KR101765677B1 - 결핵 및 비결핵 항산균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

결핵 및 비결핵 항산균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 결핵균(MTB, Mycobacterium Tuberculosis) 및 비결핵 항산균(Non-Tuberculosis Mycobacterium) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 결핵균 및 비결핵 항산균에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 다른 균주에 대한 교차 반응 없이 결핵 및 비결핵 항산균을 동시에 검출하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 결핵 및 비결핵 원인균 검출용 프라이머 세트 및 탐침은 민감도가 높고 종 특이성(species-specificity)이 뛰어나서, 결핵 및 비결핵 증상을 보이는 환자들로부터 결핵 및 비결핵 원인균의 존재 여부를 신속하고 간단하게 동시 검출할 수 있으며, 정량적 검출도 가능하다.
또한, 결핵 및 비결핵 원인균의 치료 전후 세균의 검출결과에 대한 비교분석을 통해 세균학적 예후 평가를 제공하는 방법으로 이용할 수 있다.

Description

결핵 및 비결핵 항산균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법{Primer set for detection of mycobacterium tuberculosis and non-Tuberculosis mycobacteria and use thereof}
본 발명은 결핵(MTB, Mycobacterium Tuberculosis) 및 비결핵 항산균(Non-Tuberculosis Mycobacterium) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 결핵균 및 비결핵 항산균에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 다른 균주에 대한 교차 반응 없이 결핵 및 비결핵 항산균을 동시에 검출하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
결핵(Tuberculosis,TB)은 국내에서 지난 50년간 지속적으로 유병률이 감소되어 왔지만, 2004년도 결핵환자 신고현황 연보에 따르면 10만명 당 65.4명으로 일본의 2.6배, 미국의 12.8배로 비교적 높은 경향을 보이고 있다. 더하여 현재 국가에서 3종 법정 전염병으로 관리하고 있는 감염성 질환으로서 그 위험성은 여전하다고 할 수 있다(비특허문헌 1).
한편, 비결핵 항산균은 자연환경에 흔히 존재하는 비 병원성 세균으로 알려져 왔다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3). 그러나, 후천성면역결핍증 환자에서 기회 감염균으로 확인되면서 그 중요성이 부각되기 시작하였고, 최근에는 면역기능이 정상인 환자에서도 감염을 일으킬 수 있음이 알려졌다. 전국적인 실태조사에 의하면 비결핵 항산균증은 1990년대 이후 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 결핵 및 비결핵은 공통적으로 피로감, 기침, 가래, 흉통 등의 증상을 보이는데, 이는 결핵 및 비결핵 환자에서만 볼 수 있는 특이한 증상이 아니다. 더욱이, 비결핵 항산균은 기존의 항 결핵제에 대하여 높은 내성을 보이기 때문에, 장기간 약제 병용요법으로 치료하여야 하므로, 결핵과 비결핵을 구분 검출할 수 있는 방법이 추가적으로 요구되고 있다(비특허문헌 4). 또한, 기존의 비결핵균 배양 및 동정 검사는 2-4주 정도의 장기간 시일을 필요로 하는 단점이 있다.
따라서, 최근에는 분자진단 검사법으로서 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 결핵균과 비결핵 항산균을 진단하는 방법에 대한 연구가 활발히 되고 있으나(특허문헌 1), 결핵균 및 비결핵 항산균을 동시에 교차 반응 없이 높은 정확성을 가지고 검출할 수 있는 진단 방법에 대해서는 아직 연구가 부족한 실정이다.
