物を定量できる一つの方法にすぎない。

定量的リアルタイムＰＣＲは、特に分子生物学の研究において、多数の適用性を有している。ｑｒｔ−ＰＣＲの一つの具体的な使用は、サンプル中の病原体についての定量的な情報を獲得することである。定量のためには、蛍光強度のリアルタイムの測定、または増幅反応の間のアンプリコンの濃度の増加を示す別のパラメーターのリアルタイムの測定が、必要である。多数の標的を識別する（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）ためには、特異的なプローブと共に特定のプライマーが各標的に対して設計されなければならない。あるいは、望ましくない場合では、プライマーだけを設計すればよく、かつ、アンプリコンの増加する濃度を示すために、ＳＹＢＲグリーンなどの色素が反応に適用される。例えば、もし１０種の標的候補（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ）が存在するならば、典型的には１０種の異なるプローブが必要とされる。検出器／プローブの組み合わせに対する現在の最先端技術は、最大でおよそ４あるいは５種の標的の同時多重化を可能にする。しかしながら、ほとんどのリアルタイムＰＣＲシステムは、検出を多重化するために二つの検出器のみを装備している。かかるシステムを用いると、６種のＣ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）遺伝子型を識別するために、６つの別個のＰＣＲ反応が必要である。

ＤＮＡマイクロアレイは、サンプル中の標的核酸の、マイクロアレイ上の相補的なＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションに起因する、サンプル中の標的核酸配列の存在を検出するために用いられるツールである。マイクロアレイ自体は、表面（例えば、マイクロアレイ自体の表面またはビーズなどの二次的な表面）に付着した、最大で何千ものＤＮＡスポット−プローブ（またはレポーター）と呼ばれる−の集合である。マイクロアレイは通常、マイクロアレイリーダーによって容易に読むことができる顕微鏡用スライドあるいは他の比較的小さな表面上で形成される。ＤＮＡプローブは、非常に短いＤＮＡのセグメントから非常に長いＤＮＡのセグメントまで変動でき、その他多数の種類の配列のうち、短いオリゴ、遺伝子、遺伝子のセグメントあるいはＤＮＡの非コードセグメントを含むことが多い。

マイクロアレイを用いるために、対象の核酸が、獲得され、精製され、増幅され、かつ典型的には蛍光的にまたは放射性標識で標識される。標識された核酸は、次いで、ＤＮＡスポットに流され、そして、対象の核酸が実際に存在する場合には、それはマイクロアレイ上のその相補的なプローブにハイブリダイズするだろう。非結合または非特異的結合した核酸は洗浄され、結合した標的だけを後に残す。標識された結合標的はそのため、それが結合した各ＤＮＡスポットでシグナルを産生するだろう、また、マイクロアレイリーダーは、マイクロアレイ上のそれらの既知の位置に基づいて、プローブおよび標的の同定を決定しながら、蛍光シグナルを検出できる。

ＤＮＡマイクロアレイ技術の利点の一つは、アレイの多重化能力である。単一のアレイは最大で何千もの異なるプローブを含有することができるため、単一のマイクロアレイ実験は何千の遺伝的試験を同時に実施することができる。マイクロアレイは、その他多数のよく知られた用途のうち、一般に：（ｉ）遺伝子発現を解析する；（ｉｉ）生物を同定する；（ｉｉｉ）一塩基多型（「ＳＮＰｓ」）を検出する；および（ｉｖ）近縁関係にある生物におけるゲノムを比較するために用いられる。

従って、マイクロアレイ技術はＤＮＡの多重同定のためによく用いられる。しかしながらマイクロアレイは、同定されたＤＮＡについて非常にわずかの、あるいは不正確な定量的情報しか提供しない。それゆえ、多重検出と定量を組み合わせるための改善された方法およびシステムについて、当技術分野において継続的な必要性が存在する。

それゆえ、本発明の主要な目的および利点は、一以上の標的の定量的検出のための方法を提供することである。

本発明の別の目的および利点は、定量を一以上の標的の多重検出と組み合わせることである。

本発明のさらに別の目的および利点は、リアルタイム核酸増幅システムの定量的能力をハイブリダイゼーションシステムの多重化能力と組み合わせることである。

本発明の他の目的および利点は、一部分は明白なものであり、また一部分は以下に明らかにされるだろう。

上述の目的および利点に従って、本発明は、複数の標的核酸分子の少なくとも一つをサンプル中に検出するための方法を提供する。該方法は：（ｉ）第一の領域が複数の標的核酸分子間で保存される場合、複数の標的核酸分子の各々の第一の領域を同定する段階；（ｉｉ）サンプル中に存在する各標的核酸分子の第一の領域の第一の増幅産物を産生する段階；（ｉｉｉ）増幅の間にリアルタイムで第一の増幅産物の産生を検出する段階；（ｉｖ）第二の領域が複数の標的核酸分子間で保存されない場合、複数の標的核酸分子の各々の第二の領域を同定する段階；（ｖ）サンプル中に存在する各標的核酸分子の第二の領域の第二の増幅産物を産生する段階；および（ｖ）サンプル中に存在する各標的核酸分子の存在を示す、第二の増幅産物を検出する段階、を含む。別の態様によると、第一の増幅産物は、第一の領域にハイブリダイズする第一の核酸プローブの存在下で産生され、かつ、増幅の間にリアルタイムで増幅産物を検出する段階は、第一の領域への第一の核酸プローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。別の態様によると、プローブがＤＮＡマイクロアレイなどの基質に固定されうる場合、第二の増幅産物を検出する段階は、相補的なプローブへ第二の増幅産物をハイブリダイズすることを含む。該方法は：（ｉ）第三の領域が第二の複数の標的核酸分子間で保存される場合、第二の複数の標的核酸分子の第三の領域を同定する段階；（ｉｉ）サンプル中に存在する第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の領域の増幅により、第三の増幅産物を産生する段階；および（ｉｉｉ）リアルタイムで第三の増幅産物の産生を検出する段階、をさらに含むことができる。第一の増幅産物および前記第三の増幅産物は、同一の反応において産生することができる。

第二の態様によると、サンプル中に存在する標的核酸分子の定量された量およびサンプル中に存在する各標的核酸分子の検出された存在の両方を解析することにより、サンプル中に存在する複数の標的核酸分子のそれぞれの定量的多重検出を実施する段階をさらに含む、上述の方法がある。

第三の態様によると、サンプル中の一以上の標的核酸分子の存在は、そのサンプル中の病原体の存在を示す。該方法は、サンプル中の少なくとも二つの標的−病原体、遺伝子、ＳＮＰｓ、特異的な核酸配列等−を検出、定量および／または同定することができる。

第四の態様によると、複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の領域を同定する段階は：（ｉ）複数の標的核酸分子のそれぞれの核酸配列の少なくとも一つのセグメントの配列アラインメントを実施する段階；（ｉｉ）配列アラインメントに基づいて第一の領域を同定する段階；（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅の間に第一の領域を増幅できる第一のプライマーおよび第二のプライマーを設計する段階；および（ｉｖ）領域のＰＣＲ増幅の間に第一の領域にハイブリダイズできるプローブを設計する段階、を含む。該プローブは、第一のプライマーの融解温度および第二のプライマーの融解温度よりも少なくとも６℃高い融解温度を有するように設計されうる。

第五の態様によると、複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域を同定する段階は：（ｉ）複数の標的核酸分子のそれぞれの核酸配列の少なくとも一つのセグメントの配列アラインメントを実施する段階；（ｉｉ）配列アラインメントに基づいて第二の領域を同定する段階；および（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅の間に第二の領域を増幅できる第一のプライマーおよび第二のプライマーを設計する段階、をさらに含む。該方法はまた、複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域にハイブリダイズできる相補的なプローブを設計する段階を含みうる。

