JP2023504258A - 臨床的状況及び非臨床的状況において微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を同定する方法 - Google Patents

臨床的状況及び非臨床的状況において微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を同定する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、生物学的サンプル中の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって種又は株レベルで検出及び同定する方法であって、ａ）微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を含む疑いがある生物学的サンプルを用意すること、及び任意的に、前記生物学的サンプル中に含まれる核酸配列を単離すること；ｂ）単離されていてもよい前記核酸配列内に含まれる少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域を、前記少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの１セットを使用してＰＣＲ増幅し、それによって、ＰＣＲアンプリコンを生成すること；ｃ）工程ｂ）において生成された前記ＰＣＲアンプリコンについての高分解能融解曲線を記録すること、及び工程ｂ）において生成された前記ＰＣＲアンプリコン長をキャピラリー電気泳動又はシーケンシングによって記録すること；ｄ）工程ｃ）において記録された前記高分解能融解曲線を、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株から、増幅プライマーの前記と同じセットを使用して生成された、参照アンプリコンの高分解能融解曲線を含むデータベースと比較し、それによって、前記生物学的サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の第１の分類学的同一性指標を得ること；ｅ）工程ｃ）において記録された別個の長さを有する、各ＰＣＲアンプリコン長を、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株から、増幅プライマーの前記と同じセットを使用して生成された、参照アンプリコンのＰＣＲアンプリコン長を含むデータベースと比較し、それによって、前記生物学的サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の第２の分類学的同一性指標を得ること；ｆ）該第１の分類学的同一性指標と該第２の分類学的同一性指標とが合致した場合、前記生物学的サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を、種又は株レベルに同定することの工程を含む、前記方法に関する。【選択図】図３

Description

本発明は、微生物診断（microbial diagnostics）の分野、特に、サンプル中の微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ（微生物））、特に臨床的サンプル中及び非臨床的サンプル中の細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、を種又は株レベルで迅速に同定する為の微生物診断の分野、である。本発明は、ＤＮＡ解析に基づいた迅速な微生物同定の方法及びそのような方法を実施する為のシステムに関する。
人口が増加し、都市化及びグローバル・コネクティビティが進むと、感染症の病原体の伝播の有効性が大きく増加する。これは、今や重要な公衆衛生上の脅威になっている多剤耐性細菌の高リスククローンの、ごく最近の非常に急速な世界的拡散によって明白に例証されている。それ故に、危険な細菌の早期検出プロトコールが、これまで以上に必要とされている。加えて、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の「ワンヘルス（Ｏｎｅ Ｈｅａｌｔｈ）」手法に沿って、家畜の感染の検査室診断、又は非臨床的状況での微生物汚染、例えば食品部門又は医薬産業における無菌製品の微生物学的検査、は、ターンアラウンドタイム及びコストを削減しながら病原性微生物又は汚染微生物を正確に検出及び同定する為の改善されたプロトコールを含むべきである。
古典的な培養技法は、感度が不十分であり時間がかかる（２４時間を超える）ので、近年は、そのような微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を検出し、特徴付け、疫学及び臨床的影響について試験する為の、ＤＮＡに基づく分子方法を含めた、培養に依存しない方法に焦点がシフトしている。多くのＤＮＡに基づく診断手法が、現在利用可能である。この進歩は有望なものであるが、いずれの単一の診断プラットフォームも、全ての状況における短いターンアラウンドタイムでの実用的なデータの必要性に、十分に対処することができない。
サンプル由来の微生物ＤＮＡを最小量であっても、高い特異性で増幅及び検出する為の、種特異的且つ株特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順の開発及び適用によって、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の検出に大改革がもたらされたが、そのような方法は、臨床的サンプル中に微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）が存在することが予測できる見通しを必要とする。陰性の試験結果は、１つ又は少数の特定の種が存在しないことのみを示すので、得られる情報が限られている。更に、原因となる感染病原体は、予測することが困難であるか、変異によって検出を逃れるか、又は実際に単一の種又は型の微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）ではない状況では、特定のＤＮＡに基づく診断手法は、適用可能性が限られている。ＰＣＲ増幅の高い特異性には、臨床診断及び非臨床診断に関して、良い点と悪い点があることが明らかである。
また、そのような方法において、増幅の特異性が高いにもかかわらず、非標的配列の増幅を除外する為に、依然としてアンプリコン同一性（amplicon identity）の検証が避けられない。アンプリコン検証は、ハイブリダイゼーションプローブの使用、該アンプリコン内の制限部位の検出、ヌクレオチドの数での該アンプリコンの予測される長さの確認、又は該アンプリコンのシーケンシングを包含しうる。
現在のところ、次世代ＤＮＡシーケンシングによる細菌同定方法は臨床適用には好適ではなく、その理由は、処置に関する判断は、最短の可能な時間枠内に行われる必要があるのに対して、これらのシーケンシング手法は、結果が入手可能になるまでに少なくとも約２４時間を必要とするからである。更に、一般的なシーケンシング手法は、比較的短いＤＮＡフラグメント（例えば、約３００ｂｐ）だけが解析されることが可能であり、これは、種又は株レベルでの十分な分解能を可能にするには短すぎ、他方で、より長いフラグメントのシーケンシングを可能にするシーケンシング技法は、費用がかかりすぎ、大きなサンプルバッチが手ごろな価格になることを必要とし、又は臨床で日常的に実行されるには不正確すぎる。
臨床診断における状況を要約する為に、任意のアッセイの適用可能性を規定する下記の重要な課題が５つある：（１）範囲、（２）スピード、（３）感度、（４）特異性、及び（５）スケーラビリティ。古典的な培養に基づく微生物診断（microbial diagnostics）は、上記の５項目のうち３項目において高得点を得る：範囲（多くの異なる微生物（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）が検出されることができる）、感度（単一の細菌細胞に至るまでが検出されることができる）及び特異性（細菌種／株の決定が正確である）。しかしながら、培養は、スピード及びスケーラビリティ（ハイスループット）において高得点を得られない。
現行のｑＰＣＲに基づく診断は、５項目のうち４項目において高得点を得る：スピード、感度、特異性、及びスケーラビリティ。しかしながら、これらのアッセイは範囲が極度に限られている：単一のｑＰＣＲは、単一又は少数の標的微生物（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）しか検出することができず、これは、培養の範囲に幾らか匹敵する範囲を実現する為には、ｑＰＣＲの無数のアレイ（endless array of qPCRs）が必要とされることを意味する。
その上、そのような状況においてさえも、陰性の結果（いかなる種の微生物（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）も存在しない）が得られない可能性がある。大多数の重要な臨床的判断のうちの幾つかは陰性の結果に基づいてなされるので、陰性の結果は臨床微生物学において、非常に重要である。該臨床的判断の例は、感染に代わる疾患の原因を見出すこと、抗生物質を停止すること、患者を退院させること、留置器具（術後ドレーン、及びｉｖカテーテル）を取り外すこと、並びに患者内の非常に重要な異物（人工関節、骨接合プレート及びその他のもの）の維持に関する判断を含む。陰性の結果が重要であること、及びｑＰＣＲは陰性の結果を正確にもたらすことができないことに起因して、培養が、明らかな制限があるにもかかわらず、依然として微生物学的診断の大黒柱として維持されている。
従って、上記の５つの重要な課題の全てにおいて、特に臨床的な適用可能性の為に、高得点を得る、対費用効果が高く且つ効率的な、ＰＣＲに基づく微生物の検出システムを提供することが強く望まれることは明らかである。
本発明者は今、臨床においても適用されることができる、広範な微生物同定（broad microbial identification）の為の方法を、予想外に発見した。本発明者は、特定の病原菌についての、利用可能な診断検査の既存のアレイ（existing array of available diagnostic tests）に追加する為の、更により種特異的且つ株特異的なＰＣＲ増幅検査の開発では、問題の解決までいかないことに気が付いた。本発明者は、第１の部分として特異性の低い増幅プロトコールと、第２の部分として非常に特異的な検出／検証手順と、を組み合わせる手法を採用し、ここで、両方の部分がハイスループットで実行されることができる。
本発明の方法は、種特異的又は株特異的配列を増幅する代わりに、ゲノムＤＮＡ由来の微生物ｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ：internal transcribed spacer）領域の、より「ユニバーサルな」増幅を使用する。次に、このＩＴＳ領域が増幅される該微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）の同一性は、アンプリコン長に関する情報と、該アンプリコンのＤＮＡ融解曲線と、を組み合わせることによって決定される。驚くべきことに、この方法は、種及び株のレベルで非常に高レベルの分解能をもたらし、多数の微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）にユニバーサルに適用されることができ、また、後のサンプル中の微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の同定の正確さを改善する、種及び株にアノテートされたアンプリコン長及び融解曲線に関するデータを有するデータベースの構築をもたらすことが見出された。最も驚くべきことに、この比較的単純な方法は、極めて重要な陰性サンプル（微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）が検出されなかった）においてさえ、臨床医がそれに基づいて処置に関する判断を行うことができる、臨床的に意義のある情報をもたらすことができた。
本発明の方法において、微生物ゲノムＤＮＡのｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域の増幅は、実質的には種特異的でも株特異的でもない。種特異的増幅プロトコールの使用によって株レベルでの最高の分解能が成し遂げられることができるが、本発明の方法において、該増幅手順は、多数の微生物種（広い領域（broader range）の分類学的な幾つかの属（genera）、科（families）、目（orders）、鋼（classes）、門（phyla）、又は更には界（kingdoms）を包含する）の、ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を標的とすることが意図されており、従って、アンプリコンは、潜在的に大きな微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の群に由来する。それ故に、「ユニバーサルな」ＤＮＡ増幅は好ましくは、サンプル中に存在する疑いがある微生物ゲノムＤＮＡの、ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の、より高いタクソンレベル（taxon level）又は群特異的なプライマー（group-specific primers）、例えば、属特異的、科特異的、目特異的、鋼特異的、門特異的、界特異的及び／又はドメイン特異的な増幅プライマー、を使用して実施される。ユニバーサル増幅手法を選択することにより、広範囲（broad scope）を達成する為に多くの別々のｑＰＣＲの必要性をなくし、全ての細菌種が検出されることができる。その上、全ての細菌種が増幅されるはずであるので、陰性の結果は、サンプル中に細菌が存在しないことを意味し、臨床的判断の為の確実な根拠のある基礎として使用されることができる。今までに、そのようなユニバーサルＰＣＲ手法は、臨床における微生物同定の為には適用されていなかった。その理由は、そのような広範なＰＣＲ増幅は、それぞれが異なる長さ及び異なるヌクレオチド配列を有する、多数の種に由来する多数のＰＣＲアンプリコンの増幅をもたらすことができ、これは、臨床的目的の為には感度レベルが低すぎるとみなされるので、全ての状況における実際の同定をもたらさないからである。更に、臨床検体の性質は、多くの場合、ヒトＤＮＡが細菌ＤＮＡよりもはるかに多い存在量で存在するというものである。これらの濃度の差異は極度に大きい可能性があるので（ヒトＤＮＡの数が潜在的な細菌ＤＮＡの数の１０１０倍であることは珍しくない）、極めて特異的な細菌増幅プライマーを用いてさえ、交差反応性がよく生じ、非特異的増幅及び偽陽性結果を導く。
予想外に、本発明者は、上記ユニバーサルＰＣＲ手法において、一緒になって臨床的に十分な感度及び特異性（specificity）をもたらす２つの技法、すなわち、（ｉ）増幅されたＰＣＲ産物の高分解能融解曲線解析（ｈｒＭＣＡ：high resolution melting curve analysis）と、（ｉｉ）増幅されたＰＣＲ産物（すなわち、アンプリコン）の、例えばキャピラリー電気泳動、による分離及びその後のフラグメントの長さの解析を実施することによる、ＰＣＲアンプリコン長の解析、の技法とを組み合わせることによって、上に言及された問題にもかかわらず臨床的使用の為に利用可能なユニバーサルＰＣＲ手法を作出する方法を見出した。
本発明は、生物学的サンプル中の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）によって種又は株レベルで検出及び同定する方法であって、
ａ）微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を含む疑いがある生物学的サンプルを用意すること、及び上記生物学的サンプルから核酸配列を単離すること；
ｂ）上記単離された核酸配列内に含まれる少なくとも１つのｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ：internal transcribed spacer）領域を、広範囲な分類学的領域の増幅プライマー（broad-taxonomic range amplification primers）のセットを使用してＰＣＲ増幅し、それによって、ＰＣＲアンプリコンを生成すること；