KR 등록특허문헌 10-692484호
World Health Organization (WHO). Diagnostics for tuberculosis: global demand and market potential. 2008. Wright PW et al., 1998, J Clin Microbiol, 36:1046. Marras TK and Daley CL., 2002, Clin Chest Med, 23:553. Wagner D and Young LS., 2004, Infection, 32:257.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 결핵균을 특이적으로 검출하기 위해 IS6110 유전자에 대하여 특이적인 결합을 갖는 프라이머 세트 및 다수의 비결핵 항산균을 특이적으로 검출하기 위한 16s rRNA에 대하여 특이적인 결합을 갖는 프라이머 세트를 사용하여 결핵균과 비결핵 항산균에 대한 신속하고 정확한 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법을 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 결핵을 특이적으로 검출할 수 있는 IS6110 유전자 및 비결핵 항산균 군을 특이적으로 검출할 수 있는 16s RNA 유전자에 대한 프라이머 세트를 제조하였고, 각 프라이머 세트의 대상 균주에 대한 결합 특이성을 PCR을 통해 확인하였으며, 본 발명에 따른 프라이머 세트가 목적 유전자에 대한 다른 서열의 프라이머 세트에 비해 높은 결합 특이성을 갖고 있음을 검증하였다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
출원서 내 특별한 정의가 없으면 본 출원서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 목적은 결핵균 및 비결핵-항산균 군을 교차 반응 없이 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 결핵균 및 비결핵-항산균 군을 교차 반응 없이 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 1 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 2 프라이머 세트, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 3 프라이머 세트를 포함하는 결핵균(MTB, mycobacterium tuberculosis) 및 비결핵(NTM, Non-tuberculosis mycobacteria) 항산균의 동시 검출용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 제 1 프라이머 세트는 결핵균 내 IS6110 유전자에 대하여 결합 특이성을 갖고, 상기 제 2 프라이머 세트는 비결핵 항산균 내 16s RNA 유전자에 대한 결합 특이성을 가지며, 상기 제 3 프라이머 세트는 내적 대조군으로서 GAPDH(GlycerAldehyde 3-Phosphate DeHydrogenase) 유전자에 대한 결합 특이성을 갖는, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium); 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae); 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare); 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii); 마이코박테리움 오슬로엔시스(Mycobacterium osloensis); 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei); 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis); 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae); 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus); 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae); 마이코박테리움 뮤코제니쿰(Mycobacterium mucogenicum); 마이코박테리움 페레그리눔 (Mycobacterium peregrinum); 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae); 마이코박테리움 울린스키이(Mycobacterium wolinskyi); 및 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 조성물을 제공하였다.
본 발명의 다른 일 구체예에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 2 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 3 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 키트를 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium); 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae); 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare); 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii); 마이코박테리움 오슬로엔시스( Mycobacterium osloensis); 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei); 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis); 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae); 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus); 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae); 마이코박테리움 뮤코제니쿰(Mycobacterium mucogenicum); 마이코박테리움 페레그리눔(Mycobacterium peregrinum); 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae); 마이코박테리움 울린스키이(Mycobacterium wolinskyi); 및 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 키트를 제공하였다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에서 (a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 DNA를 주형(template)으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 1 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 2 프라이머 세트, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 3 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 실시하는 단계; 및 (c) 상기 PCR에 의해 증폭된 DNA를 주형으로 표지물질로 표지된 서열번호 7의 제 1 탐침, 서열번호 8의 제 2 탐침 및 서열번호 9의 제 3 탐침을 이용하여 중합효소연쇄 반응을 실시하여 결핵균 및 비결핵 항산균을 탐지하는 단계를 포함하는 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 표지물질은 탐침 내 5' 말단에서 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이고, 탐침 내 3'-말단에서 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black holequencher-1,2,3(BHQ-1,2,3)인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 (c) 단계의 PCR은 다중 실시간 PCR(multiplex real-time PCR)인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출 방법을 제공하였다.
본 발명에서 결핵균(TB, tuberculosis mycobacteria, ATCC25177) 탐지의 목적 유전자인 IS6110은 이전 가능한 유전 요소(transposable genetic element)로서 결핵균 간에 그 카피수(copy number)가 일정하지 않고 일부 경우에는 유전자 내에 포함되지 않을 수도 있어서 결핵 진단시 효율이 낮은 것으로 평가되고 있었다. 하지만, IS6110이 없거나 부족한 경우는 인도 등의 몇몇 나라에 국한되어 있으며 1995년 계통수 분류를 통해 밝혀진 국내에서의 발병비율이 약 80%에 이르는 대다수의 결핵균은 Bajing family로서, IS6110의 카피 수가 15에서 26개로 비교적 많은 특징을 가지고 있어 결핵균의 진단 효율성에는 적합한 것으로 확인되었다.
본 발명에서 "비결핵 항산균(NTM, NonTuberculous Mycobacteria)"은 결핵균과 나병균을 제외한 항산균을 말한다. NTM은 현재까지 140여 종이 넘는 균종이 알려져 있으며 새로운 균종이 밝혀지고 있다. NTM 감염증은 1) 폐질환, 2) 림프절염, 3) 피부, 4) 파종성 질환(disseminated disease) 등 4가지 특징적인 임상 증후군으로 분류된다. 이 중 폐질환은 NTM 감염증의 90% 이상을 차지하는 가장 흔한 형태이며, 국내에서도 임상 검체에서 NTM이 분리되는 빈도와 NTM 폐질환으로 진단, 치료 받는 환자들이 최근에 크게 증가하고 있다. 국내에서 NTM 폐질환의 원인균으로 가장 흔한 균은 Mycobacterium avium complex(MAC)로서 50~60%를 차지한다. 외국에서 상대적으로 빈도가 적은 원인 균인 Mycobacterium abscessus가 국내에서는 두 번째로 흔한 원인균으로 20~30%를 차지하고 있다.