第六の態様によると、複数の標的核酸分子の少なくとも一つを検出するためのシステムが提供される。該システムは：（ｉ）複数の標的核酸分子の少なくとも一つを含むサンプル；（ｉｉ）第一のプライマーペア、該第一のプライマーペアは第一の増幅産物を産生するために複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の領域を増幅することができ、ここに、該第一の領域は複数の標的核酸分子の間で保存されるものである；（ｉｉｉ）リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）装置（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、ここに、該ＰＣＲ装置は第一のプライマーペアを用いて第一の増幅産物を産生することができ、かつさらにリアルタイムで第一の増幅産物を検出することができるものである；（ｉｖ）第二のプライマーペア、該第二のプライマーペアは第二の増幅産物を産生するために複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域を増幅することができ、ここに、該第二の領域は複数の標的核酸分子の間で保存されないものである；（ｖ）第二の増幅産物を検出するための検出デバイス、を含む。一実施態様によると、該システムは、以下：第一の領域にハイブリダイズする第一の核酸プローブ；および第二の領域にハイブリダイズする第二の核酸プローブ、ここに、該第二の核酸プローブはマイクロアレイなどの基質に固定されうるものである、の一以上をさらに含む。

第七の態様によると、該システムは、以下：（ｉ）第三のプライマーペア、該第三のプライマーペアは第三の増幅産物を産生するために第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の領域を増幅することができ、ここに、該第三の領域は第二の複数の標的核酸分子の間で保存されるものである；および（ｉｉ）サンプルから核酸を精製する手段、の一以上をさらに含むことができる。

第八の態様によると、該システムは複数の標的核酸分子の少なくとも一つをサンプル中に検出するためのキットである。

第九の態様によると、複数の標的核酸分子の少なくとも一つを検出するためのキットが提供され、該キットは：（ｉ）第一のプライマーペア、該第一のプライマーペアは第一の増幅産物を産生するために複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の領域を増幅することができ、ここに、該第一の領域は複数の標的核酸分子の間で保存されるものである；（ｉｉ）第一の領域にハイブリダイズする第一の核酸プローブ；（ｉｉｉ）第二のプライマーペア、該第二のプライマーペアは第二の増幅産物を産生するために複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域を増幅することができ、ここに、該第二の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されないものである；および（ｉｖ）第二の領域にハイブリダイズする第二の核酸プローブ、を含む。

第十の態様によると、該キットは、以下：（ｉ）マイクロアレイ；および（ｉｉ）サンプルから核酸を精製する手段、の一以上をさらに含むことができる。

第十一の態様によると、該キットは、第三のプライマーペアが第三の増幅産物を産生するために第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の領域を増幅することができ、第三の領域が第二の標的核酸分子の間で保存されるものである場合、第三のプライマーペアをさらに含む。

本発明は、添付図面と併せて以下の詳細な説明を読むことにより、より完全に理解され明らかとなるであろう：

図１は本発明の一態様による方法の高レベルな概略図である；

図２は、以下のバクテリア；肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）および大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の２３ＳリボソームＲＮＡ（「ｒＲＮＡ」）のアラインメントであり、アラインされた（ａｌｉｇｎｅｄ）配列の上方左側および下方右側の矢印内にＴＱＲプライマー配列を、かつアラインされた配列の上方右側に位置する矢印内にＴＱＲプローブ配列を示す；

図３は、同一の５種のバクテリア由来の１６Ｓ ｒＲＮＡのアラインメントであり、アラインされた配列の上方左側および下方右側の矢印内にＴＤＲプライマー配列を、かつアラインされた配列間の変動性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）の固有の位置においてアラインされた配列全体に分布している矢印内にＴＤＲプローブを示す；

図４は、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）の６種のバリアント由来のゲノム配列のアラインメントであり、矢印は上流および下流のプライマーを同定し、ｑｒｔ−ＰＣＲプローブになりうる領域は四角で囲まれている；

図５は、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）の６種のバリアント由来のゲノム配列のアラインメントであり、矢印は上流および下流のプライマーを同定し、マイクロアレイプローブになりうる位置は四角で囲まれている；

図６は、本発明の一態様によるｑｒｔ−ＰＣＲの結果の増幅プロットである；

図７Ａは、本発明の一態様によるマイクロアレイの編成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を表す表である；

図７Ｂは、図７Ａで編成されたマイクロアレイを用いるマイクロアレイ解析の結果を示す、ドットはハイブリダイゼーションを表す。

発明の詳細な説明
本発明の一態様によると、リアルタイム核酸増幅システムの定量的能力とハイブリダイゼーションシステムの多重化能力を組み合わせるための方法およびシステムがある。例えば、本明細書において、たとえ核酸配列、種、または株が遠縁または近縁のいずれかであっても、二以上の遺伝子、種、または株を含有するサンプルにおける標的核酸配列、種、または株を定量的に解析するための方法およびシステムが記載される。

本明細書で用いられる用語「核酸」は、ヌクレオチドの鎖（すなわち、交換可能な有機塩基に連結された糖を含む分子）を指す。用語「核酸」はまた、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチド、ならびにポリヌクレオシド、およびアデニン、ウラシル、グアニン、チミン、シトシンおよびイノシンを含むがこれらに限定されない、核酸を含有する任意の他の有機塩基を指すことができる。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、また、天然源から、あるいは合成プロセスを通して獲得されてもよい。

ここで図面を参照すると、同じ参照番号は全体にわたって同じ部分（ｐａｒｔ）をさすものであり、図１に、本発明の一実施形態による、サンプル中の核酸の定量的同定のための方法の高レベルな概略図が見られる。この方法での最初の段階として、サンプルが解析のために獲得される。サンプルは、記載される方法のために用いることができる任意のサンプルであってもよい。例えば、サンプルは、その他多数のうち、一以上の核酸配列、種または株を含有するように獲得できる。具体的な例として、サンプルは、食料から獲得された、動物またはヒトから獲得された、または環境から獲得された任意のサンプル、ならびに、例えば、病原性または非病原性の微生物などの微生物の同定のために獲得された任意の他のサンプルとすることができる。

従って、本明細書に記載される方法、デバイスおよびシステムの多くの用途の中には、病原性および／または非病原性の微生物の潜在的に複雑な混合物（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅ）に見られる、一以上の微生物を同定することがある。例えば、潜在的に複雑な混合物は、様々な界（ｋｉｎｇｄｏｍｓ）、門（ｐｈｙｌｕｍｓ）、網（ｃｌａｓｓｅｓ）、目（ｏｒｄｅｒｓ）、科（ｆａｍｉｌｉｅｓ）、ならびに、その他多数のうち、バクテリア属である、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む多数の属（ｇｅｎｅｒａ）、および、その他多数のうち、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）およびトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）などのウイルス科由来の、多数の種類および株の病原性および／または非病原性微生物を含みうる、ヒトまたは動物から獲得される血液サンプルまたは培養物とすることができる。潜在的に複雑な混合物はまた、その他多数のうち、土壌サンプル、大気サンプル、水サンプルおよび表面サンプル由来を含む、任意の他の微生物群（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）から獲得されたサンプルとすることができる。

サンプルが獲得されるとすぐに、サンプルから核酸が回収される。一実施形態では、サンプル中の生物学的物質、例えば、細胞または組織が、サンプル調製プロセスにおいて溶解される。別の実施形態では、生物学的物質が抽出に供される。化学的、機械的、電気的、超音波、熱等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている任意の生物学的抽出プロトコールを、本発明の方法と共に用いることができる。とりわけ、ＱＩＡＧＥＮ^登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^登録商標およびＰｒｏｍｅｇａ^登録商標などの供給者により製造または販売される核酸精製用の市販キットを含む、当技術分野で知られている任意の核酸抽出および精製媒体（ｍｅｄｉａ）を、対象の核酸の単離のために用いることができる。