ｃ）工程ｂ）において生成された該ＰＣＲアンプリコンについての高分解能融解曲線を記録すること、及び工程ｂ）において生成された該ＰＣＲアンプリコン長をキャピラリー電気泳動又はシーケンシング（sequencing）によって記録すること；
ｄ）工程ｃ）において記録された該高分解能融解曲線を、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株から、同じプライマーセットを使用して生成された、参照アンプリコンの高分解能融解曲線を含むデータベースと比較し、それによって、上記サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の第１の分類学的同一性指標を得ること；
ｅ）工程ｃ）において記録された別個の長さを有する、各ＰＣＲアンプリコン長を、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株から、同じプライマーセットを使用して生成された、参照アンプリコンのＰＣＲアンプリコン長を含むデータベースと比較し、それによって、上記サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の第２の同一性指標を得ること；
ｆ）該第１の分類学的同一性指標と該第２の同一性指標とが合致した場合、上記サンプル中に存在する該微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を、種又は株レベルに同定すること
の工程を含む、上記方法を今提供する。
本発明の方法は、サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を、種又は株レベルで同定する為に使用されることができ、ここで、該微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、例えば、疾患を引き起こすことができる微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、又は無菌であるべき製品を汚染する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、例えば、細菌、ウイルス、原生動物、又は真菌、でありうる。
本発明の方法の工程のいずれにおいてもシグナルが検出されない場合、該生物学的サンプルが微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の存在に関して陰性であると結論付けられる。
本特許請求される方法は、ＤＮＡ配列に基づいて識別を行う高分解能融解曲線（ｈｒＭＣ）解析と、アンプリコン長に基づいて識別を行うＰＣＲアンプリコン長の解析とが組み合わせて使用され、それぞれの各アウトカム（ｈｒＭＣ特徴対アンプリコン長）の正確さに対する信頼度が他のアウトカムに基づいて解釈されるので、広範囲を有し（すなわち、多くの異なる微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）が検出されることができる；例えば、ユニバーサル細菌検出）、非常に高速で潜在的に実施されることができ、スケーラブルであり、且つ、臨床的に意義のある（すなわち、極めて高い）感度及び特異性を有するアッセイを提供する。別個の各アウトカムは、通常は明確な種の指定に達するには十分ではない可能性があるか、又は夾雑しているヒトＤＮＡを微生物ＤＮＡと間違えうるが、ｈｒＭＣアウトカムを一意的に見出してアンプリコン長の測定値と組み合わせるか又は対応させる為に、該アンプリコン、従って、該サンプル中に存在する微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）の微生物起源、の極度に正確な同定を提供する。各アウトカムは、微生物株又は種にアノテートされたｈｒＭＣデータ、並びに微生物株又は種にアノテートされたアンプリコン長のデータを含むデータベースと比較される。次に、微生物種又は株は、両方のアウトカムが該データベース内の同じ種又は株にアノテートされる場合にのみ陽性に同定される。高分解能融解曲線は、アンプリコン長及び配列に依存するが、異なる長さと異なる配列の組み合わせにもかかわらず同等の融解曲線を導きうるので、異なるアンプリコンの間の重複を示しうる。ｍｒＭＣとアンプリコン長の測定値とを組み合わせることが、この問題を解決する。アンプリコンが同じ融解曲線及び同じ長さを有する場合、同じ融解曲線を有する同じ長さのアンプリコンは、配列においてほぼ同一に違いなく、従って、同じ種に由来する（ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域の配列は、異なる種間で高度に変動し、従って、小さな変動は、同じ種内でしか見出されることができない）ので、該アンプリコンの起源は、同じ微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に違いない。それ故に、それでも同等の融解曲線を示す、同じ微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来しないアンプリコンは、異なる長さを有するに違いなく、逆に、それでも同等の長さを示す、同じ微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来しないアンプリコンは、異なる融解曲線を有するに違いない。融解曲線データ及びアンプリコン長に基づく、ｒＲＮＡ ＩＴＳアンプリコンの識別は、それによって、微生物同定の為の、高度に頑強な臨床的方法を提供する。
臨床的微生物同定における現在の問題の１つは、微生物増幅プライマーが使用される場合に、ヒトＤＮＡが共に増幅されることも多いことである。臨床的サンプル中のヒトＤＮＡの割合は、細菌ＤＮＡの割合を最大１０１０倍超えうることが周知である。微生物ＤＮＡを増幅する為のプライマーは、微生物ＤＮＡに特異的であるが、標的でないヒトＤＮＡが増幅される公算が常にあり、これは、細菌プライマーの一部に対して相同性を示す領域が存在するからである。そのような非特異的増幅の公算が非常に小さい場合であっても（例えば、１０９に１の公算）、真の標的が１０１０分の１である環境において、そのような事象の公算が極めて現実的になる。臨床的サンプル中のヒトＤＮＡの割合が高いことを考慮すると、これは、原理上、ヒトから得られたサンプルを使用した、ＰＣＲに基づく微生物の検出アッセイ毎に、偽陽性増幅産物が形成される確率が高いことを意味する。古典的なｑＰＣＲ手法を使用する場合、この課題は増幅プライマーに加えて、特異性の高いプローブを使用することによって緩和される。これらのプローブは、アンプリコン内の極めて特異的な標的領域のみに結合することができる。これらのプローブは、非特異的産物には結合せず、このように、ヒトＤＮＡの非特異的増幅という課題を緩和する。しかしながら、そのような手法は、広範囲を有するアッセイ（an assay with a broad scope）を開発することの可能性も妨げる。広範囲のアッセイ（a broad scope assay）を開発することを目的とする場合、そのような非特異的ＤＮＡは、代替的なやり方で扱われる必要がある。アンプリコン長の解析のみを使用する場合、非特異的（ヒト）アンプリコン長が微生物（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍ）のアンプリコン長と重複するか、それと同様であるか、又は更にはそれと同一でありうるので、そのような偽陽性は十分な臨床的確実性で適切に同定されることができない。ｈｒＭＣだけを用いた場合、同様にこの問題が残る：非特異的アンプリコンは、ある特定の微生物株又は種のｈｒＭＣ曲線と同様の、ｈｒＭＣ曲線を生じうる。重ねて、ｈｒＭＣと長さの解析とを組み合わせることにより、この問題が解決されることができる。ｈｒＭＣとアンプリコン長との組み合わせは、割り当て（例えば、特異的な微生物アンプリコンであるか又は非特異的アンプリコンである）が、確実性を伴って行われることができるように特異的である。長さ及びｈｒＭＣが、微生物シグネチャーと一致する場合、該アンプリコンは該微生物（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来するに違いない（長さ及びｈｒＭＣが同じなので、配列はほぼ同一に違いない）。該組み合わせが微生物シグネチャーと一致しない場合、該アンプリコンは微生物起源ではない。非特異的ヒトアンプリコンは、一般的に異なる患者間で同様であるので、ｈｒＭＣ及びヒトアンプリコン長のライブラリーが構築されることができ、それにより、非特異的ヒトアンプリコンは、非特異的であると簡単に陽性同定することを可能にする。広範囲の微生物の検出と偽陽性の正確な同定とを組み合わせることにより、臨床検体に関する陽性の結果並びに陰性の結果を、正確にもたらすことができるアッセイが行われることができ、該陽性の結果並びに陰性の結果はどちらも臨床的判断を行う為に使用されることができる。
本発明の観点において、データベースは、本明細書に記載されている既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株から生成された参照アンプリコンの高分解能融解曲線及びＰＣＲアンプリコン長を含み、該データベースは、上記広範囲な分類学的領域の増幅プライマーのセットを使用して、ヒト配列から非特異的アンプリコン生成の対照として生成された参照アンプリコンの高分解能融解曲線及びＰＣＲアンプリコン長をさらに含みうる。語「非特異的アンプリコン生成」は、本明細書において、非微生物を云うものと理解されなければならず、ここで、該プライマーの非標的ＤＮＡ鋳型への非特異的結合が起こる。
最後に、ｈｒＭＣとアンプリコン長の検出とを組み合わせることは、検出デバイスの小型化の可能性を広げ、それは、広範囲の微生物の検出アッセイのポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ：Ｐｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ）用途への道を開く。現在、ｈｒＭＣ又はアンプリコン長を測定する為に必要な機構は、典型的に大きく、且つ、費用がかかる。しかしながら、これらの測定は、非常に小さく、且つ、比較的安価なデバイス、例えばラブ・オン・チップ（ＬＯＣ：ｌａｂ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）デバイス、でも行われうることが想定される。これらのデバイスに伴う現在の問題は、より大型の対応物に対して正確さを欠くことである。アンプリコン長は、１ヌクレオチドの正確さで測定されない場合があり、例えば、５ヌクレオチドの正確さで測定されうる。ｈｒＭＣ又は長さの測定値だけを用いて細菌種を決定する為には、高分解能が必須である（その場合であっても特異性を欠く）。しかしながら、ｈｒＭＣ情報と長さの測定値とを組み合わせることにより、これらの測定値のそれぞれを別々に分解する要件は、より低いストリンジェント（less stringent）でありうる。例えば、３種の異なる細菌種が、たった２ヌクレオチド長のみで分別される１６Ｓ－２３Ｓ ＩＴＳアンプリコン長を有することであった場合、極めて正確な測定でしかそれらを区別することができない。しかしながら、これらのアンプリコンが異なる細菌種に由来するという事実が、１６Ｓ－２３Ｓ ＩＴＳ領域の配列が異なるに違いない（リボソームＤＮＡ及びそのスペーサーの配列は、細菌種ごとに一意的である）ことを暗示する。融解曲線は長さ及び配列だけに依存するので、長さが同様の場合、必然的に、該配列の差異が、大きく異なるｈｒＭＣプロファイルを導く。それ故に、３種の異なる細菌種が、アンプリコン長だけでは分別されることができないとしても、該細菌は常にｈｒＭＣによって分別される。前に例示されている通り、異なる細菌種は、異なる１６Ｓ－２３Ｓ ＩＴＳアンプリコンの配列を有するので、これは運任せではない。次に、長さが同様である場合には、必然的に、異なる配列が、異なるｈｒＭＣプロファイルを導く。
高分解能融解曲線解析とアンプリコン長の解析とを組み合わせることにより、臨床診断の為の広範囲の微生物の検出及び同定が実行可能になることが、ここで見出された。本明細書に記載されている手法は、最適な臨床診断の為の５つの必須要件全てを唯一満たすことができる：範囲が非常に広く、例えば、全ての細菌種を包含する；該手法は分子手法であり、従って、培養の必要がないので、スピードが保証される；該手法はＰＣＲに基づく手法であるので、感度が高い；ｈｒＭＣとアンプリコン長の解析とを組み合わせることにより、細菌同定の特異性が極度に良好である（一方で、臨床的見地からの特異性、すなわち、真の陰性サンプルを正しく同定することがまた、夾雑しているヒトＤＮＡを同定する能力により、非常に良好である）；最後に、スケーラビリティは、現行の機構ですでに良好であり、将来、小型化によって、更に増強されるであろう。
本発明の観点の好ましい実施態様において、生物学的サンプルは、ヒトの体（human body）、動物の体（animal body）、植物、食料品、医薬製品若しくは化学製品、実験室培養物由来のサンプル、又は環境サンプル、例えば、土壌又は水域由来のサンプル、である。他の好ましい実施態様において、該生物学的サンプルは、子宮液、全血、血清、血漿、リンパ液、粘液、唾液、痰、便／糞便（stool／feces）、汗、創傷液、膿／化膿汁（pus／purulence）、胃内容物、腹水蓄積物／腹水（ascites／ascitic fluid）、胆汁、尿、精液、脳脊髄流体物／液体（cerebrospinal fluid/liquor）、及び母乳を包含するが、これらに限定されないところの体液（bodily fluid）又は滲出液（exudate）から選択される、患者の体のサンプル（bodily sample）；又は、これだけに限定されないが、皮膚、器官、組織、口腔、泌尿生殖器、膣管、消化管、気道又は肺系、及び心血管系由来のサンプルを包含するがこれらに限定されないところの、綿棒（swab）、生検材料（biopsy）、洗浄液（lavage）、又はペーパーポイントサンプル（paper point sample）の形態での体サンプル（body sample）から選択される、患者の体のサンプル（bodily sample）である。
本発明の観点の好ましい実施態様において、該微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、古細菌、細菌、ウイルス、原生動物、及び真菌から選択され、好ましくは、上記微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、疾患を引き起こすことができる病原性微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、好ましくは、病原性細菌、ウイルス、原生動物、又は真菌、最も好ましくは、細菌、から選択される病原性微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、である。