본 발명에서 16s rRNA 유전자를 목적 유전자로 하여 비결핵 항산균(NTM) 탐지용 프라이머 세트를 제작하였다. 대부분의 세균은 다수의 rRNA 오페론(operon)을 갖고 있으며, 게놈(genome) 안에 1 내지 15개의 16s rRNA를 갖고 있다. 16s RNA의 일부 영역은 계통학적으로 매우 잘 보존되어 있고, 일부 영역은 높은 다양성을 나타내기도 하여, 세균의 분자계통분석, 진화관계 규명, 생물다양성 분석, 병원균 검출 등의 다양한 목적에 응용되고 있다. 특히, 본 발명은 150여 종의 비결핵 원인 균 중에서 인체에 병원성을 보이는 40종의 비결핵 원인균 군의 동시 검출에 관한 것으로, 계통수에 따른 병원균 군의 검출이 가능한 목적 유전자로서 16s RNA를 선택하였고, 이에 대한 프라이머를 제작하여 비결핵 항산균의 검출 특이성을 확인하였다. 본 발명에서 검출된 비결핵 항산균은 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium); 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae); 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare); 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii); 마이코박테리움 오슬로엔시스(Mycobacterium osloensis); 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei); 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis); 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae); 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus); 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae); 마이코박테리움 뮤코제니쿰(Mycobacterium mucogenicum); 마이코박테리움 페레그리눔(Mycobacterium peregrinum); 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae); 마이코박테리움 울린스키이(Mycobacterium wolinskyi); 및 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi)이다.
본 발명에서 내적대조군(internal control)의 동정을 위해 GAPDH(GlycerAldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase) 유전자 영역을 사용하였다. GAPDH 유전자는 하우스 키핑(housekeeping) 유전자로서 세포의 생육에 필수 불가결한 유전자이다. GAPDH 유전자는 어떠한 상황에서도 발현되는 특징을 가지고 있어서 실험 설계에 따른 유전자 발현에서 실험군과 대조군으로 실험에 타당성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 "객담"은 기침을 통해 하기도(기관지 및 폐)로부터 나온 두꺼운 점액 또는 점액질로서 침이나 타액과는 다른 것으로, 폐의 병원균을 검사하기 위한 시료로 사용한다. 객담은 채취 전에 입안을 물이나 식염수로 헹궈야 하고, 뱉거나 유도되어 채취할 수 있으며, 채취 후 최대한 신속한 처리가 필요하다.
본 발명에서 "혼성화(hybridization)"는 이중가닥, 삼중가닥, 또는 기타 고차 구조의 형태를 초래하는, 핵산과 또 다른 핵산의 염기쌍 상호작용을 의미한다. 특정한 구체예에서, 일차적 상호작용은 왓슨/크릭(Watson/Crick) 및 후그스틴형 수소 결합(Hoogsteen-type hydrogen bonding)에 의한, 염기 특이적 상호작용, 예를 들면 A/T 및 G/C이다.
본 발명에서 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 갖는 핵산서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 "탐침(probe)"이란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산단편을 의미하며 라벨링(labelling)되어 있어 특정 핵산 존재 여부를 확인할 수 있다. 탐침은 올리고뉴클레오타이드 탐침, 단쇄 DNA 탐침, 이중쇄 DNA 탐침, RNA 탐침 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다. 본 발명의 탐침은 바람직하게는 5'-말단 및 3'-말단에 각각 형광물질이 표지될 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 5'-말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3'-말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black holequencher-1,2,3(BHQ-1,2,3)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 탐침의 5'-말단 및 3'-말단에 표지된 각각의 형광물질은 상호 간섭 현상을 나타내는 것일 수 있다. 이에 따라, 탐침이 시료에 존재하는 표적 염기서열에 결합된 상태에서는 3'-말단의 형광물질 에너지에 의해 5'-말단의 형광물질이 억제되어 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄 반응의 수행시 탐침이 분해되면서 5'-말단의 형광물질이 유리되면서 3'-말단의 형광물질에 의한 억제가 해제되어 형광물질이 발색 반응을 하게 된다.