サンプルからの核酸の配列特異的または生物特異的回収であることに加え、該プロセスは、代替的に、サンプルからの全てまたはほとんどの核酸を獲得するように設計されうる。後者は、例えば、サンプル中の潜在的な生物の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が未知の状況において、特に有利であるだろう。一実施形態によると、核酸は、本明細書に記載されるプロセスの次の段階での即時使用に適している核酸をもたらす方法を用いて獲得される。

標的定量領域

この実施形態の段階１１０で、第一の固有の領域が各標的に対して位置する。この第一の領域は、標的間で保存的な領域であり、例えば、標的定量領域（「ＴＱＲ」）と呼ぶことができる。一実施形態では、ＴＱＲは、様々なバクテリア科（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆａｍｉｌｉｅｓ）などの、関連微生物（ｒｅｌａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の公知の組のために決定される。別の実施形態では、ＴＱＲは、病原性株および非病原性株の両方を含む一組の大腸菌株などの、より近縁の微生物の公知の組のために決定される。

図２に示されるのは、標的間のＴＱＲを同定するために用いられる５種の異なるバクテリア由来のゲノムの一部分の配列アラインメントである：肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）および大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）。図２に示されるアラインメントは、２３ＳリボソームＲＮＡ（「ｒＲＮＡ」）をコードする、各生物由来のＤＮＡ配列をアラインする。多くの微生物が一より多いコピーの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を含有しているが、これらの生体内（ｉｎｔｒａ−ｏｒｇａｎｉｓｍ）配列は非常に高度に保存される傾向がある。例えば、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は８コピーの２３Ｓ ｒＲＮＡを有し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は７コピーを有し、ミラビリス変形菌（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）は７コピーを有し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は５コピーを有し、また大便連鎖球菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）は４コピーを有する。２３Ｓ ｒＲＮＡは、原核生物の５０Ｓ大サブユニットの構成要素であり、典型的にはこの特定のｒＲＮＡのリボソームペプチジルトランスフェラーゼ活性を担う。２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の構造上の、この、また恐らくは他の機能的制約の結果として、該配列は生物間で高度に保存された特定の領域を含有する。図２における配列アラインメントで実証されるように、２３Ｓ ｒＲＮＡのこの領域は５種のバクテリア間で高度に保存される。

図１に示される方法における段階１２０で、プライマーおよび蛍光プローブがＴＱＲのために設計される。図２に示される５種のバクテリアが高度に保存された領域を有するので、このＴＱＲは、５種のバクテリア全てに対する単一セットのフォワードおよびリバースプライマー（図２に示される、フォワードプライマー「ＵＴＩ−２３Ｓ−２ ｆｏｒ」およびリバースプライマー「ＵＴＩ−２３Ｓ−２ ｒｅｖ」を参照）を用いて、ｑｒｔ−ＰＣＲの間、増幅することができる。従って、同一のプライマーが、描かれるバクテリアの５種全てから獲得されたＤＮＡ由来のこの領域を増幅することができるだろう。代替的な実施形態では、各標的のＴＱＲを特徴的な（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ）プライマーのセットで増幅することができ、または、多数の標的を一以上のグループで増幅することができる。ＰＣＲ増幅に加えて、当技術分野で知られている増幅のための他の方法および技術を用いて、本明細書に記載される方法によって増幅される、この、あるいは任意の他の核酸配列を増幅および／または解析しうることに留意すべきである。これは、数ある方法の中から、核酸配列をベースとする増幅（「ＮＡＳＢＡ」）を含むことができるが、これらに限定されない。

ｑｒｔ−ＰＣＲプライマーの特異的な設計は、本発明の一態様である。図２に示されるように、ＴＱＲ領域は、フォワードプライマー「ＵＴＩ−２３Ｓ−２ ｆｏｒ」（ＡＴＣＧＣＴＣＡＡＣＧＧＡＴＡＡＡＡＧ）およびリバースプライマー「ＵＴＩ−２３Ｓ−２ ｒｅｖ」（ＣＣＧＡＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣ）を用いて、５種のバクテリアから増幅される。しかしながら、ｑｒｔ−ＰＣＲプローブは、配列ＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧを含み、図２に描かれる位置「ＵＴＩ−２３Ｓ−２ プローブ」でアニールするように設計される。ＴＱＲの増幅およびプローブの結合を促進するために、プローブの融解温度または「Ｔｍ」は、フォワードおよびリバースプライマーのＴｍよりも優先的に（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）６−８℃高い。従って、プライマー、プローブおよびアンプリコンは、他のプロフィールは可能ではあるが、表１に記載される特徴を有することができるだろう。

表１ プライマー、プローブおよびアンプリコンの特徴

図２で描かれる例では、例えば、プライマー「ＵＴＩ−２３Ｓ−２ ｆｏｒ」および「ＵＴＩ−２３Ｓ−２ ｒｅｖ」ならびにプローブ「ＵＴＩ−２３Ｓ−２ プローブ」は、表２に記載される特徴を有する。

表２ プライマーおよびプローブ

ＴＱＲを決定するための方法の一実施形態がここに記載される。この例では、ヒトパピローマウイルス（「ＮＰＶ」）のためのＴＱＲが決定されている。最初の段階として、二以上の種類のＨＰＶに対して、アラインメントツリーが作成される。アラインメントは標的のゲノムのサブセットとすることもでき、または標的の全ゲノムとすることもできる。アラインメントされるとすぐに、ユーザーまたはコンピュータープログラムは最も類似する配列を検索する。

次いで、一以上のセットの適切に類似する配列がユーザーまたはコンピュータープログラムにより検索され、ｑｒｔ−ＰＣＲプローブのための領域を同定することができる。一実施形態では：（ｉ）アラインされた配列間で同一であり；かつ（ｉｉ）１５ヌクレオチド以上の長さである、ＴＱＲ候補を同定することが望ましい。その後、一以上の同定されたプローブ領域候補の一以上の特徴が、ユーザーまたはコンピュータープログラムにより解析される。これは、それぞれのプローブ領域候補に関するＴｍ、ＧＣスコアおよび／または二次構造スコアを含めることができる。例えば、表３は、各領域候補の計算されたＴｍ、ＧＣ含量および二次構造スコアと共に、アラインメントにおいて同定されたプローブ領域候補の選択を提示する。この例では、配列＃１が最も高いＴｍ（６４．５℃）を有し、そのため、これまで議論された理由で、最も適したプローブとしての機能を果たす。

表３ プローブ配列候補

ＴＱＲを決定する方法における次の段階として、プローブ候補の周辺の領域が解析される。該方法の一実施形態では、以下の段階：（ｉ）最も望ましい特徴を有するプローブ配列候補（例えば配列＃１）を選択する段階；（ｉｉ）アラインされた配列のための「標準ＰＣＲ」ペアを同定するために、同定された配列の各側に隣接するおよそ２００ｂｐを解析する（すなわち、全ての標的で保存される、同定されたプローブ配列の上流および下流の両方の保存された領域を同定しようと試みる−これらの保存された領域は、上流および下流プライマーのための結合部位として潜在的に機能することができる）段階；および（ｉｉｉ）プローブと調和する（すなわち、プライマーのＴｍがプローブのＴｍのおよそ６℃未満である）プライマーをもたらす、隣接する領域を同定する段階、が実施される。

ＴＱＲのためのプライマーを設計するための方法の一実施形態の例が、図４に示される。この例では、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）のためのＴＱＲのためのプライマーが設計されている。ＨＣＶの６種のバリアントが、色分けされた塩基により、図４においてアラインされる。図中の四角で囲まれている領域は、ｑｒｔ−ＰＣＲプローブ領域候補に適した特徴を有するとして選択され、プローブ領域候補に隣接する領域を解析して、上流および下流プライマーのための（矢印により同定される）結合部位を同定した。