本発明の観点における該微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）又は微生物核酸配列は、原核生物又は真核生物でありうることが理解されるであろう。これらの微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）のゲノム内の内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）は、染色体又はポリシストロニックｒＲＮＡ前駆体転写物内の対応する転写された領域内の、小サブユニットリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子と大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子との間に位置されるスペーサーＤＮＡであるという事実は、当業者に知られている。細菌及び古細菌は２つのＩＴＳ領域を有する。第１のＩＴＳは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との間に位置され、本明細書においては１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域と云われ、第２のＩＴＳは２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との間に位置され、本明細書においては２３Ｓ－５Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域と云われる。真核生物にも、２つのＩＴＳが存在する；ＩＴＳ１は、１８ＳｒＲＮＡ遺伝子と５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との間に位置され、本明細書においては１８Ｓ－５．８Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域と云われ、一方、ＩＴＳ２は、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２６Ｓ（植物）又は（他の２８Ｓ真核生物）ｒＲＮＡ遺伝子との間に位置され、本明細書においては５．８Ｓ－２６Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域と云われる。
それ故に、本発明の観点の好ましい実施態様において、少なくとも１つのｒＲＮＡ ＩＴＳ領域は、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域、２３Ｓ－５Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域、１８Ｓ－５．８Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域及び５．８Ｓ－２６Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域から選択されうる。本発明の観点の最も好ましい実施態様において、少なくとも１つのｒＲＮＡ ＩＴＳ領域は、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域である。
本発明の観点の別の好ましい実施態様において、該データベース内の該参照アンプリコンは、対応する、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株の対応するｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域を増幅する為のイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）及び／又はイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ＰＣＲ増幅反応によって生成されたアンプリコンを含む。好ましくは、参照微生物種又は株は、同じ微生物門のもの、より好ましくは、同じ微生物界のもの、最も好ましくは、細菌界由来のもの、である。
本発明の観点の別の好ましい実施態様において、工程ｄ）及び工程ｅ）におけるデータベースは、単一のデータベースに統合され、ここで、上記データベースは、細菌に関するデータを含む。
本発明の観点の更に別の好ましい実施態様において、該広範囲な分類学的領域の増幅プライマーは、ある１つの微生物属、科、目、鋼、門、界及び／又はドメイン由来の複数の、好ましくは実質的に全ての株又は種、好ましくは、ある１つの微生物の門由来の実質的に全ての株又は種、より好ましくは、ある１つの微生物の界、最も好ましくは細菌、由来の実質的に全ての株又は種、の微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為のものである。
本明細書において使用される場合、語「実質的に全ての株又は種」は、好ましくは、上記の属、科、目、鋼、門、界及び／又はドメイン（domain）に含まれる微生物株又は種の５０％超、好ましくは、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超が、上記広範囲な分類学的領域の増幅プライマーによって増幅される状況を云う。
本発明の観点のなお別の好ましい実施態様において、少なくとも１つのｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域を増幅する為の該広範囲な分類学的領域の増幅プライマーは、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域、２３Ｓ－５Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域、１８Ｓ－５．８Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域又は５．８Ｓ－２６Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の、フォワード及びリバースプライマーを含む。本発明の観点の最も好ましい実施態様において、該少なくとも１つのｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域を増幅する為の該広範囲な分類学的領域の増幅プライマーは、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為のフォワード及びリバースプライマーを含む。
本明細書において使用される場合、語「少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域」は、微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域が、その全長にわたって増幅される実施態様を云う。微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域の、分類学的に広範囲の増幅は、プライマーアニーリング部位として機能するように、多数の分類学的に関連する株又は種のゲノムＤＮＡ内に、同一の配列（又は該配列の全長にわたって高レベルの配列類似性、例えば、９０％超、好ましくは、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超、の配列類似性を有する配列）を必要とすることが当業者には容易に理解されるであろう。そのような同一の配列又は高レベルの、配列類似性を有する配列は、通常、コードするｒＲＮＡ配列の保存された領域内に見出され、ＩＴＳ領域内には見出されない。それ故に、少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域の分類学的に広範囲の増幅によって増幅することは、通常、目的のｒＲＮＡ ＩＴＳの逆のコードｒＲＮＡ領域内の、保存された領域の同定を必要とする。結果として、該ＩＴＳ領域は、通常、その全体において増幅される。その後の分類学的同一性のアノテーションは、該目的の微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳの一部又は本発明の方法において生成されたＰＣＲアンプリコンの一部のみを考慮してなされうるが、好ましくは、その全体が増幅された該微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳを考慮してなされることが予測されることが当業者には理解されるであろう。
本発明の観点の更に別の好ましい実施態様において、該広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの該セットが、配列ＩＤ ＮＯ：１及び３～５の増幅プライマーのそれぞれ、又は配列ＩＤ ＮＯ：２～５の増幅プライマーのそれぞれ、又は配列ＩＤ ＮＯ：１～５の増幅プライマーのそれぞれを含む。
本発明の観点の更に別の好ましい実施態様において、該広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの該セットが、配列ＩＤ ＮＯ：６及び７～１３の増幅プライマーのそれぞれを含む。
本発明の観点の更に別の好ましい実施態様において、該広範囲な分類学的領域の増幅プライマーのセットは、ユニバーサル細菌増幅プライマーのセットであり、上記セットは好ましくは、配列ＩＤ ＮＯ：１４～１５の増幅プライマーのそれぞれを含む。
本発明の観点の更に別の好ましい実施態様において、ＰＣＲを増幅する前記工程は、ｑＰＣＲを含む。
本発明の観点の更に別の好ましい実施態様において、該ＰＣＲアンプリコン長は、キャピラリー電気泳動によって記録される。
本発明の観点の更に別の好ましい実施態様において、該ＰＣＲ増幅反応はＰＣＲキャリブレーター系を含み、該ＰＣＲキャリブレーター系は、複数のＰＣＲ増幅プライマーのセットと、ここで、該複数のＰＣＲ増幅プライマーのうちの少なくとも１つが標識を含む；少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターのセットとを含み、ここで、各ＰＣＲキャリブレーターは、上流のアダプターＤＮＡ配列と下流のアダプターＤＮＡ配列とによって挟まれた所与の長さのＤＮＡ配列を有するスペーサー領域を含むＤＮＡフラグメントからなり、該アダプターＤＮＡ配列は、該ＰＣＲ増幅プライマーの結合の為のプライマー結合性部位を含み、ここで、ＰＣＲ増幅プライマーの上記セットが、少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターの上記セット内の全てのＰＣＲキャリブレーターの該スペーサー領域ＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅する為のものであり、及び、少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターの上記セット内のそれぞれにおいて含まれるスペーサー領域ＤＮＡ配列が、異なる長さのものであり、且つ、ここで、少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターの上記セット内の各ＰＣＲキャリブレーターが、上記セット内の他のＰＣＲキャリブレーターと比較して等しい量で又は既知の量で存在する、ＰＣＲキャリブレーター系を更に含み、ここで、上記ＰＣＲ増幅する工程ｂ）は、該ＰＣＲキャリブレーター系の該ＰＣＲ増幅プライマーを使用して、該少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターをＰＣＲ増幅することを更に含む。
本発明の観点のなお別の好ましい実施態様において、該少なくとも１つのｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域を増幅する為の該広範囲な分類学的領域の増幅プライマーは、標識化されたフォワードプライマー及び／又は標識化されたリバースプライマー、好ましくは、標識化されたフォワードプライマー、より好ましくは、蛍光標識化されたフォワードプライマー、を含む。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０機で実施された融解曲線解析を含むサイクルスケジュール。７２℃でのプライマー伸長段階の最後（ドット）で及び１：４３：１７から開始される温度勾配によって示される融解全体の間に、蛍光取得が実施された。 融解曲線解析の例。上のパネル：二本鎖ＤＮＡが次第に一本鎖になり、ＥｖａＧｒｅｅｎが蛍光を失うので、温度が上昇すると蛍光が減少することが見出されることができる。下のパネル：上の融解曲線の一次導関数は、蛍光の急激な減少の領域：標的アンプリコンの融解温度、を明白に強調する。 ３種の異なる門からの８種の異なる細菌種の１６Ｓ－２３Ｓフラグメントの、融解曲線（左の欄）及びフラグメントの長さの解析。 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びコリネバクテリウム・ジェイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｉｕｍ）の１６Ｓ－２３Ｓフラグメントの長さ。どちらの種も同一の長さプロファイルを示す。しかしながら、各種の該融解曲線は一意的である。長さのデータと融解曲線データとを組み合わせることにより、両方の種が明確に同定されることができる。 クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びエンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）の１６Ｓ－２３Ｓ ＩＳプロファイルの、フラグメントの長さの解析と融解曲線解析との組み合わせ。融解曲線は識別することがほぼ不可能であるが、各種が、一意的なフラグメントの長さのシグネチャーによって同定されることができる。
定義
語「核酸配列」、又は「ヌクレオチド配列」は、本明細書において互換的に使用されることができ、一本鎖又は二本鎖形態の、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、特には、リボソームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ領域をコードするＤＮＡ配列の塩基配列を云う。
「単離された核酸配列」は、もはやそれが単離された天然の環境にない核酸配列を云う。該語は、とりわけ、天然において、例えば、微生物宿主において、核酸分子が天然において関連しているタンパク質、脂質、炭水化物、又は他の物質のうちの、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又はそれよりも多くから分離された核酸分子、を云う。
本明細書において使用される場合、語「微生物の（microbial）」は一般的に、ヒトの肉眼によって見られるには小さすぎることを意味する、顕微鏡的、である有機体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）を云う、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、すなわち微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）、を起源とする対象を云う。
本明細書において使用される場合、語「標的微生物核酸配列」は、複製（又は増幅）及びその後の検出に標的にされ、存在が決定されるべき特定の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に関して診断的なものである、核酸フラグメントを云う。
本明細書において使用される場合、語「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、鋳型ＤＮＡ－すなわち、コピーされるべき標的領域を含有する該ＤＮＡ、から標的ＤＮＡの特定のセグメントの多数のコピーを作製する為の、周知のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）技法を云う。反応の間、該標的ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する混合物が、該標的ＤＮＡの鎖を変性させる為に、９０～９５℃に加熱される。溶液は、該プライマー（約１８～３０ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡ分子）が該標的ＤＮＡ上のそれらの相補配列とアニーリングし、ＤＮＡ合成に必要な３’－ＯＨをもたらすことを可能にする温度に冷却される。その後、通常約７２℃の温度で、該ＤＮＡポリメラーゼは、該プライマーを伸長させることによって、該標的と相補的な新しいＤＮＡ鎖合成する。変性／プライマーアニーリング／プライマー伸長の熱サイクルスキームが多数回繰り返され、前のサイクルの間に合成された該ＤＮＡが、その後の各サイクルの鋳型として機能する。結果は、各サイクルで存在する該標的ＤＮＡの倍加、及び２０～４０サイクルの経過にわたる標的ＤＮＡ配列の指数関数的蓄積である。厳密な温度制御の為に、自動サーマルサイクラーを用いた加熱ブロックが使用される。本発明における使用の為の好ましい方法は、ｑＰＣＲ増幅（リアルタイムＰＣＲとしてまた知られている）であり、ここで、典型的に、標的にされたＤＮＡ分子の該増幅が、該ＰＣＲの間（すなわち、リアルタイムに）、ＰＣＲ産物をリアルタイムで検出する為の、蛍光レポーターで標識されている、オリゴヌクレオチドからなる、任意の二本鎖ＤＮＡ又は配列特異的ＤＮＡプローブにインターカレートするところの非特異的蛍光色素を使用して、モニタリングされる。