본 발명에서 "중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)"은 아주 적은 양의 DNA 만으로도 특정 부위의 DNA 염기서열을 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 간단하고 편리한 방법으로, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하여 고온에서도 안정한 Taq DNA 중합효소를 사용하여 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 연장(extension)의 과정을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭시키게 된다. PCR을 이용한 목적 유전자의 검출은 유전자를 인식하는 프라이머를 이용하여 이를 증폭 및 확인하는 것이다.
본 발명에서 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로, 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission)정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 전통적인 PCR 기법에 비해, PCR 증폭 산물을 분석하기 위한 gel 전기영동, DNA-DNA 혼성화, 서열분석 같은 추가적인 실험을 필요로 하지 않는다는 장점이 있다.
본 발명에서 real-time PCR을 이용한 정량은 일반적으로 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한, PCR을 이용한 일련의 반응을 의미한다. 정량적 PCR에는 기준이 되는 표준시료를 사용하는 내부 표준법과 증폭반응에 있어서 경쟁하는 분자를 사용하는 경쟁법이 포함된다. 또한, 각 서열의 분자 수를 정확하고 간편하게 결정하기 위해서 표준시료라고 불리는 기준이 되는 주형 DNA 서열을 이용한 PCR 방법을 사용하고, 반응 중 임의의 시점에서 반응의 진행상황, 즉 증폭의 정도를 확인한다. 따라서, 본 발명에서 "정량"이란 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한 PCR로서, 반응 중 임의의 시점에서 증폭대상의 분자에 대해 증폭을 확인할 수 있는 PCR을 의미한다. 정량을 위해서는 일반적으로 그와 같은 PCR과 반응 개시 시의 주형 DNA 분자 수와 그 증폭의 지표가 되는 신호를 관련짓는 검량선이 조합된다. 이 검량선은 분자 수가 알려진 표준 시료를 이용하여 제작할 수 있다. 이러한 real-time PCR 분석은 시판되고 있는 real-time PCR 기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, real-time 기기는, SLAN real time PCR detectionsystem(LG 생명과학, 한국), LightCycler 96/480(Roche, Germany), ABI 7500 fast/7500/PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA), iCyclerTM/CFX96TM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "멀티플렉스 리얼타임(multiplex real-time) PCR"이란 한 번의 실시간 PCR 반응으로 여러 개의 원하는 유전자를 동시에 증폭시킬 수 있어서, 이를 이용하여 여러 미생물을 동시에 검출하고 확인하는 많은 연구에 활용되고 있다.
본 발명에서 "코헨 카파 계수(Cohen's kappa coefficient)"는 두 관찰자 간의 측정 범주 값에 대한 일치도(agreement)를 측정하는 방법에 관한 것으로 카파계수 값이 0에서 0.200 사이이면 약간의 일치도를 보이는 것으로 판단하고, 0.4에서 0.6 사이이면 적당한 일치도로 판단하며, 0.8 이상으로 나오면 완벽한 일치도로 판단한다.
본 발명에서 "p-value(유의확률)"는 관찰된 데이터의 검정 통계량이 귀무가설을 지지하는 정도를 확률로 표시한 것으로, p-value가 유의수준보다 작을수록 귀무가설을 지지하는 정도가 약하므로 귀무가설을 기각하게 되며, p-value가 클수록 귀무가설을 지지하는 정도가 커짐으로 귀무가설을 채택하게 된다.
본 발명에서 "R-value"는 2개의 변수 사이의 선형 관계(linear correlation)을 측정한 것으로, -1에서 +1 사이의 값이며, -1은 완전한 음의 상관관계이고, +1은 완전한 양의 상관관계이며, 0은 두 변수 간에 상관관계가 없음을 나타낸다.