標的識別領域（Ｔａｒｇｅｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｒｅｇｉｏｎ）

図１に描かれる方法のこの実施形態の段階１１０でもまた、第二の固有の領域が各標的に位置する。上述のＴＱＲとは対照的に、第二の領域は標的の中で特徴的である領域であり、例えば、標的識別領域（「ＴＤＲ」）と呼ぶことができる。図３に示される配列アラインメントは、ＴＤＲ(標的の中で特徴的な領域）を同定するために用いられる同一のバクテリア（肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）および大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ））由来のゲノムの一部分を描く。アラインメントは、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする各生物由来のＤＮＡ配列をアラインする。１６Ｓ ｒＲＮＡは原核生物リボソームの３０Ｓサブユニットの構成要素であり、また、とりわけ、原核生物リボソームの５０Ｓおよび３０Ｓサブユニットの結合における足場（ｓｃａｆｆｏｒｌｄ）および補助（ａｉｄｉｎｇ）として作用することを含む、細胞内でのいくつかの機能を有する。

図１に示される方法での段階１３０では、マイクロアレイを用いるＴＤＲの検出のために、マイクロアレイプローブが設計される。図３における配列アラインメントが実証するように、１６Ｓ ｒＲＮＡのこの領域は、高度に保存されるサブ領域（ｓｕｂ−ｒｅｇｉｏｎ）ならびにそれほど高度に保存されてはいないサブ領域を含有する。このようなアラインメントの一つの利点は、同一のフォワード（「ＵＴＩ＿Ｆｏｒ＿０１０１１１−１」）およびリバース（「ＵＴＩ＿Ｒｅｖ＿０１０１１１−１」）プライマーを採用して、重要な配列相違を含有するであろう、全ＴＤＲを増幅することができることである。言い換えれば、マイクロアレイ上のプローブは、標的のうちの一つだけに相補的であることにより、それらがバクテリア間を識別できるように、設計することができる（あるいは、ユーザーの要望に応じて、一より多い標的−例えば、ユーザーは、関連する標的（ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔ）のサブセットを、そのサブセットにおける個々の間の識別をせずに認識するためのシステムを、そのサブセットでのみ見出される領域に対して相補的であるプローブを設計することにより、設計することができた、等）。図３に示される例では、マイクロアレイ上に見られるプローブ−肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）についてＫＰ−１−２０１１０１１２およびＫＰ−２−２０１１０１１２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてＥＣ−１−２０１１０１１２、ミラビリス変形菌（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）についてＰＭ−１−２０１１０１１２、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）についてＳＡ−１−２０１１０１１２およびＳＡ−２−２０１１０１１２、ならびに大便連鎖球菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）についてＥＦ−１−２０１１０１１２によって描かれる−が、示される領域だけで、標的バクテリアだけに結合するように設計された。

ＴＤＲのためのプライマーを設計するための方法の一実施形態の例が、図５に示される。この例では、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）のためのＴＤＲのためのプライマーおよびプローブ候補が実施される。ＨＣＶの６種のバリアントが、色分けされた塩基により、図５においてアラインされる。上流および下流プライマーが矢印で表され、３つのプローブ領域候補が四角で囲まれている。

ｑｒｔ−ＰＣＲ増幅

図１に示される方法での段階１４０では、ＴＱＲおよびＴＤＲの両方が増幅される。ｑｒｔ−ＰＣＲ反応は、適したアンプリコンをもたらす−あるいは、もたらすと予測される−ＰＣＲ増幅の任意の方法を用いて実施することができる。一実施形態によると、ＰＣＲ反応は、ｑｒｔ−ＰＣＲ反応の実施の前に、他のバリエーションのうち、一以上のプライマーの濃度を変更すること、アニーリングもしくは伸長温度を変更すること、および／または伸長時間を変更することを含むがこれらに限定されない、ＰＣＲ反応を最適化するための様々な既知の方法のいずれかを用いて最適化される。

本方法の一実施形態によると、単一のＰＣＲリアクターおよび／または反応を用いて、多数の標的（配列、遺伝子、属、種、株、等）のＴＱＲおよびＴＤＲの両方を増幅する。この方法によれば、各標的のＴＱＲのための上流および下流のプライマーは同一であり（例えば、図２を参照）、全ての標的のＴＱＲを増幅するために、単一セットのプライマーの使用を必要とする。同様に、各標的のＴＤＲのための上流および下流のプライマーは同一であり（例えば、図３を参照）、全ての標的のＴＤＲを増幅するために、単一セットのプライマーの使用を必要とする。この実施形態によると、ＰＣＲ反応は同時あるいは順番に実施できる。

別の実施形態によると、個別のＰＣＲ反応を用いて、ＴＱＲ領域およびＴＤＲ領域を増幅する。ＴＱＲ反応は定量段階のために用いられるｑｒｔ−ＰＣＲ反応であるだろう、またＴＤＲ反応は、その他多数のうち、マイクロアレイ分析などの、下流の適用のために用いられるであろう。この実施形態によると、個別のＰＣＲ反応を、同一の熱サイクリングデバイス内または上で起こすことができ、あるいは完全に異なる装置で起こすこともできる。

図１に示される方法での段階１５０では、ＴＱＲ増幅はｑｒｔ−ＰＣＲ反応の間に検出される。ｑｒｔ−ＰＣＲ産物を定量するために用いることができる可能な方法がいくつか存在する。例えば、二本鎖ＤＮＡ産物内に組み込まれる非特異的蛍光色素を利用することができ、または、プローブが標的配列にハイブリダイズする場合にのみ蛍光を発することができる蛍光レポーターで標識された、配列特異的プローブを利用することができる。これらの方法が採用される場合、蛍光検出器が必要とされる可能性がある。蛍光データが収集されると、ｑｒｔ−ＰＣＲ産物は標準的な方法を用いて定量することができる。本方法の段階１５０に続いて、当技術分野において知られている方法を用いて、サンプルについての定量的情報が決定される。

例えば、図６は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）および大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＤＮＡならびに図１に描かれるプライマーおよびプローブを用いる、ｘ軸上に熱サイクラーのサイクル数、およびデルタＲｎ数−実験反応の標準化レポーター（「Ｒｎ」）値ひくベースラインシグナルのＲｎ値、を備える、ｑｒｔ−ＰＣＲ反応の結果の増幅プロットの例である。

マイクロアレイ検出

図１に示される方法での段階１６０では、ＴＤＲからのアンプリコンが、当技術分野で知られている多数の技術または方法を用いてＤＮＡマイクロアレイにさらされる。例えば、ＴＤＲ反応からのアンプリコンは、マイクロアレイに貼り付けられた相補的なプローブにＴＤＲアンプリコンがハイブリダイズするように、ＤＮＡスポットに流すことができる。非結合または非特異的結合した核酸は、好ましくは洗浄され、結合され標的だけを後に残す。

段階１６０で用いられるマイクロアレイは一般に、一以上のＴＤＲプローブが固定された、固相基板（ｓｏｌｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を含むだろう。ＴＤＲ反応からのＴＤＲ配列アンプリコンとの相補的な相互作用の特異的な検出のため、ＴＤＲプローブは、基板の未処理あるいは処理済みの表面上に、好ましくは共有結合を介して、固定される。ＴＤＲアンプリコンは基板の表面上に導入される標的溶液を通してアプライされる。プローブ領域は、任意の側面上で、密閉された（ｈｅｒｍｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｅａｌｅｄ）あるいは開放されているチャンバー内にあってもよい。基板は熱伝導性であり、ハイブリダイゼーションおよび酵素反応のための、制御可能な温度および／または環境を提供する、温度制御装置または加熱源に連結される、あるいはさらされる。