本明細書において使用される場合、語「鋳型」（template）は、核酸増幅反応において、標的配列がそれから増幅される核酸を云う。本明細書において使用される場合、語「増幅可能な鋳型」は、増幅されると、単一のアンプリコンをもたらす鋳型を云う。増幅可能な鋳型は、増幅プライマーのハイブリダイゼーションの為の、プライマー結合性部位を含む。
語「単離すること」は、生物学的サンプルから核酸配列を単離することに関連して本明細書において使用される場合、核酸、好ましくは、ゲノムＤＮＡ、が目的のサンプルから抽出される、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における方法を云う。該方法は、一般的に、これだけに限定されないが、（細胞）溶解物からのＤＮＡの、選択的な沈殿を可能にするグアニジン－界面活性剤溶解溶液（guanidine-detergent lysing solution）を使用した生物学的サンプル（該試料中の細胞）の溶解、及びエタノールを用いた溶解物からの該ゲノムＤＮＡの沈殿を含みうる。エタノールによる洗浄後、沈殿したＤＮＡが、水又は８ｍＭのＮａＯＨのいずれかに可溶化され、ＰＣＲ反応において鋳型として使用されうる。診断目的でのゲノムＤＮＡサンプルの分析は、ＤＮＡ単離の為の一般的に既知の技法を使用することによって得られうる。全ゲノムＤＮＡは、例えば、物理的方法と化学的方法との組み合わせを使用することによって精製されうる。極めて好適には、ＤＮＡ単離の為の市販のシステム、例えば、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）核酸抽出システム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）又はＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、が使用されうる。
本明細書において使用される場合、語「ＰＣＲ混合物」は、１以上の標的ＤＮＡ配列を含む（ゲノム）鋳型ＤＮＡ、該１以上の標的ＤＮＡ配列の逆の鎖とハイブリダイズし、増幅される領域を挟む、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーのセット、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＭｇ２＋イオンを含む、ＰＣＲ反応を実施する為の、水性液体中の少量の生化学反応物を云う。
本明細書において使用される場合、語「増幅プライマー」は、該１以上の標的ＤＮＡ配列の逆の鎖とハイブリダイズし、増幅されるべき領域を挟む、オリゴヌクレオチドプライマーを云う。
語「増幅産物」、及び「アンプリコン」は、本明細書において互換的に使用される場合、核酸増幅又は複製事象の産物である、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で形成される、核酸フラグメントを云う。本明細書において使用される場合、語「ＰＣＲアンプリコン」は、ＰＣＲ産物又は増幅された標的ＤＮＡを云う。
本明細書において使用される場合、語「高分解能融解曲線（ｈｒＭＣ）解析」は、核酸配列のバリエーションを同定する為に使用されるＰＣＲ後解析法を云う。該方法は、ＰＣＲ融解（解離）曲線における小さな差異を検出することに基づく。２本のＤＮＡ鎖間の温度依存性解離が、ＤＮＡにインターカレートするフルオロフォア、例えば、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、又はＬＣＧｒｅｅｎ（商標）Ｉ、ＬＣＧｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ若しくはＣｙｔｏ９のような「飽和色素」（saturation dye）（最大蛍光（飽和）をもたらす濃度で使用されたとしても、ＰＣＲを阻害しない色素）、を、厳密な温度傾斜制御及び高度な（蛍光）データ捕捉能を有する、リアルタイムＰＣＲ器具使用と併せて使用して、測定されることができる。データは、ｈｒＭＣ解析の為に特別に設計されたソフトウェアを使用して、解析及び操作される。高分解能融解曲線は、高レベルの正確さ（例えば、０．１℃以下）で温度勾配によってゆっくりと傾斜させ、各工程においてインターカレート色素の蛍光のレベルを測定することによって作成される。ＤＮＡ分子の融解温度は、核酸配列及び長さによって決定され、サンプル間でのこれらのヌクレオチド配列の差異が、アンプリコンがユニバーサルプライマーを使用して単離される場合であっても、特定の種に一意的である融解プロファイルをもたらす。ｈｒＭＣ解析手順の詳細は、当業者に周知であり、また、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Reed GH, Kent JO, Wittwer CT (2007) High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics．Pharmacogenomics,8, 597-608；米国特許第７，２９７，４８４号明細書；米国特許第７，３８７，８８７；米国特許第７，５２４，６３２号明細書；米国特許公開公報第２００９０１１７５５３号明細書及び米国特許公開公報第２０１０００４１０４４号明細書に記載されている。
本明細書において使用される場合、語「高分解能融解曲線（ｈｒＭＣ）」は、ＤＮＡにインターカレートするフルオロフォアを使用して測定される、２本のＤＮＡ鎖間の温度依存性解離を描いた解離曲線を云う。該高分解能融解曲線は、こうして形成されるピークに基づいて、解離の温度（５０％解離と定義される）を正確に示すことを容易にする、該融解曲線の負の一次導関数のグラフを云いうる。
本明細書において使用される場合、語「電気泳動的分離及びアンプリコン長の解析」は、ゲルマトリックスにローディングされた、荷電された分子、好ましくは、核酸、特に、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメント、の混合物が、負極（カソード）から正極（アノード）に向かって、サイズ、電荷、及び構造に基づいて、上記ゲルが電場に置かれている場合、該ゲルを通って移動し、それによって、より短い核酸フラグメントが、より長い核酸フラグメントよりも急速に移動し、その結果、サイズに基づいた分離をもたらす、技法を云う。電気泳動的分離及びアンプリコン長の解析は好ましくは、ＤＮＡがＵＶ吸収によって又は蛍光標識によってのいずれかで検出される、キャピラリー電気泳動によって実施される。適切な標準物質の存在下において、フラグメントは、相対的な電気泳動移動度に基づいて、例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）又は同様の分析機器を使用して、正確にサイズ分類されることができる。
「電気泳動的分離及びアンプリコン長の解析」は、本明細書において定義される場合、アンプリコンのＤＮＡシーケンシングによっても実施されうる。ＤＮＡシーケンシングは、該アンプリコン長に関する正確な情報をもたらしうる。
本明細書において使用される場合、語「陰性対照反応」は、ＰＣＲ前混合物中に標的核酸配列又は鋳型ＤＮＡを意図的に存在させない結果として、１以上のＰＣＲアンプリコンを含まないＰＣＲ後混合物を云う。
本明細書において使用される場合、語「プライマーダイマー（primer dimer）（ＰＤ）」は、プライマー内の一続きの相補的な塩基に起因して、互いにアニーリング（ハイブリダイズ）したプライマー分子からなる、ＰＣＲにおける潜在的な副産物を云う。結果として、ＤＮＡポリメラーゼはＰＤを増幅し、ＰＣＲ試薬の競合を導き、従って、ＰＣＲ増幅の標的とされたＤＮＡ配列の増幅を潜在的に阻害する。定量ＰＣＲにおいて、ＰＤは正確な定量に干渉しうる。
本明細書において使用される場合、語「非特異的ＰＣＲアンプリコン」は、標的ＤＮＡでない増幅されたＤＮＡからなる、ＰＣＲにおける潜在的な副産物を云い、これは、通常、プライマー分子と、鋳型ＤＮＡ、例えば、ヒトＤＮＡ、における他の核酸配列との非特異的アニーリング（ハイブリダイゼーション）に起因する。非特異的ＰＣＲアンプリコンは、標的微生物ＤＮＡ配列から生成されたＰＣＲアンプリコンと異なるｈｒＭＣを結果として生じる。
本明細書において使用される場合、語「ヒトＰＣＲアンプリコン」は、プライマー分子が、微生物ＤＮＡ配列の代わりに、鋳型ＤＮＡ内のヒト核酸配列とアニーリングした非特異的ＰＣＲアンプリコンを云う。ヒトＰＣＲアンプリコンは、（微生物）標的ＤＮＡから生成されたＰＣＲアンプリコンと異なるｈｒＭＣを結果として生じる。
本明細書において使用される場合、語「定量サイクル」（quantification cycle）すなわち「Ｃｑ」は、シグナル、例えば、蛍光シグナル、の蓄積によって、陽性反応が検出される、リアルタイムＰＣＲアッセイ又はｑＰＣＲアッセイ、において取得された測定値への言及を包含する。該Ｃｑ（定量サイクル）は、該シグナルが閾値を超える（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）為に必要なサイクルの数として定義されることができる。Ｃｑレベルは、サンプル中の標的核酸の量と反比例する（すなわち、該Ｃｑレベルが低いほど、サンプル中の標的核酸の量が多い）。
本明細書において使用される場合、語「サンプル」又は「生物学的サンプル」は、ヒトの体、動物の体、植物、実験室培養物、環境サンプル又は食料品、医薬製品又は化学製品に由来するサンプルへの言及を含み、好ましくは、上記食料品、医薬製品又は化学製品は、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）又は微生物ＤＮＡを含まないことが意図されている。
本明細書において使用される場合、語「対象」は、本明細書に記載されている方法が実施される任意の個体又は患者を云うことが意図されている。一般的に、該対象はヒトであるが、当業者には理解される通り、該対象は動物でありうる。従って、哺乳動物及び鳥類を含む他の動物がまた、対象の定義の範囲内に含まれる。
本発明の方法におけるＰＣＲの実施
本発明の方法において、ＤＮＡを増幅する工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。
好ましくは、本発明の方法において、ＰＣＲは、ｑＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲである。本発明は、サンプル中の微生物ゲノムＤＮＡの、少なくとも１つのｒＲＮＡ ＩＴＳ領域の分類学的に広範囲の増幅又はユニバーサル増幅、すなわち、微生物属、科、目、鋼、門又は界全体のゲノムＤＮＡのタクソン特異的増幅、に関する。
当業者は、そのようなＰＣＲ反応をセットアップする為の、方法及び手段を十分理解している。好ましくは、本発明の方法は、サンプル中の細菌又は細菌ＤＮＡを、検出又は同定する為のものである。細菌のファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）門又はプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門のうちの１以上のゲノムＤＮＡ由来の１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の、例示的なプライマーセットが、配列ＩＤ ＮＯ：１～１３として提供される。細菌のゲノムＤＮＡ由来の１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域をユニバーサル増幅する為の、例示的なプライマーセットが、配列ＩＤ ＮＯ：１４～１５として提供される。微生物、好ましくは、細菌ＤＮＡ、の分類学的に広範囲の増幅を可能にするプライマーセットを更に設計することは、当業者の日常的能力の範囲内である。
本発明の方法における高分解能融解曲線（ｈｒＭＣ）解析
高分解能融解曲線（ｈｒＭＣ）解析による核酸の特徴付けは、ＰＣＲの間又はＰＣＲ後サンプル中の、配列バリエーションを同定する為の有力な技法である。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントが加熱され、解離するにつれて、飽和型インターカレート色素の蛍光を測定することにより、配列に規定される融解曲線が、単一ヌクレオチドの分解能で作成されることができる。
本発明の観点の好ましい実施態様において、ｈｒＭＣ色素は、これだけに限定されないが、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ、Ｃｈｒｏｍｏｆｙ、ＢＥＢＯ、又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎからなる群から選択され、好ましくは、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎである。飽和型インターカレート色素（saturating intercalating dye）は好ましくは、ＰＣＲを阻害しないものであるべきである。
本発明の方法において、ＰＣＲアンプリコンのｈｒＭＣプロファイルが、ＰＣＲ増幅の工程の間、又はＰＣＲ増幅の工程の後に、ＰＣＲ後サンプル中に存在する、アンプリコンの飽和型インターカレート色素の蛍光を測定することによって生成されうる。本明細書において使用される場合、「融解プロファイル」は、ｈｒＭＣ解析によって生成されたプロファイルを云う。当業者は、ｈｒＭＣがどのように実施されるべきであるかを十分に理解している。十分なガイダンスが、例えば、Reed et al．2007 Pharmacogenomics 8 (6)：597-608及びWittwer et al．2003 Clin Chem．49：853-860において見出されることができる。
ｑＰＣＲ（すなわち、リアルタイムＰＣＲ）における高分解能融解曲線解析は、デジタルＰＣＲによって実施されるものと等価ではない。デジタルＰＣＲにおいて、各区画は、単一のサンプル鋳型のみを含有し、これは、各区画についての全てのアンプリコンが、単一の鋳型を起源とすることを意味する。この均一性は、ｈｒＭＣプロファイルのより容易な解釈を可能にし、また、他の区画との直接比較を可能にする。リアルタイムＰＣＲにおいて、複数の標的の不均一なサンプルは、増幅後も不均一なままであり、従って、該融解曲線はその不均一性を反映する。これは、複数のアンプリコンがサンプル中に存在する場合に、複数の標的をｈｒＭＣ解析によって識別することを難しくする。
本発明の方法において、ＰＣＲ後サンプルのｈｒＭＣプロファイルが生成される。好ましくは、該ＰＣＲは、ｑＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲである。該生成されたｈｒＭＣプロファイルは、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の既知の（すなわち、分類学的に同定された）株又は種の１以上の対応する１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳアンプリコンの（予め決定された）参照ｈｒＭＣプロファイルと比較される。好ましくは、既知の株又は種の１以上の対応する１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳアンプリコンの上記参照ｈｒＭＣプロファイルは、参照ｈｒＭＣプロファイルのライブラリー又はデータベースに含まれる。そのようなライブラリー又はデータベースは、（ｉ）微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の個々の株及び／又は種の１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ ＰＣＲアンプリコンをイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で生成すること、（ｉｉ）上記アンプリコンのｈｒＭＣ解析を実施すること、及び（ｉｉｉ）上記参照ｈｒＭＣプロファイルを参照ｈｒＭＣプロファイルのライブラリー又はデータベースに保存することによって確立されることができ、ここで、該種又は株の同一性が、該ｈｒＭＣプロファイルにアノテートされる。代替的には、参照ｈｒＭＣプロファイルのデータベース又はライブラリーは、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の個々の株及び／又は種の１以上の１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ ＰＣＲアンプリコンのｈｒＭＣプロファイルのイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）における予測によって生成されることができる。