본 발명에 따른 결핵 및 비결핵 원인균 검출용 프라이머 세트 및 탐침은 민감도가 높고 종 특이성(species-specificity)이 뛰어나서, 결핵 및 비결핵 증상을 보이는 환자들로부터 결핵 및 비결핵 원인균의 존재 여부를 신속하고 간단하게 동시 검출할 수 있을 뿐만 아니라 정량적 검출도 가능하다. 또한, 결핵 및 비결핵 원인균의 치료 전후 세균의 검출결과에 대한 비교분석을 통해 세균학적 예후 평가를 제공하는 방법으로도 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 결핵 균에 대한 PCR 검출 결과에 관한 것으로, 도 1a는 프라이머 세트 1을 이용한 결핵 균 탐지 결과에 관한 것이고, 도 1b는 프라이머 세트 1을 이용한 비결핵 균 탐지 결과에 관한 것이며, 도 1c는 프라이머 세트 4 내지 6을 이용한 결핵 균 및 비결핵 항산균 탐지 결과에 관한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 비결핵 항산균 검출 결과에 관한 것으로, 도 2a는 프라이머 세트 2를 이용한 비결핵 균주의 검출 결과에 관한 것이고, 도 2b 프라이머 세트 7을 이용한 비결핵 항산균의 검출 결과에 관한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 세트 3를 이용한 내적 대조군 검출 결과에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 탐침을 이용한 실시간 PCR 결과에 관한 것으로, 도 4a 내지 도 4c는 결핵, 비결핵 및 내부 대조군에 대한 단일 검출 결과이며, 도 4d는 결핵, 비결핵 및 내부 대조군에 대한 동시 검출 결과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 탐침을 사용하여 멀티플렉스 실시간 PCR을 실시한 결과에 관한 것으로, 도 5a는 결핵 균주에 대한 결과이고, 도 5b 및 도 5c는 비결핵 균주에 대한 결과이며, 도 5d 및 도 5e는 음성 균에 대한 결과에 관한 것이다.
도 6는 결핵, 비결핵 및 내적대조군의 표준 균주에 대하여 본 발명의 프라이머 세트 및 탐침의 민감도를 테스트한 결과에 관한 것으로, 도 6a 및 도 6b는 결핵 양성 표준 균주에 관한 결과이고, 도 6c 및 도 6d는 비결핵 양성 표준 균주에 관한 결과이며, 도 6e 및 도 6f는 내적대조군의 양성 표준 균주에 관한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 객담 검체에 대한 본 발명의 프라이머 세트 및 탐침의 검출 결과에 관한 것으로, 도 7a는 결핵 양성 균주에 대한 결과이고, 도 7b는 비결핵 양성 균주에 대한 결과이며, 도 7c는 음성 균주에 대한 결과이며, 도 7d 및 도 7e는 민감도를 테스트한 결과에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
분석 시료 준비
결핵 및 비결핵 항산균 균주는 액체 배지(BACTEC MGIT960, BD)에서 배양하여 사용하였다. 배양된 MGIT 마이코박테리아 배양튜브로부터 액체배지 500㎕를 취해 1.5㎖ 튜브에 넣고 14000rpm에서 5분 동안 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후, 상층액은 버리고 침전물(pellet)에 멸균 증류수 300㎕를 첨가한 후 끓는 물에서 10분 동안 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 PCR의 DNA 주형(template)로 사용하였다. 본 발명에서 사용한 비결핵 항산균 균주는 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium, ATCC25291); 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae, ATCC14470); 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare, ATCC13950); 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii, ATCC12478); 마이코박테리움 오슬로엔시스(Mycobacterium osloensis, ATCC10973); 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei, ATCC11785); 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis, ATCC19420); 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae, ATCC9614); 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus, ATCC19977); 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae, KCTC9505); 마이코박테리움 뮤코제니쿰(Mycobacterium mucogenicum, KCTC19088); 마이코박테리움 페레그리눔 (Mycobacterium peregrinum, KCTC9615); 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae, ATCC25275); 마이코박테리움 울린스키이(Mycobacterium wolinskyi, ATCC700010); 및 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi, NCCP15718)이다.
프라이머 제작
결핵균 탐지의 목적 유전자로서 IS6110 유전자를 선별하였고, 비결핵-항산균 탐지의 목적 유전자로서 16s rRNA 유전자를 선별하였다. 서열 정렬을 기반으로, 상기 유전자에 대하여 Primer 3 프로그램을 사용하여 프라이머 서열을 디자인하였다. 결핵균 특이적인 프라이머 세트에서, NCBI 데이터베이스에서 확인한 결핵 균의 IS6110 유전자 서열을 사용하여 프라이머 서열 및 탐침 서열을 디자인하였다. 비결핵 항산균 탐지용 프라이머 세트에서, NCBI 데이터베이스에서 확인한 마이코박테리아 균종의 16s rRNA 유전자 서열을 분석하여 과다가변성 영역(hypervariable region)에서 특이적인 염기서열 영역을 동정하여 프라이머 및 탐침을 디자인하였다. 본 발명에 따른 프라이머 서열은 하기 표와 같다.