結合した標的は、それが結合した各ＤＮＡスポットでシグナルを生成し、かつ、シグナル検出器が、マイクロアレイ上のそれらの既知の位置に基づき、プローブおよび標的の同定を決定しながら、シグナルを検出することができる。スキャナは検出素子（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）に適したレシーバを用いて、ハイブリダイズしたプローブ配列の存在を検出する。例えば、検出素子が蛍光分子である場合、スキャナは蛍光性のハイブリダイゼーションシグナルの検出のための蛍光スキャナである。スキャナの出力は、検出シグナルの解析のためのプロセッサに提供され、該プロセッサは検出された標的ヌクレオチド配列を解析し、評価することができる。評価（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）とは、プローブとヌクレオチド配列の間に形成されるハイブリッドの定量的および／または定性的な決定をさす。これは、ハイブリッドの量もしくは濃度の絶対値、またはハイブリッドのレベルを示す値のインデックスもしくは比率とすることができる。

メモリデバイス（単数または複数）をＴＤＲマイクロアレイシステムに関連させてもよく、スタティックランダムアクセスメモリ、ダイナミックランダムアクセスメモリ、同期型ダイナミックランダムアクセスメモリ、および／またはダブルデータレートＳＤＲＡＭもしくはＤＲＡＭなどの、デジタル情報を保存するように適合された様々な異なる種類のメモリデバイス、ならびに読出し専用メモリなどの標準的な不揮発性メモリにて、具体化してもよい。メモリデバイスは、ハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、フラッシュドライブ、光ディスクドライブ等のような他のストレージデバイスへのデータの移送を許可するメモリインターフェースを介して、周辺のメモリストレージシステムバリエーションにて、具体化してもよい。

ＴＤＲマイクロアレイ検出システムを用いて、非常に多くの核酸を同時に分析することができる。該システムは、基板表面上に固定されたオリゴヌクレオチドまたは核酸のアレイを含む、ジーンチップまたはバイオチップシステムと併せて用いることができる。かかるマイクロアレイは、ＲＮＡサンプルのスクリーニング、一塩基多型、検出、変異解析、疾患または感染診断、ゲノム比較、および他の同様の適用などの、任意の適切な目的のために用いることができる。

例えば、図７Ａはマイクロアレイの編成を表す表であり、「ＳＡ」は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）であり、「ＥＣ」は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、「ＥＦ」は大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）であり、「ＰＭ」はミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）であり、かつ「ＫＰ」は肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。各記号は、図３で同定されるＴＤＲプローブなどのＴＤＲプローブを表す。図７Ｂは、図７Ａで編成されたマイクロアレイを用いるマイクロアレイ解析の例であり、ドットはこれまでの段階に由来するアンプリコンと図７Ａに記載されるプローブの間のハイブリダイゼーションを表す。例えば、レーン１（「Ｎｅｇ」）はコントロールレーンであり、どの微生物プローブもハイブリダイゼーションを示さない。レーン３（「ＫＰ」）は、対照的に、ＫＰ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＤＲ産物と、ＫＰ−２（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）プローブを含む二つのＤＮＡドットとの間のハイブリダイゼーションを表す、さらなる数個のスポットを有する。同様に、レーン５（「ＳＡ］）は、ＳＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＴＤＲ産物と、ＳＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プローブ（すなわち、ＳＡ−１およびＳＡ−２）を含む４つのＤＮＡドットとの間のハイブリダイゼーションを表す、数個のスポットを示す。また、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＴＤＲ産物の両方を含むレーン７（「ＳＡ／ＫＰ」）は、ＳＡプローブおよびＫＰプローブ両方に対するハイブリダイゼーション事象を示す。レーン７が表すように、本明細書に記載される方法によるマイクロアレイシステムは、二以上の異なるバクテリア株を区別する（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ）ことができる多重検出システムを提供する。ｑｒｔ−ＰＣＲ段階と共に、該システムは高度に定量的に多重化された検出システムを提供する。

定量されたアンプリコンの多重検出が、ＤＮＡマイクロアレイに関して上述されるが、当業者であれば、数ある技術の中でも、質量分析法、遺伝子発現連鎖解析（「ＳＡＧＥ」）、ハイ−スループットシークエンス、ならびにその他多数のハイブリダイゼーション方法を含むがこれらに限定されない、多重検出の他の方法が可能であることを認識するだろう。二以上のＤＮＡ配列、遺伝子、生物、病原体、株または種の多重識別が可能な任意の方法、技術、システムまたは手段を、ｑｒｔ−ＰＣＲの検出のために用いることができる。

材料および方法

リアルタイムＰＣＲ

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および大便連鎖球菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＤＮＡは、Ｒｈｅｏｎｉｘ，Ｉｎｃ．の研究所にて調製された。肺炎桿菌（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１７０６Ｄ−５）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１７１８Ｄ−５）およびミラビリス変形菌（ＡＴＣＣ １２４５３Ｄ）などの他のＤＮＡは、非営利生物資源センターＡＴＣＣから入手した。

各ＤＮＡの濃度は、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ^登録商標２０００）により測定された。全てのＤＮＡがμｌあたり１０Ｋコピーとなるよう希釈された。この溶液はストックとしての役割を果たし、作用濃度へＤＮＡをさらに希釈した。総核酸が、Ｒｈｅｏｎｉｘ，Ｉｎｃ．の研究所にて培養されたヒト細胞株（Ｃ３３Ａ）から単離され、測定された。３２ナノグラム（３２ｎｇ）の精製された核酸をＰＣＲ反応混合液にてバックグラウンドとして用いて、ヒトサンプルの１０，０００ゲノムに相当する核酸を再現（ｍｉｍｉｃ）した。

２３Ｓリボソーム遺伝子（図２を参照）に対するカスタムデザインプローブおよびプライマーミックス（Ｐｒｉｍｅ Ｔｉｍｅ Ａｓｓａｙ）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（「ＩＤＴ」）から入手した。Ｐｒｉｍｅ Ｔｉｍｅ Ａｓｓａｙミックスを、ＩＤＴの推奨に従って、ＩＤＴＥバッファー（１０ｍＭトリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に再懸濁した。簡単に説明すると、ＩＤＴ Ｐｒｉｍｅ Ｔｉｍｅ凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）ａｓｓａｙを２００μｌのＩＤＴＥ（１Ｘリファレンス色素含有）に再懸濁し、１０Ｘ（５μＭプライマーおよび２．５μＭプローブ）濃度のプローブおよびプライマーミックスを得た。少量ずつに分けて褐色瓶内で−２０℃で保存した。

ＴａｑＭａｎ−ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＰＮ＃４３０４４３７）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ^登録商標から購入した。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ^登録商標リアルタイムＰＣＲシステムを用いて、全ての定量的ＰＣＲ試験を実行した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ^登録商標ファーストオプティカル９６ウェル反応プレート（ＰＮ＃４３４６９０６）がＰＣＲ反応に用いられた。ＰＣＲ反応プレートを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＭｉｃｒｏＡｍｐ^登録商標オプティカル粘着フィルム（ＰＮ＃４３６０９５４）を用いて、ランの実行前にシールした。

リアルタイムＰＣＲ反応は、環境からのあらゆる潜在的なコンタミネーションを避けるために、無菌条件下でセットアップされた。試薬は層流フード内で開封され、微生物ＤＮＡを持ち込む前にＰＣＲ反応をセットアップした。