臨床的観点から、ＰＣＲサンプル中の１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ ＰＣＲアンプリコンのｈｒＭＣプロファイルが、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）、例えば、細菌、が上記臨床的サンプル中に存在することを示す場合、臨床医はすでに重要な第１の処置に関する判断を行うことができる：治療量の抗微生物剤の投与を、上記抗微生物剤に感受性を持つ微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）が存在する場合に、開始する。例えば、ｈｒＭＣ解析に基づいて、細菌が存在することが決定される場合、該臨床医は、抗生物質の投与を開始するという該処置に関する判断を行うことができる。
しかしながら、多くの場合、ｑＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲは、存在する微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）の決定的な同定を導かない。ＰＣＲ産物のｈｒＭＣ解析は、サンプル中に単一の微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）が存在する場合にのみ、参照ｈｒＭＣプロファイルと合致する場合に、該微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）の同一性に関する決定的な答えをもたらすことができる。他の場合、例えば、上記サンプル中に１種よりも多くの微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）が存在する場合、において、ｈｒＭＣ解析は一般的に、該１以上の微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の同一性に関して、有効な情報（actionable information）を臨床医に提供しない。
本発明者は、ＰＣＲに基づく微生物同定アッセイの感度及び特異性を向上させる上で、１つの臨床的アッセイにおいて、配列を識別するｈｒＭＣ解析と、フラグメントの長さに基づいて識別を行うＰＣＲフラグメントの長さの解析とを組み合わせることが、非常に有益であることを発見した。この組み合わせ手法は、生成されたｈｒＭＣプロファイルを、ＰＣＲフラグメントの長さプロファイルに基づいて解釈すること、及びその逆に、ＰＣＲフラグメントの長さプロファイルをｈｒＭＣプロファイルに基づいて解釈することを可能にし、それは、特異性を大きく向上させる。これは、当技術分野において今まで知られていなかった。２つの技法を組み合わせることは、臨床医に微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）の同一性に関して有効な情報を提供する。好ましくは、本発明の方法によって提供される（微生物同定の）特異性は好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。
本発明の方法におけるＰＣＲフラグメントの長さの解析
本発明の方法は、ＰＣＲサンプル中のアンプリコンに対して、該ＰＣＲサンプル中に存在する該アンプリコンのフラグメントの長さプロファイルを生成する為に実施される、アンプリコンフラグメントの長さの解析の工程を含む。
（ＰＣＲ）フラグメントの長さプロファイルを決定する為の、方法及び手段は一般的に、当技術分野において知られている。ＰＣＲフラグメントの長さの解析の為の、１つの好例且つ高度に有益な方法は、キャピラリーゲル電気泳動である。好ましくは、該キャピラリーゲル電気泳動法は、Budding et al., FASEB J., 24, 4556-4564 (2010)、国際公開第２００８／１２５３６５号パンフレット及び国際公開第２０１５／１７０９７９号パンフレットに記載されている、ＩＳ－ｐｒｏ法と称されるキャピラリーゲル電気泳動法であり、好ましい実施態様において、ＰＣＲプライマーの門特異的蛍光標識による分類学的分類を用いた、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ ＩＴＳ領域の長さに基づく、細菌種の区別を含みうる。
前述の刊行物に記載されているＩＳ－ｐｒｏ法は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。例えば、国際公開第２００８／１２５３６５号パンフレットの例えば４頁１１行目以降に記載されている、微生物（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の集団を分析する為の方法は、そこに記載されているプライマーセットを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、例えば、国際公開第２０１５／１７０９７９号パンフレットに記載されている、ＰＣＲキャリブレーター系及びその使用（例えば、ｐ．４４以降を参照されたい）、国際公開第２０１５／１７０９７９号パンフレットに記載されているＩＳ－ｐｒｏ分析（例えば、ｐ．５３以降を参照されたい）、国際公開第２０１５／１７０９７９号パンフレットに記載されているプライマーセット及びプローブ（例えば、国際公開第２０１５／１７０９７９号パンフレットの６５及び６６を参照されたい）、並びに国際公開第２０１５／１７０９７９号パンフレットに記載されている患者サンプルの型（例えば、ｐ．１１、１８行目以降を参照されたい）は、参照により本明細書に組み込まれる。
手短に言えば、該ＩＳ－ｐｒｏ法に関して、該微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）のゲノムＤＮＡ内の遺伝子間領域を挟む、１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に含まれる、保存されたＤＮＡ領域の配列が、（多型）ＩＴＳ ＤＮＡ領域を増幅する為のプライマー結合性部位として使用される。
ＩＳ－ｐｒｏの分類学的多様性解析は、細菌及び古細菌を包含する原核微生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）が、ゲノム内に、５Ｓ、１６Ｓ及び２３ＳリボソームＲＮＡの遺伝子を含む、ｒｒｎオペロンの１以上のコピーを含むという事実に基づく。ほとんどの原核生物において、該オペロン内の該リボソーム遺伝子は、１６Ｓ－２３Ｓ－５Ｓの順序であり、単一のポリシストロニックＲＮＡに同時転写され、それがプロセシングされて成熟リボソーム内に存在するＲＮＡ種をもたらす。１６Ｓ遺伝子と２３Ｓ遺伝子との間のスペーサーは、二次構造を有する領域及び時にはｔＲＮＡ遺伝子を含有する。比較的近いタクソンの間で見出される該ｒＲＮＡオペロンの該スペーサーにおけるバリエーションは、極めて大きい。原核生物の異なる群の間での、該スペーサーのサイズ及び配列における極度な相違は、該スペーサーを分類学的マーカーとして理想的に適したものにする。
該ＩＳ－ｐｒｏ法において、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＴＳ）領域は、該リボソーム遺伝子配列内の保存された領域に向けられているプライマーを使用して、増幅される。より好ましくは、該保存されたＤＮＡ領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３’末端に最も近く且つ２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端に最も近くに位置する領域である。
調査されるミクロビオームに応じて、門特異的プライマーセットが使用されうる。ＩＳ－ｐｒｏにおける好適な門特異的プライマーセットは、マルチプレックスＰＣＲと称される方法において、単一の反応で複数の配列を同時に増幅することを可能にする、そのようなプライマーセットを含む。
ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔａ）門及びアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門からの、細菌ＤＮＡの遺伝子間スペーサー領域の増幅に関して、好適なプライマーセットは、下記を包含する：フォワードプライマーとしてＦｉｒＩＳｆ：５’－ＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＷＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：１）、並びに、リバースプライマーとしてＤＵＩＳｒＩ：５’－ＡＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＧＣＣＣＴ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：３）、ＤＵＩＳｒ２：５’－ＡＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣＲＴＧＣＧＣＣＣＴ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：４）及びＤＵＩＳｒ３：５’－ＡＧＧＣＡＴＣＣＲＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：５）のうちの１つ。好ましくは、本明細書において、該ＦｉｒＩＳｆプライマーは蛍光標識で標識化される。好ましくは、本明細書において、該リバースプライマーは標識化されない。
ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門内の属は、以下を包含する：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）綱、バチルス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）綱、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目（エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペクチナタス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）綱（アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ）属、ヘリオバクテリウム（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヘリオスピリルム（Ｈｅｌｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、スポロムサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）属）；モリクテス（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）綱（マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属）。
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門からの細菌の遺伝子間スペーサー領域の増幅に関して、好適なプライマーセットは、下記を包含する：フォワードプライマーとして、ＢａｃＩＳｆ：５’－ＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＧＡ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：２）、並びに、リバースプライマーとして、ＤＵＩＳｒＩ：５’－ＡＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＧＣＣＣＴ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：３）、ＤＵＩＳｒ２：５’－ＡＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣＲＴＧＣＧＣＣＣＴ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：４）及びＤＵＩＳｒ３：５’－ＡＧＧＣＡＴＣＣＲＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：５）のうちの１以上、好ましくは、全て。好ましくは、本明細書において、該ＢａｃＩＳｆプライマーは蛍光標識で標識化される。好ましくは、本明細書において、該リバースプライマーは標識化されない。
広範な群集分析において、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔａ）門及びアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門からの細菌の遺伝子間スペーサー領域は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）門からの細菌の該遺伝子間スペーサー領域を用いた、単一の多重反応で増幅されることができる。そのような多重反応において、フォワードプライマーＦｉｒＩＳｆ及びＢａｃＩＳｆ並びに３種全てのリバースプライマーの両方が、ＰＣＲ混合物に含まれる。好ましくは、本明細書において、該ＦｉｒＩＳｆプライマーは第１の蛍光標識、例えば、ＦＡＭ、で標識され、該ＢａｃＩＳｆプライマーは第２の蛍光標識、例えば、ＨＥＸ、で標識化される。好ましくは、本明細書において、該リバースプライマーは標識化されない。
更に広範な、又は代替的な群集分析の為に、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門からの細菌の該遺伝子間スペーサー領域が増幅されうる。その為に好適なプライマーセットは、下記を包含する：
フォワードプライマーとして、ＰｒｏｔＩＳｆ：５’－ＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：６）、並びに、リバースプライマーとして、ＤＰＩＳｒ１：５’－ＡＡＴＣＴＣＧＧＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：７）、ＤＰＩＳｒ２：５’－ＡＡＴＣＴＣＧＧＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：８）、ＤＰＩＳｒ３：５’－ＡＡＴＣＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：９）、ＤＰＩＳｒ４：５’－ＡＡＴＣＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：１０）、ＤＰＩＳｒ５：５’－ＡＡＴＣＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：１１）、ＤＰＩＳｒ６：５’－ＡＡＴＣＴＣＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：１２）、及びＤＰＩＳｒ７：５’－ＡＡＴＣＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：１３）のうちの１以上、好ましくは、全て。好ましくは、本明細書において、該ＰｒｏｔＩＳｆプライマーは蛍光標識で標識化される。好ましくは、本明細書において、該リバースプライマーは標識化されない。
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門内の属は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属（ヒトを含む温血動物の糞便において豊富な生物；例えば、Ｂ．アシジファシエンス（Ｂ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．ジスタソニス（Ｂ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、Ｂ．グラシリス（Ｂ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｂ．フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂ．オリス（Ｂ．ｏｒｉｓ）、Ｂ．オバタス（Ｂ．ｏｖａｔｕｓ）、Ｂ．プトレジニス（Ｂ．ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ）、Ｂ．ピオゲネス（Ｂ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｂ．ステルコリス（Ｂ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）、Ｂ．スイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、Ｂ．テクタス（Ｂ．ｔｅｃｔｕｓ）、Ｂ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、Ｂ．ブルガタス（Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ）を包含する）、及び、ヒト口腔に存在する生物の群であるポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属を包含する。
プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門の増幅は、ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門内での十分な分類学的分解能を提供する為に、マルチプレックスＰＣＲを行うことによって、非常に有益に実施される（国際公開第２０１５／１７０９７９号パンフレットを参照されたい）。
本発明の観点において好ましい微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）は、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）門、デフェリバクター（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）門、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）門、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、アシドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、ニトロスピナ（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｎａ）門、ニトロスピラ（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ）門、カルディトリクス（Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ）門、ハロアナエロビウム（Ｈａｌｏａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ）門、ベルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）門、プランクトミセス（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）門、ゲンミモナス（Ｇｅｍｍｉｍｏｎａｓ）門、フィブロバクテル（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ）門、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉ）門、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、テルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ）門、コプロテルモバクテル（Ｃｏｒｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）門、シネルジテス（Ｓｙｎｅｒｇｉｔｅｓ）門、サーモデスルフォバクテリア（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、デスルフロバクテリウム（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）門、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）門、デイノコッカス－サーマス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ）門、クロロフレクサス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）門、テネリクテス（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）門、及びアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門からなる群から選択される細菌門に属する。本発明の方法において標的とされる、より好ましい門は、クテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、及びベルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門を包含する。非常に好ましくは、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門及びプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門である。
これらの門は、当業者に知られており、とりわけ、Schloss 2004 (Microb．Mol．Biol．Rev．6 (4)： 686-691)、又はBergey manual of systematics of archaea and bacteria (2015)、に記載されている。
ゲノムＤＮＡの細菌１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域のユニバーサル増幅も、本発明の方法において使用されることができる。そのような細菌ＤＮＡのユニバーサル増幅の為に、配列５’－ＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＩＩＩＩＩＧＴＡＣＡＣ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：１４）を有するフォワードプライマーＩＴＳ１ＦＤと、配列５’－ＣＧＴＣＣＴＴＣＤＴＣＧＶＣＴＢＩＩＩＩＩＧＣＣＡＲＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：１５）を有するリバースプライマーＩＴＳ２ＲＤと、の組み合わせを含む、ユニバーサル細菌プライマーセットを使用することができる。
本発明の方法が実施されうるサンプルは、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を含む、任意の環境に由来するものでありうるが、好ましくは、哺乳動物、例えばヒト、由来のサンプルである。好適なサンプル材料は、例えば、ヒト、植物、動物、水、食品（乳製品のような）、酵母培養物（例えば、産業に使用される）又は土壌に由来するサンプルを包含する。
該ＩＳ－ｐｒｏ技法において、微生物ＤＮＡは、好適には、且つ一般的に、自動化された単離手順（例えば、ＥａｓｙＭａｇ，Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）により、製造者の指示に従って、単離される。本発明の方法において、微生物ＤＮＡは好ましくは、サンプルからゲノムＤＮＡの形態において単離される。当業者は、当技術分野において利用可能なゲノムＤＮＡ単離方法を十分理解している。
次に、単離された微生物ＤＮＡからの、門特異的蛍光標識化されたＰＣＲプライマーを用いた、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域の増幅が、ＩＳ－ｐｒｏアッセイ（ｉｎＢｉｏｍｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、製造者によって提供されるプロトコールに従って、又は、上記のプライマーセットのいずれかを使用することによって、実施される。ＩＳ－ｐｒｏは、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅し、そして、引き続き、アンプリコン長に基づいた、該アンプリコンが生成されるＤＮＡ鋳型の供給源としての微生物種を同定することを含む。手短に言えば、適切に希釈された単離されたＤＮＡは、標準化されたＰＣＲ増幅において増幅されることができる。標準化されたＰＣＲ増幅のうちの１つの例は、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、及びベルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門の組み合わせ（ＦＡＦＶ）の、該１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の、門特異的プライマーセットの使用を包含する。標準化されたＰＣＲ増幅の別の例は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門の該１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の、門特異的プライマーセットの使用を包含する。同様に、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門、及びバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門の、該１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域が、ＤＮＡサンプルから、これらの門からの任意の細菌種由来のアンプリコンをもたらす為に、単一の反応で増幅されうる（例えば、配列ＩＤ ＮＯ：１～５のプライマーを、単一の多重反応において使用する）。標準化されたＰＣＲ増幅の更に別の例は、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門の該１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の、門特異的プライマーセットの使用を包含する（例えば、配列ＩＤ ＮＯ：６及び７～１３の該プライマーを使用する）。標準化されたＰＣＲ増幅の更に別の例は、細菌界に属する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の該１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の、界特異的プライマーセットの使用を包含する（例えば、配列ＩＤ ＮＯ：１４及び１５の該プライマーを使用する）。
ＰＣＲ増幅、そして、アンプリコンの生成後、次に、例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）において、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳアンプリコン長を明らかにする為に、ＰＣＲ産物の小さな一定分量が、キャピラリー電気泳動によって分離及び分析されうる。
ＩＳ－ｐｒｏにおいて、別個の１６Ｓ－２３Ｓ ＩＴＳ ＤＮＡ配列を有する別個の細菌種は、分類学的に広範囲の又はユニバーサル増幅プライマーを使用して、サンプル中の微生物ゲノムＤＮＡ鋳型から１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する場合、長さが異なるアンプリコンを生成し、該アンプリコンは、キャピラリーゲル電気泳動によって容易に分離され、それによって、別個のＤＮＡフラグメントのプロファイルをもたらし、該ＤＮＡフラグメントのそれぞれが、特徴的な長さ（ヌクレオチド又は塩基対の数）を有する別々の１６Ｓ－２３Ｓ ＩＴＳ ＤＮＡ配列を表す。
一般的に、各フラグメントは、別個の細菌種又は操作的分類単位（ＯＴＵ：operational taxonomic unit）由来の、単一のＩＴＳ領域を表すと考えられる。しかしながら、異なる細菌種が、同一の長さの１６Ｓ－２３Ｓ ＩＴＳアンプリコンを生成することが可能である。更に、ゲノムは、異なるＩＴＳ領域配列を有する複数のｒｒｎオペロンを含みうるので、全てのフラグメントが、別個の微生物種を表すとは限らない。従って、異なるピーク（別個の長さのアンプリコン）は、単一の種又は別個の種を起源としうる。最後に、該ＩＴＳ配列における生物学的な長さのバリエーションが小さいことは、長さの測定値だけに基づく簡単な種の同定を複雑にしうる。
分解能及び種の同定を改善する為に、並びに、微生物ＤＮＡサンプル由来のアンプリコンの、特定の種又は株に、より良好に分類し、そして割り当てる為に、本発明者は、ｈｒＭＣ解析の工程を追加することが、同一の長さのアンプリコンを生成する（すなわち、単一の電気泳動ピークをもたらす）個々の種の別々の同定をもたらしうることを今見出した。該ｈｒＭＣ解析は、同一の長さのアンプリコン間の、配列の差異の同定を可能にし、従って、同じＣＥピークの根底にある該種の個々の同定を可能にする。更に、ｈｒＭＣ工程を追加することにより、単一の種を起源とする、複数の異なる長さのアンプリコンが、正しい種に明確に割り当てられうる。また、単一の種からの又は（複数の）別個の種からのいずれかを共に起源としうるフラグメントが、特定の種若しくは株を起源とするか、又は複数の種若しくは株を起源とするかのいずれかに分類され、そして、割り当てられうる。これは、複雑な微生物集団及び複雑でない微生物集団のいずれにおいても同様に行われることができる。
これらの改善は、臨床的実施において使用する為のアッセイの信頼度の為に、極度に重要である。
加えて、アンプリコン長プロファイルにおけるある特定のアンプリコンピークが、ここでヒトＤＮＡに起因する可能性があるが（偽陽性）、これは、アンプリコン長プロファイルに基づいて、「非微生物」として臨床医によって却下されることができない、該アンプリコン長プロファイルにおける曖昧な長さのピークが、ｈｒＭＣ解析により実際にヒトＤＮＡが存在することが確認されると（偽陽性の同定）、実際にそこで却下されることができるので、臨床におけるアッセイの特異性を大きく向上させることが、今見出された。
別個の微生物種のｈｒＭＣが、一般的に容易に識別可能であるので、そのような検査の特異性が改善され、ＰＣＲにおいて同一のアンプリコン長を生じる個々の種（例えば、Ｃ．ジェイケイウム（Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ）／Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））が、それらのアンプリコンの該ｈｒＭＣにおける差異に基づいて、明確に検出されることになる。
本発明の方法は、ＰＣＲ増幅の前、その間又はその後に、ｈｒＭＣ色素を添加すること、及びＰＣＲ後混合物、特に、１以上のＰＣＲアンプリコン、に対してｈｒＭＣ解析を実施することの工程を含む。