ＰＣＲ反応は以下のように準備された：サンプルの数が数えられた。各サンプルを、陰性コントロール（ＤＮＡなし）を含めてトリプリケートでセットアップした。各サンプルの量を２０μｌに維持した。セットアップは、エッペンドルフチューブにヌクレアーゼフリーの水を添加することから開始し、続いて２ＸユニバーサルＰＣＲマスターミックスが１Ｘの終濃度となるように添加された。プローブおよびプライマーミックスを含有する１０Ｘ Ｐｒｉｍｅ Ｔｉｍｅ Ａｓｓａｙを添加して、１Ｘ濃度（５００ｎＭプライマーおよび２５０ｎＭプローブ）を得た。バックグラウンドＤＮＡ（Ｃ３３Ａ）を添加し、ボルテックスして、マスター反応ミックスを混合した。内容物をスピンダウンした。ＰＣＲマスター反応ミックスを、次いで、特定の微生物のためにラベルされた個々のチューブ内に分配（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅ）した。各リアルタイムＰＣＲサンプルは２０μｌであり、それゆえ、トリプリケートには６０μｌの反応ミックスを含めた。５７μｌのマスター反応ミックスをラベルされた各チューブに分配し、次いで、３μｌの既知のコピーの標的ＤＮＡが各チューブに添加された。ＤＮＡはＩＤＴＥで希釈されたので、３μｌのＩＤＴＥを陰性コントロールに添加して、全量を作製した。

表４ ５００μｌ反応ミックス

サンプルを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ^登録商標ファーストオプティカル９６ウェル反応プレートに、トリプリケートで、気泡が入らないように注意して分配した。次いで、プレートをフィルムでシールし、ランのために既にプログラムされたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲマシーンに持ち込んだ。

ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ装置およびコンピューターの電源を入れ、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓソフトウェアにログインし、「アドバンスセットアップ」を選択する。これにより、実験特性を選択するためのウィンドウが開く。リアルタイムＰＣＲのため、「ＴａｑＭａｎ 試薬」が、「２時間標準ＰＣＲ増幅」で選択された。次の段階は、「標的およびサンプルの定義付け」である。各サンプルが個々に命名された。「プレートレイアウト」セットアップにおいて、標的はサンプルを含有するウェルに配分され（ａｓｓｉｇｎｅｄ）、該サンプルは各ウェルに個々に配分され、ラベルされた。個々のサンプルおよびそれらの位置を、「ウェルテーブルを見る（Ｖｉｅｗ Ｗｅｌｌ Ｔａｂｌｅ）」ウィンドウでさらに確認した。その後、セットアップウィンドウに戻り、パッシブフルオロフォア−この場合ＲＯＸであった−が選択された。次の段階は、「ラン方法（Ｒｕｎ Ｍｅｔｈｏｄ）」ウィンドウを選択することであった。熱サイクル条件は、２０μｌである反応量を選択した後に、追加された。

以下は、リアルタイムＰＣＲ反応において用いられた熱サイクリング条件である：（ｉ）３７℃ １０分間でのＡｍｐＥｒａｓｅ活性化（ＡｍｐＥｒａｓｅ、アンプリコンのコンタミネーションが反応溶液に存在する場合、コンタミネーションしているアンプリコンを分解する酵素、を含有する２ＸユニバーサルＰＣＲマスターミックス）；（ｉｉ）９５℃ ２分間での事前変性（ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）；および（ｉｉｉ）以下を４０サイクル：（ａ）９５℃ ３０秒間での変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）；（ｂ）６０℃ ３０秒間でのアニーリング；および（ｃ）７２℃、３０秒間での伸長。

実験を保存し、「ラン」ボタンをクリックした。「プレートレイアウト」中のサンプルを強調して、サイクルがモニターされた。次いで、対数または線形範囲で、ランｖｓサイクル、ｄランｖｓサイクルまたはＣＴ値などのパラメーターを選択するために、「解析」ウィンドウが選択された。プロットの色は、サンプルまたは標的を選ぶことにより選択しうる。ランの終了時、データが解析のためにエクスポートされた。

マイクロアレイ解析

以下の材料をマイクロアレイ実験に用いた：アレイにスポットされた特異的な捕捉プローブを備えるリバースドットブロット（「ＲＤＢ」）；アンプリコン（ビオチン化プライマーを用いて特異的標的から増幅された、ＰＣＲ増幅産物１６Ｓ）；０．１Ｎ ＮａＯＨ；プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションバッファー（３Ｘ ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびＥＤＴＡバッファー ｐＨ７．５）および０．１％ ＳＤＳ）；ＲＤＢ洗浄バッファー（１Ｘ ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳ）；ホースラディッシュペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）；および３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（「ＴＭＢ」）。

水浴および攪拌機（ａｇｉｔａｔｏｒ）が５２℃で予熱され、プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーションバッファーを水浴に置き、所要の温度に上げた。初期の熱サイクルから産生されたアンプリコンと適切にハイブリダイズするための解析膜上のマイクロアレイを調製するために、２５０μｌのプレハイブリダイゼーションバッファーがリザーバー内に分注（ｄｉｓｐｅｎｓｅ）され、１５分間のプレハイブリダイゼーションのために、リザーバー内にＲＤＢを設置した。５μｌのアンプリコンを、５分間、５０μｌのプレハイブリダイゼーションバッファーと共に９５℃で変性した。ＲＤＢがプレハイブリダイゼーション段階にある間、変性したアンプリコンは氷上静置された。変性したアンプリコン（５５μｌ）を、ＲＤＢを含有するリザーバーに添加し、５２℃で１５分間インキュベートした。それと同時に、一定分量（ａｌｉｑｕｏｔ）の洗浄バッファーを水浴に置き、５２℃に上げた。ハイブリダイゼーション後のＲＤＢフィルターを、５２℃で洗浄バッファーを含有する新たなリザーバーに置いた。ハイブリダイゼーション後の第一の洗浄を１０分間５２℃で実行した。プレハイブリダイゼーションバッファー、ハイブリダイゼーション、および第一の洗浄の間、攪拌機の温度は５２℃に保たれた。ＨＲＰ溶液（洗浄バッファーで１：５００希釈）を添加する前に、第二の洗浄が１０分間室温で実行された。ＲＤＢフィルターを室温で１５分間ＨＲＰバッファーと共にインキュベートした。フィルターを、次いで、１０分間室温で洗浄バッファーを用いて洗浄し、撹拌しながら３回繰り返した。ＴＭＢを添加することにより、発色反応が実行された。フィルターを、緩やかに撹拌しながら、室温で１０分間、ＴＭＢ中でインキュベートした。水で反応を停止した。最後に、画像を取り込み（ｃａｐｔｕｒｅ）、解析した。

定量的多重検出および同定のためのシステム

上述のように、該方法は：サンプルの調製および／または核酸の精製のための第一のデバイスまたは領域；ｑｒｔ−ＰＣＲ反応のための第二のデバイス；ｑｒｔ−ＰＣＲシグナルの検出のための第三のデバイス；マイクロアレイ解析のためのＴＤＲアンプリコンを調製するための第四のデバイスまたは領域；マイクロアレイを含む第五のデバイス；マイクロアレイシグナルの検出のための第六のデバイス；ならびに、一以上の解析デバイスまたは実験デバイスから得られたデータを用いる、取り込み（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）、処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、解析、可視化、またはその他のための、一以上のコンピューターデバイス（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）、を含む、一連の、物理的に分離したまたは異なる解析デバイスまたは実験デバイスを用いて実施することができる。マイクロアレイ解析が多重解析の別の方法により置き換えられる別の実施形態では、これらの実験デバイスおよび検出デバイスが、上記のマイクロアレイデバイスに代わるだろう。