分類学的に広範囲のプライマーを用いた増幅反応及びその後の電気泳動的分離及びアンプリコン長の解析を含む診断方法におけるｈｒＭＣ解析の使用の別の利点は、該ｈｒＭＣ解析が、手順のスピードを上げることができることである。反応産物の該ｈｒＭＣが知られていると、当業者は、ｈｒＭＣデータに基づいて、予め決定された長さの範囲のフラグメントのみに対して、電気泳動的分離及びアンプリコン長の解析を実行しうる（例えば、３００～５００ｂｐの長さのフラグメントのみを分離及び解析する）。例えば、該ｈｒＭＣが、３つの可能性のある種のうちの１つの存在を示す場合、問題を解決する為に、これらの種について既知のアンプリコン長にすぐに「ズームイン」しうる。
本発明の方法は、腸又は消化管、皮膚、尿生殖路、口腔、及び肺系に関連付けられたサンプル等の多様な微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）を有するサンプルを、類型に分ける、診断する、調査する、解析する及びモニタリングする為に、並びに、疾患を診断する、モニタリングする又は予測する為に使用されうる。該方法は、診断目的、例えば、微生物感染の診断、モニタリング又は予測（早期検出を含む）、の為に使用されうるが、更には、環境診断の為、例えば、サンプル源の微生物の状態を決定する為にまた使用され得、ここで、上記サンプル源は、環境、植物、動物若しくは食品起源のもの、又は、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）若しくは微生物ＤＮＡが全くないことが意図される、医薬製品若しくは化学製品のサンプルであり、また、ここで、ＩＴＳ領域の特定のプロファイル（又はその非存在）が、上記サンプルの無菌性、該環境の質、食品、医薬製品の微生物安全性、化学製品の質、又は植物若しくは動物の健康を示している。
ＰＣＲアンプリコン長を決定する為の代替的な方法は、上記のＰＣＲ後サンプル中のアンプリコンに対して実施されるＤＮＡシーケンシングの工程による。好ましくは、上記ＤＮＡシーケンシングの工程は、１００～１２００ｂｐの塩基対の長さを有する、アンプリコンの配列長を決定することができる次世代シーケンシング法によって実施され、該範囲は、一般的に、異なる微生物種間の１６Ｓ－２３Ｓ ＩＴＳ ＤＮＡ配列の長さのバリエーション全体に似ている。アンプリコン長を決定する為の好適な次世代シーケンシング法は、ナノポアに基づく手法（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ又はＰａｃｉｆｉｃ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって製造されたデバイス）若しくは単一分子リアルタイムシーケンシング手法（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって製造されたデバイス）を包含する。
ＰＣＲアンプリコン長を決定する工程が、本発明の方法において実施される場合、アンプリコン長プロファイルは生成されることができる。そのような生成されたアンプリコン長プロファイルは、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）の既知の株又は種の、対応する１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域の、１以上の参照又は対照アンプリコン長プロファイルと比較されることができる。好ましくは、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）の既知の株又は種の、対応する１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域の、上記参照アンプリコン長プロファイルは、参照アンプリコン長プロファイルのライブラリー又はデータベースに含まれる。そのようなライブラリー又はデータベースは、（ｉ）微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の個々の既知の株及び／又は種のゲノムＤＮＡの、標的１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域のＰＣＲアンプリコンを、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において生成すること、（ｉｉ）上記アンプリコンのフラグメントの長さの解析を実施すること、並びに（ｉｉｉ）上記参照フラグメントの長さプロファイルを、参照フラグメントの長さプロファイルのライブラリー又はデータベースに保存すること、によって確立されることができる。代替的には、参照フラグメントの長さプロファイルのデータベース又はライブラリーは、微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の個々の株及び／又は種の、ゲノムＤＮＡの標的１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域の、ＰＣＲアンプリコンのフラグメントの長さプロファイルの、イン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）における予測によって生成されることができる。
検査サンプルの、生成されたアンプリコン長プロファイルとの比較の為に好適な、参照又は対照アンプリコン長プロファイルを確立する（予め決定する）ことは、当業者の常套的な実験法の境界及び範囲内にある。例えば、本発明の方法は、増幅産物又はアンプリコン（ＰＣＲ後）を、上記増幅産物における長さの差異に基づいて解析して、それによって、本明細書に開示されるミクロビオーム又はサンプル中の、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の集団の組成物のアンプリコン長プロファイルをもたらすこと；及び、上記フラグメントの長さプロファイルを、既知の微生物（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の少なくとも１つの参照フラグメントの長さプロファイルと比較することの工程を含みうる。
説明を明瞭且つ簡潔にする為に、本明細書において同じ又は別々の実施態様の一部として、特徴が記載されている。しかしながら、本開示は、記載されている特徴の全て又は幾つかの組み合わせを有する実施態様を包含することが理解されるであろう。
本明細書において言及される文書の内容は、参照により組み込まれる。
実施例
実施例１ 明確な種の同定の為の、融解曲線とフラグメントの長さのデータとの組み合わせ。
異なる微生物（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を検出及び同定する為に、分類学的群全体にわたって広範に保存されているＤＮＡ領域が、特定の特徴を有する場合、使用されうる。重要な特徴は、広範囲のプライマーを使用して、多くの異なる種のＤＮＡを増幅する為に使用されうるＤＮＡにおける、保存された領域の存在、及び、異なる種を識別する為に使用されうる、保存された領域に挟まれた可変領域の存在である。該可変領域を分析する為の異なる方法が存在し、該可変領域の特定の特徴に基づいて好適性が異なる。全ての生物形態に存在し、散在する保存された領域及び可変領域を有する、ＤＮＡ領域は、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。細菌リボソームＤＮＡ内で、１６Ｓ－２３Ｓインタースペース（interspace）（ＩＳ）領域は、実質的に全ての細菌に存在し、配列組成及び長さに大きな可変性を示し、且つ、広範囲のプライマーによる標的化に高度に好適である、高度に保存された領域に挟まれているので、特に興味深い。
ここで、該１６Ｓ－２３Ｓ ＩＳ領域の融解曲線とフラグメントの長さの解析との組み合わせに基づいて、細菌を検出及び同定する為の、非常に効率的且つ高度に正確な方法を実証する。
細菌における１６Ｓ－２３Ｓインタースペース（ＩＳ）フラグメントの融解曲線が、異なる細菌種を識別する為に使用されることができる。加えて、長さの測定値も、異なる細菌種を識別することができる。融解曲線解析又はフラグメント解析だけが細菌種の同定に適用されうるが、これが不可能である場合が多くある。これらの場合において、フラグメントプロファイルが種間で同一であるか、又は融解曲線が種間で十分な識別をもたらさない。フラグメントの長さの解析と融解曲線解析とを組み合わせ、結果をデータベースと比較する場合、明確な種の同定が行われることができる。ここで、フラグメントの長さの解析と融解曲線解析の組み合わせが、細菌を種レベルまで明確に識別することができ、そして、フラグメントの長さの解析だけ又は融解曲線解析だけのいずれかではそれができないことを実証する。
材料及び方法
株の選択及び培養
下記の１２種の異なる種の臨床的分離株が、この分析において使用された：バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エシェリキア・コリ（大腸菌）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（表皮ブドウ球菌）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿性連鎖球菌）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｉｕｍ）、シュードモナス・エルギノーサ（緑膿菌）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（肺炎桿菌）（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びエンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａａｃｅ）。好気性菌は、ヒツジ血液寒天培地（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）上、３７℃で培養され、好気的に２日間インキュベートされ、嫌気性細菌は、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ）で培養され、嫌気的に３日間インキュベートされた。細菌コロニーの同定は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ＶＩＴＥＫ ＭＳ ｓｙｓｔｅ，Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）によって行われた。
ＤＮＡ単離
ＤＮＡは、エッペンドフル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）容器中、懸濁された細菌（０，１ ＭｃＦａｒｌａｎｄ）２００μｌを、ＡＬ ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）４００μｌ及びプロテイナーゼＫ４０μｌに添加することによって単離された。この混合物が、９０００ｇで１０秒間遠心分離され、次に、ボルテックスされ、１４００ｒｐｍで振とうされながら５６℃で１時間インキュベートされた。ｅａｓｙＭＡＧ自動化ＤＮＡ単離機（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）は、更なるＤＮＡ抽出の為に使用された。
サンプル混合物（６４０μｌ）は、製造者によって提供される、８ウェルのｅａｓｙＭＡＧ容器に移され、ｎｕｃｌｉＳＥＮＳ溶解緩衝液２ｍｌ中に懸濁された。室温で１時間のインキュベーション後、ｅａｓｙＭＡＧ機と共に提供される磁気シリカビーズ７０μｌが添加された。次に、該混合物が該ｅａｓｙＭＡＧ機に挿入され、「ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａ」プロトコールが選択され、それにより、オフボードワークフローを選択し、製造者（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）によって提供されるＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ｅａｓｙＭＡＧ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ３ １１０μｌ中に、ＤＮＡを溶出する。全てのＤＮＡが４℃で保管された。
ＰＣＲ
種々の解析の為に、３つの異なるＰＣＲが使用された：１６Ｓ－２３Ｓ領域の門特異的増幅及びフラグメント解析の為に、２つの第１のＰＣＲが使用され、１６Ｓ－２３Ｓ領域のユニバーサル増幅、フラグメント解析及び融解曲線解析の為に、第３のＰＣＲが使用された。該第１のＰＣＲは、異なる細菌群を標的とする２種の異なる蛍光標識化されたフォワードプライマー（配列ＩＤ ＮＯ：１及び２）、並びにこれらの群に対するユニバーサルカバレッジを提供する、３種のリバースプライマー（配列ＩＤ ＮＯ：３～５）を含んでいた。該第１のフォワードプライマー（配列ＩＤ ＮＯ：１）は、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、及びベルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門（ＦＡＦＶ）に特異的であり、該第２の標識化されたフォワードプライマー（配列ＩＤ ＮＯ：２）は、バクテロイデス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ)門に特異的であった。標識化されたフォワードプライマー（配列ＩＤ ＮＯ：６）を、７種のリバースプライマー（配列ＩＤ ＮＯ：７～１３）と組み合わせて用いた、該第２のＰＣＲは、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門に特異的であった（表１を参照）。該第３のＰＣＲ反応混合物は、細菌の広範なコレクションを認識するプライマーのセットを含んでいた：ＦＯＲ：５’ＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＩＩＩＩＩＧＴＡＣＡＣ ３’（配列ＩＤ ＮＯ：１４）及びＲＥＶ ５’ＣＧＴＣＣＴＴＣＤＴＣＧＶＣＴＢＩＩＩＩＩＧＣＣＡＲＧ－３’（配列ＩＤ ＮＯ：１５）。イノシンは、４種全てのＤＮＡ塩基に結合し、広範な反応性を確実にする。該ＦＯＲプライマーは、ＡＴＴＯ５５０蛍光部分を含有する。該ＰＣＲ反応混合物は、二本鎖ＤＮＡに結合すると、蛍光を発するインターカレート色素であるＥｖａＧｒｅｅｎを含む。
該２つの第１のＰＣＲの増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で行われた。
融解曲線解析
該第３のＰＣＲは、融解曲線解析を含み、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ）において、図１に示されているサイクルスケジュールを使用して実施された（サイクルスケジュールは３つのＰＣＲ全てについて同一であり、ｌｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機に融解曲線解析が追加されただけであった）。
プログラムは、全てのＰＣＲアンプリコンがゆっくりと加熱される融解曲線で終了する。ＤＮＡ鎖が分離する温度は、配列及び長さに依存する。次に、蛍光の導関数が、ＰＣＲ産物の１以上の融解温度に変換される。例として、図２を参照されたい。
独自の融解曲線データベース（ｉｎＢｉｏｍｅ）と比較することによって、融解曲線解析による種の同定が行われることができる。
フラグメントの長さの解析
ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物５μｌは、ｅＭｉｘ（ｉｎＢｉｏｍｅ）２０μｌと混合された。ＤＮＡフラグメント解析は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施された。データは、ｉｎＢｉｏｍｅの独自のソフトウェアスイート（ｉｎＢｉｏｍｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて解析され、結果が微生物プロファイルとして示された。フラグメントの長さプロファイルの、種の自動呼び出しが、専用のソフトウェアスイート（ｉｎＢｉｏｍｅ）を用いて行われ、ここで、ピークは、５００種超の微生物種のＩＳプロファイル情報を含むデータベースとリンクされる。