本発明の一態様によると、該方法は、サンプル調製、ＰＣＲ、およびハイブリダイゼーションの電子検出が可能な単一のデバイス内および／または上で実行される。様々な実施形態では、該デバイスは、生体サンプルを受け取り、ｑｒｔ−ＰＣＲおよびＴＤＲのためのサンプルを調製することが可能なサンプル調製コンポーネント；サンプル調製コンポーネントからサンプルを受け取り、ｑｒｔ−ＰＣＲ結果をもたらすために、サンプル由来の核酸標的上でｑｒｔ−ＰＣＲを実施することが可能なｑｒｔ−ＰＣＲコンポーネント；サンプル調製コンポーネントからサンプルを受け取り、標的アンプリコンをもたらすために、サンプル由来の核酸標的上でＰＣＲを実施することが可能なＴＤＲ増幅コンポーネント；ＴＤＲ標的アンプリコンを受け取り、マイクロアレイの表面に結合したプローブへのＴＤＲ標的アンプリコンのハイブリダイゼーション事象を検出することが可能なマイクロアレイコンポーネント；ならびに、サンプル調製コンポーネント、ｑｒｔ−ＰＣＲコンポーネント、ＴＤＲ増幅コンポーネント、およびマイクロアレイコンポーネントを含む支持体、を含みうる。

本発明の一態様によると、出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｐｅｎｇ Ｚｈｏｕらによる、ＰＣＴ国際公開第２００９／０４９２６８ Ａ１号、発明の名称「統合型マイクロ流体デバイスおよび方法（”Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ”）」、において開示されるような、当技術分野において知られた統合型マイクロ流体デバイスにおいて、該方法が実行される。本明細書で開示される、サンプル中の対象の核酸標的を検出するための方法は、国際公開第２００９／０４９２６８ Ａ１号に開示される方法などの、当技術分野で知られた方法を用いて、分析ユニット、あるいは市販ではＣＡＲＤ^登録商標（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｅｖｉｃｅ））と呼ばれる、統合型マイクロ流体デバイスとともに使用するために、容易に適合させることができる。

「マイクロ流体」とは、一般に、小量の流体を処理するためのシステム、デバイス、および方法を指す。マイクロ流体システムは、流体を操作する多種多様の作業を統合できる。このような流体は、化学的または生物学的なサンプルを含みうる。これらのシステムはまた、生物学的分析（例えば、医学的診断、創薬、および薬剤送達のため）、生化学的センサー、または生命科学研究一般、ならびに、環境解析、工業工程のモニタリング、および食品安全試験など、多くの適用領域も有する。マイクロ流体デバイスの一つの種類は、マイクロ流体チップである。マイクロ流体チップは、流体を保持するための、チップ上における様々な位置から、様々な位置へと流体を移送する（ｒｏｕｔｉｎｇ）ための、かつ／または流体試薬を反応させるための、チャネル、弁、ポンプ、リアクター、および／またはリザーバーなど、マイクロスケールの形状特徴（または「マイクロフィーチャ」）を含みうる。

本発明の一態様によると、出典明示によりその全ての内容が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／０３３，１６５号、発明の名称「内蔵型生物学的分析装置、方法、および適用（”Ｓｅｌｆ−Ｃｏｎｔａｉｎｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙ Ａｐｐａｒａｔｕｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”）」、において開示されるような、内蔵型の完全自動化されたマイクロ流体デバイスおよびシステムにおいて、該方法が実行される。該デバイスは、筺体；筐体内に配置された、制御可能に移動可能な試薬分注システムを含む、分注プラットフォーム；筐体内に配置された、試薬供給コンポーネント；流体トランスポート層および複数のリザーバーに移動可能に連結された、分注プラットフォームにより共有される空間において、筐体内に移動可能に配置された、空気圧マニホールド、ここに、該流体トランスポート層、該リザーバー、およびそこに導入される試験サンプルは、分注プラットフォームから離れた空間において、筐体内に配置されるものである；分注プラットフォームから離れた空間において、筐体内の空気圧マニホールドに移動可能に連結された、空気圧供給システム；および筐体内に配置された、少なくとも一つの分注プラットフォームおよび空気圧供給システムに連結された、制御システム、を含む、内蔵型の完全自動化された生物学的分析実施装置を含む。

ＣＡＤＲ分注プラットフォームは、試薬分注システムに作動可能に連結された、動作制御システム、ここに、該試薬分注システムは、遠位側の分注端（ｄｉｓｔａｌ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｅｎｄ）を有する試薬分注コンポーネントを含むものである；およびリザーバーの対象の少なくとも一つの選択された領域を含む視野を有する、試薬分注システムに接続されたカメラをさらに含むことができる。カメラはまた、ｑｒｔ−ＰＣＲ反応から、好ましくは、他の構築（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は可能であるが、円錐型リアクターシステムを含む、フラットリアクターセットアップから、データを得るための光学系（ｏｐｔｉｃｓ）を含むことができる。ｑｒｔ−ＰＣＲ反応からデータを得るために用いられる光学系は、例えば、当業者に知られているいずれかとすることができる。

別の非限定的な態様によると、ＣＡＲＤシステムを用いる、核酸配列を単離、増幅および解析するための、自動化されたプロセスがある。該プロセスは、流体トランスポート層およびそこに配置された流体チャネル、ならびにそれらに付属するリザーバーを有するマイクロ流体システムを操作する、空気圧マニホールドを提供する段階；流体チャネル内に流体試験サンプルを導入する段階；流体トランスポート層と流体的に接続する（ｉｎ ｆｌｕｉｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）、少なくとも一つのそれぞれのリザーバーからチャネルへ少なくとも一つの試薬を提供する段階；流体トランスポート層、リザーバー、または増幅リアクターの領域において、流体試験サンプルと少なくとも一つの試薬を結合する段階；流体トランスポート層と作動可能に通信している、温度制御された（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｅｄ）増幅／反応リアクターへ、流体試験サンプルをトランスポートする段階；標的核酸配列の増幅をもたらすのに十分な条件下で、増幅／反応リアクターにおいて流体試験サンプルをインキュベートする段階；流体試験サンプルを解析リザーバーへトランスポートする段階；および試験サンプルから増幅された標的核酸配列を解析する段階、ここに、該試験サンプルは、流体トランスポート層における開始位置から、任意の他のサンプルから離れ、かつ空気圧マニホールドおよび分注システムから離れた、解析リザーバーへトランスポートされるものである、を含む。

本明細書で引用される、刊行物、特許出願、および特許を含む全ての文献は、各文献が個々にかつ具体的に示され、出典明示により組み込まれるのと、また、その内容の全てが本明細書に説明されるのと同程度に、出典明示により本明細書に組み込まれる。

本発明の説明に関連して（特に、以下の請求項に関連して）、用語「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および同様の指示語は、本明細書において特に明記しない限り、あるいは明らかに文脈と矛盾しない限り、単数形および複数形の両方に及ぶものと解釈される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断りのない限り、オープンエンド形式の用語（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する）として解釈される。用語「接続された（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」は、たとえ何かが介在していようと、部分的あるいは完全に、内部に含有されている、付属している、結合されている、として解釈される。

本明細書において特に明記しない限り、本明細書中の数値範囲の列挙は、単にその範囲内に該当する各値を個々に言及するための略記法としての役割を果たすことだけを意図しており、各値は、本明細書中で個々に列挙されるかのように、本明細書中に組み込まれる。

本明細書中で説明される全ての方法は、本明細書において特に明記しない限り、あるいは明らかに文脈と矛盾しない限り、あらゆる適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される、あらゆる例または例示的な言い回し（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、特に断らない限り、単に本発明の実施形態をより良く説明することだけを意図し、本発明の範囲に対する制限を設けるものではない。

明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠である、請求項に記載されていない要素を示すものとは解釈されないものとする。

本発明の精神と範囲を逸脱しない範囲で、本発明に種々の改良および変形ができることは、当業者には明らかであろう。本発明を開示された特定の形態（単数または複数）に限定するように意図しておらず、逆に、その意図は、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲に該当する全ての修正物、代替構築物、および均等物を包括することである。従って、本発明は、添付された請求項およびそれらの均等物の範囲内にあるという条件で、この発明の修正物および変形に及ぶ、ということが意図される。

Claims (39)

1. 複数の標的核酸分子の少なくとも一つをサンプル中に検出するための方法であって、
   第一の領域が前記複数の標的核酸分子間で保存される、前記複数の標的核酸分子の各々の第一の領域を同定する段階；
   前記サンプル中に存在する各標的核酸分子の第一の領域の第一の増幅産物を産生する段階；
   リアルタイムで前記第一の増幅産物の産生を検出する段階；
   第二の領域が前記複数の標的核酸分子間で保存されない、前記複数の標的核酸分子の各々の第二の領域を同定する段階；
   前記サンプル中に存在する各標的核酸分子の第二の領域の第二の増幅産物を産生する段階；および
   前記サンプル中に存在する各標的核酸分子の存在を示す、前記第二の増幅産物を検出する段階：
   を含む、方法。
2. 前記第一の増幅産物が、前記第一の領域にハイブリダイズする第一の核酸プローブの存在下で産生される、請求項１に記載の方法。
3. 前記増幅の間にリアルタイムで前記増幅産物を検出する段階が、前記第一の領域への前記第一の核酸プローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記第一の増幅産物を検出する段階が、前記サンプル中に存在する標的核酸分子の量を定量する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記第二の増幅産物を検出する段階が、相補的なプローブへ前記第二の増幅産物をハイブリダイズすることを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記相補的なプローブが基質に固定される、請求項５に記載の方法。
7. 前記基質がマイクロアレイである、請求項６に記載の方法。
8. 第三の領域が第二の複数の標的核酸分子間で保存される、前記第二の複数の標的核酸分子の第三の領域を同定する段階；
   前記サンプル中に存在する前記第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の領域の第三の増幅産物を産生する段階；および
   リアルタイムで前記第三の増幅産物の産生を検出する段階
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記第一の増幅産物および前記第三の増幅産物が、同一の反応において産生される、請求項８に記載の方法。
10. 前記サンプル中に存在する標的核酸分子の定量された量および前記サンプル中に存在する各標的核酸分子の検出された存在の両方を解析することにより、前記サンプル中に存在する前記複数の標的核酸分子のそれぞれの定量的多重検出を実施する段階
    をさらに含む、請求項４に記載の方法。
11. 前記サンプル中に存在する一以上の標的核酸分子の存在が、前記サンプル中の病原体の存在を示す、請求項１に記載の方法。
12. 該方法が前記サンプル中の少なくとも二つの病原体を検出することができる、請求項１に記載の方法。
13. 前記サンプル中に存在する一以上の標的核酸分子の存在が、前記サンプル中の特異的な核酸配列の存在を示す、請求項１に記載の方法。
14. 前記サンプルから核酸を精製する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の領域を同定する段階が：
    前記複数の標的核酸分子のそれぞれの核酸配列の少なくとも一つのセグメントの配列アラインメントを実施する段階；
    前記配列アラインメントに基づいて前記第一の領域を同定する段階；
    増幅の間に前記第一の領域を増幅できる第一のプライマーおよび第二のプライマーを設計する段階；および
    前記領域の増幅の間に前記第一の領域にハイブリダイズできるプローブを設計する段階
    を含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記プローブが、前記第一のプライマーの融解温度および前記第二のプライマーの融解温度よりも少なくとも６℃高い融解温度を有するように設計される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記複数の標的核酸分子のそれぞれの前記第二の領域を同定する段階が：
    前記複数の標的核酸分子のそれぞれの核酸配列の少なくとも一つのセグメントの配列アラインメントを実施する段階；
    前記配列アラインメントに基づいて前記第二の領域を同定する段階；および
    増幅の間に前記第二の領域を増幅できる第一のプライマーおよび第二のプライマーを設計する段階
    を含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域にハイブリダイズできる相補的なプローブを設計する段階をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記第一の増幅産物と前記第二の増幅産物が同時に産生される、請求項１に記載の方法。
20. 前記第一の増幅産物と前記第二の増幅産物が順に産生される、請求項１に記載の方法。
21. 各増幅産物が、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）によって産生される、請求項１に記載の方法。
22. 複数の標的核酸分子の少なくとも一つを検出するためのシステムであって、
    前記複数の標的核酸分子の少なくとも一つを含むサンプル；
    第一のプライマーペア、前記第一のプライマーペアは第一の増幅産物を産生するために前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の領域を増幅することができ、ここに、該第一の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されるものである；
    リアルタイム核酸増幅装置、ここに、前記装置は前記第一のプライマーペアを用いて前記第一の増幅産物を産生することができ、かつさらにリアルタイムで前記第一の増幅産物を検出することができるものである；
    第二のプライマーペア、前記第二のプライマーペアは第二の増幅産物を産生するために前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域を増幅することができ、ここに、該第二の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されないものである；
    前記第二の増幅産物を検出するための検出デバイス：
    を含む、システム。
23. 前記第一の領域にハイブリダイズする第一の核酸プローブをさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
24. 前記第二の領域にハイブリダイズする第二の核酸プローブをさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
25. 前記第二の核酸プローブが基質に固定される、請求項２４に記載のシステム。
26. 前記基質がマイクロアレイである、請求項２５に記載のシステム。
27. 第三のプライマーペア、前記第三のプライマーペアは第三の増幅産物を産生するために第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の領域を増幅することができ、ここに、該第三の領域は前記第二の複数の標的核酸分子の間で保存されるものである
    をさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
28. 前記第二の増幅産物を検出することが、前記サンプル中の病原体の存在を示す、請求項２２に記載のシステム。
29. 該システムが前記サンプル中の少なくとも二つの病原体を検出することができる、請求項２２に記載のシステム。
30. 前記第二の増幅産物を検出することが前記サンプル中の特異的な核酸配列の存在を示す、請求項２２に記載のシステム。
31. 前記サンプルから核酸を精製するための手段をさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
32. 前記第一の核酸プローブが、前記第一のプライマーペアにおけるいずれのプライマーの融解温度よりも少なくとも６℃高い融解温度を有する、請求項２３に記載の方法。
33. 前記システムが複数の標的核酸分子の少なくとも一つを前記サンプル中に検出するためのキットである、請求項２２に記載のシステム。
34. 前記リアルタイム核酸増幅装置がポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）装置である、請求項２２に記載のシステム。
35. 複数の標的核酸分子の少なくとも一つをサンプル中に検出するためのキットであって、
    第一のプライマーペア、前記第一のプライマーペアは第一の増幅産物を産生するために前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第一の領域を増幅することができ、ここに、該第一の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されるものである；
    前記第一の領域にハイブリダイズする第一の核酸プローブ；
    第二のプライマーペア、前記第二のプライマーペアは第二の増幅産物を産生するために前記複数の標的核酸分子のそれぞれの第二の領域を増幅することができ、ここに、該第二の領域は前記複数の標的核酸分子の間で保存されないものである；および
    前記第二の領域にハイブリダイズする第二の核酸プローブ：
    を含む、キット。
36. マイクロアレイをさらに含む、請求項３５に記載のキット。
37. 第三のプライマーペア、前記第三のプライマーペアは第三の増幅産物を産生するために第二の複数の標的核酸分子のそれぞれの第三の領域を増幅することができ、ここに、該第三の領域は前記第二の複数の標的核酸分子の間で保存されるものである、をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
38. 前記サンプルから核酸を精製するための手段をさらに含む、請求項３５に記載のシステム。
39. 前記第一の核酸プローブが、前記第一のプライマーペアにおけるいずれのプライマーの融解温度よりも少なくとも６℃高い融解温度を有する、請求項３５に記載のシステム。

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