１２８ＲＦＵ未満のピークは、バックグラウンドノイズとみなされ、更なる解析からは切り捨てられた。ＤＮＡ単離からデータ解析までの手順全体が、４時間以内に行われることができた。
結果
融解曲線とフラグメントの長さのデータとの組み合わせが示差的である潜在性を実証する為に、３種の異なる細菌門からの８種の異なる種の１６Ｓ－２３Ｓ ＩＳ領域の、融解曲線及びフラグメント解析が実施された。結果は、図３に示されている。ここで、融解曲線及びフラグメントの長さプロファイルが、種間で、さらには同じ属内の異なる種間であっても、高度に可変性であることを明白に認めることができる。これらの融解曲線とフラグメントの長さのデータとの組み合わせを、既知の種の参照プロファイルを含むデータベース（ｉｎＢｉｏｍｅ）と比較することにより、この解析において各種について、明確な同定が種レベルで行われることができた。
実施例２ フラグメントの長さが同一である場合の正確な同定。
ある１つの種の融解曲線又はフラグメントの長さプロファイルのいずれかが、別の種のものと同様であるという状況が起こりうる。融解曲線データとフラグメントの長さのデータとを組み合わせることにより、明確な同定がなお行われることができる。フラグメントの長さプロファイルが同様である、例示的な実際の状況が、本実施例において示される。
１６Ｓ－２３Ｓインタースペース領域由来のＤＮＡフラグメントの長さは、個々の種それぞれについて特異性が高いが、異なる種が同一のフラグメントの長さのシグネチャーを有する場合がある。これらの場合において、フラグメントの長さは同一でありうるが、これらのフラグメント内のヌクレオチド配列は必ず異なる：現代の分類学は、リボソームＤＮＡの配列に主に基づき、異なる種は、常に、この領域、特に、最も可変性の領域である、インタースペース（ＩＳ）領域、に異なるヌクレオチド配列を有する。
フラグメントの融解温度は２つの因子：フラグメントの長さ及び配列、によって決定される。それ故に、２種の異なる種のフラグメントの長さが同一である場合、該配列は常に異なり、それ故に、融解曲線シグネチャーは異なるに違いない。この状況は、患者に対する正しい処置の為に種レベルでの同定が重大である、臨床的に非常に意義のある２種の細菌種、すなわち、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びコリネバクテリウム・ジェイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｉｕｍ）に関して、図４に示されており、該細菌種について種レベルでの同定が、患者に対する正しい処置の為に重大である。
該２種が、本発明の方法を使用して、正確に弁別及び同定されることできることが示されている。
実施例３ 融解曲線が同一の場合の正確な同定。
融解曲線はフラグメントの長さ及び配列に依存するので、長さと配列が異なるが、それにもかかわらず長さと配列との間の相互関係が同様の融解曲線を生じうる可能性がある。
加えて、融解曲線における類似性は、個々の融解曲線がお互いに重ね合わせられる複数の（ＰＣＲ）フラグメントの存在によって引き起こされうる。これは、分解能の低下を示しうる、複雑な融解曲線を生じる。この現象は、特には、各種が複数のｒＲＮＡオペロン、従って１６Ｓ－２３Ｓ ＩＳ ＰＣＲフラグメントを有する、近縁の種において、特に問題となる可能性がある。これらの場合において、融解曲線データをフラグメントの長さの解析と組み合わせることは、それにもかかわらず各細菌種を一意的に同定することができる。この例示的な実際の状況が、多くのヒト病原菌を含む、臨床的微生物学において費用に異議のある細菌科である、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科における、近縁種の１６Ｓ－２３Ｓ ＩＳプロファイルの解析に関して例示されている。以下の図において、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（肺炎桿菌）（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の融解曲線及びフラグメントの長さの解析が示されている。これらの近縁種における多くの同様のＩＳ－フラグメントに起因して、融解曲線は識別することは難しいが、一意的な長さプロファイルは、なおこれらの種を識別することができる（図５を参照）。
Figure 2023504258000002

Claims (17)

  1. 生物学的サンプル中の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって種又は株レベルで検出及び同定する方法であって、
    ａ）微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を含む疑いがある生物学的サンプルを用意すること、及び任意的に、前記生物学的サンプル中に含まれる核酸配列を単離すること；
    ｂ）単離されていてもよい前記核酸配列内に含まれる少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）領域を、前記少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳを増幅する為の広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの１セットを使用してＰＣＲ増幅し、それによって、ＰＣＲアンプリコンを生成すること；
    ｃ）工程ｂ）において生成された前記ＰＣＲアンプリコンについての高分解能融解曲線を記録すること、及び工程ｂ）において生成された前記ＰＣＲアンプリコン長をキャピラリー電気泳動又はシーケンシングによって記録すること；
    ｄ）工程ｃ）において記録された前記高分解能融解曲線を、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株から、増幅プライマーの前記と同じセットを使用して生成された、参照アンプリコンの高分解能融解曲線を含むデータベースと比較し、それによって、前記生物学的サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の第１の分類学的同一性指標を得ること；
    ｅ）工程ｃ）において記録された別個の長さを有する、各ＰＣＲアンプリコン長を、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株から、増幅プライマーの前記と同じセットを使用して生成された、参照アンプリコンのＰＣＲアンプリコン長を含むデータベースと比較し、それによって、前記生物学的サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の第２の分類学的同一性指標を得ること；
    ｆ）該第１の分類学的同一性指標と該第２の分類学的同一性指標とが合致した場合、前記生物学的サンプル中に存在する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を、種又は株レベルに同定すること
    の工程を含む、前記方法。
  2. 微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を含む疑いがある前記生物学的サンプルが、古細菌、細菌、ウイルス、原生動物、若しくは真菌、又はそれらの組み合わせを含むと疑われる生物学的サンプルである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記データベースの参照アンプリコンが、前記少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの前記と同じセットを使用して、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株の対応するｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）及び／又はイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ＰＣＲ増幅反応によって生成されたアンプリコンを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 工程ｄ）及び工程ｅ）における前記データベースが、単一のデータベースに統合され、好ましくは、ここで、前記データベースが、ｒＲＮＡ ＩＴＳ配列と、細菌に関する対応する分類学的同一性データとを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記広範囲な分類学的領域の増幅プライマーが、微生物の属、科、目、鋼、門、界及び／又はドメイン由来の複数の、好ましくは実質的に全ての菌株又は種、好ましくは微生物の門由来の実質的に全ての菌株又は種、より好ましくは微生物の界、最も好ましくは細菌、由来の実質的に全ての菌株又は種、の微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為のものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の広範囲な分類学的領域の増幅プライマーが、１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域、２３Ｓ－５Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域、微生物の１８Ｓ－５．８Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域、又は微生物の５．８Ｓ－２６Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為のフォワード及びリバースプライマー、好ましくは１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為のフォワード及びリバースプライマー、を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記生物学的サンプルが、子宮液、全血、血清、血漿、リンパ液、粘液、唾液、唾液、便／糞便、汗、創傷液、膿／化膿汁、胃内容物、腹水蓄積物／腹水、胆汁、尿、精液、脳脊髄流体物／液体、及び母乳；又は、綿棒、生検材料、洗浄液の形態での対象の体のサンプルを包含するがこれらに限定されないところの体液又は滲出液から選択される、対象の体のサンプル；或いは、皮膚、臓器、組織、口腔、泌尿生殖器、膣管、消化管、気道又は肺系、及び心血管系由来のサンプルを包含するがこれらに限定されないところの、綿棒、生検材料、洗浄液、又はペーパーポイントサンプルの形態での対象の体のサンプルである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの前記セットが、細菌のバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）門及び／又はファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門のうちの少なくとも１つのｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の増幅プライマーのセットである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの前記セットが、配列ＩＤ ＮＯ：１及び３～５の増幅プライマーのそれぞれ、又は配列ＩＤ ＮＯ：２～５の増幅プライマーのそれぞれ、又は配列ＩＤ ＮＯ：１～５の増幅プライマーのそれぞれを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの前記セットが、配列ＩＤ ＮＯ：６及び７～１３の増幅プライマーのそれぞれを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの前記セットが、ユニバーサル細菌増幅プライマーのセットであり、ここで、該セットが好ましくは、配列ＩＤ ＮＯ：１４～１５の増幅プライマーのそれぞれを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ＰＣＲを増幅する前記工程は、ｑＰＣＲを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 工程ｃ）において、前記ＰＣＲアンプリコン長が、キャピラリー電気泳動又はシーケンシングによって記録される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 工程ｃ）及び任意的にまた工程ｂ）が、小型化されたデバイス、好ましくはラブ・オン・チップ（ＬＯＣ）デバイス、において実行される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記データベースが、既知の分類学的同一性の参照微生物種又は株から生成された参照アンプリコンの高分解能融解曲線及びＰＣＲアンプリコン長を含み、前記データベースが、前記広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの前記セットを使用してヒト配列から、非特異的アンプリコン生成の対照として生成された参照アンプリコンの高分解能融解曲線及びＰＣＲアンプリコン長をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ＰＣＲ増幅反応はＰＣＲキャリブレーター系を使用することをさらに含み、該ＰＣＲキャリブレーター系は、複数のＰＣＲ増幅プライマーのセットと、ここで、該複数のＰＣＲ増幅プライマーのうちの少なくとも１つが標識を含む；少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターのセットとを含み、ここで、各ＰＣＲキャリブレーターは、上流のアダプターＤＮＡ配列と下流のアダプターＤＮＡ配列とによって挟まれた所与の長さのＤＮＡフラグメントからなり、前記アダプターＤＮＡ配列は、前記ＰＣＲ増幅プライマーの結合の為のプライマー結合部位を含み、ここで、ＰＣＲ増幅プライマーの前記セットが、少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターの前記セット内の全てのＰＣＲキャリブレーターのＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅する為のものであり、ここで、少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターの前記セット中の前記ＰＣＲキャリブレーターのそれぞれにおいて含まれるスペーサー領域ＤＮＡ配列が、異なる長さのものであり、及び、少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターの前記セット内の各ＰＣＲキャリブレーターは、前記セット内の他のＰＣＲキャリブレーターと比較して等しい量で又は既知の量で存在し、及びここで、ＰＣＲ増幅の前記工程ｂ）は、ＰＣＲキャリブレーター系のＰＣＲ増幅プライマーを使用して、少なくとも２つのＰＣＲキャリブレーターをＰＣＲ増幅することをさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 少なくとも１つの微生物ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域を増幅する為の広範囲な分類学的領域の増幅プライマーの前記セットが、標識化されたフォワードプライマー及び／又は標識化されたリバースプライマー、好ましくは、標識化されたフォワードプライマー、より好ましくは、蛍光標識化されたフォワードプライマー、を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
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