프라이머 서열
구분 표적유전자
(NCBI Accession No.)		 프라이머 세트 프라이머 또는
탐침		 서열
(5' →3')		 위치
(길이)		 크기
(bp)
MTB
(결핵)		 IS6110
(AJ242908.1)		 Set 1 TBISF01 GTGGCCAACTCGACATCCTC
(서열번호 1)		 1195-1215
(20)		 118
TBISR01 GAGCGGTCGGAAGCTCCTAT
(서열번호 2)		 1293-1313
(20)
TBISP01 HEX-ATAGGCCGTTGATCGTCTCGGCTA-BHQ1
(제 1 탐침, 서열번호 7)		 1259-1283
(24)
Set 4 TBIS_3F GCCAAGCCGTGAGGTTG
(TM 57.7℃)		 202-219
(17)		 155
TBIS_3F CGGGCCGATCGGTTTGG
(TM 60.0℃)		 340-357
(17)
Set 5 TBIS_3F GCCAAGCCGTGAGGTTG
(TM 57.7℃)		 202-219
(17)		 81
TBIS-4F GGACTCCCGGCGAATATGT
(TM 58.3℃)		 402-421
(19)
Set 6 TBIS_4F CCAAACCGATCGGCCCG
(TM 60.0℃)		 340-357
(17)		 219
TBIS_4F GGACTCCCGGCGAATATGT
(TM 58.3℃)		 402-421
(19)
NTM
(비결핵)		 16s rRNA
(JX266694)		 Set 2 16SNTMF01 TTGTCCTATGTTGCCAGCGGG
(서열번호 3)		 730-751 (20) 220
16SNTMR01 TTCATGGGGTCGAGTTGCAG
(서열번호 4)		 949-970 (20)
16SNTMP01 FAM-ACAGAGGGCTGCGAYGCCGY-BHQ1
(제 2 탐침, 서열번호 8)		 864-885 (20)
Set 7 16SNTMF02 AAAGCTTTTGCGGTGTGGGAT 159-181
(21)		 152
16SNTMR02 ACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT 286-308
(21)
IC
(내적대조군,
internal control)		 GAPDH
(NG_009329)		 Set 3

 ICF01 CCATGGAGAAGACTGGGGCT
(서열번호 5)		 470-491
(20)		 236
ICR01 GGTGATGGCATGGACTGTGG
(서열번호 6)		 660-681
(20)
ICP01 Cy5.5-ACCAACTGCTTAGCGCCCCG-BHQ2
(제 3 탐침,서열번호 9)		 629-649
(20)
상기 탐침 서열에서, 결핵 탐지 시 표지물질로서 사용한 HEX는 보라색 형광을 나타내고 비결핵 탐지에 사용한 FAM은 녹색 형광을 나타내며 Cy5.5는 노란색 형광을 나타낸다.
일반적( Conventional ) PCR
3.1 PCR 조건
각 대상 균주에 대하여 제조된 프라이머의 작동 여부를 확인하기 위해 대상 균주(결핵, 비결핵, 내부 대조군)에 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응을 위한 조성물의 구성 및 PCR 조건은 하기 표와 같다. 2x AmpMaster taq은 NEXpro 사에서 구입하였다.
PCR 조성물
구분 부피
2x AmpMaster taq 10 ㎕
프라이머 F(10pmol) 1 ㎕
프라이머 R(10pmol) 1 ㎕
템플레이트 DNA 1 ㎕
증류수 7 ㎕
전체 부피 20 ㎕
PCR 조건
단계별 온도 시간
94℃ 3 min
94℃ 30sec
58℃ 30sec
72℃ 30sec
72℃ 5min
12℃ ∞
사이클 수: 30
3.2 결핵 균주 검출
본 발명에 따른 결핵 균주 검출용 프라이머 set를 사용하여 결핵 균주(표준 균주 및 양성 검체)에 대한 검출을 확인하였다(도 1). 결핵 균주 내 표적 유전자(IS6110)에 대한 프라이머 세트 1은 결핵 균주만을 특이적으로 검출하였다(도 1a). 또한, 프라이머 세트 1을 이용할 경우 비결핵 항산균은 검출되지 않았다(도 1b). 반면, 프라이머 세트 4 내지 6 의 경우에는 결핵 균주에 대한 검출이 되지 않거나 약한 시그널을 나타내었고, 비결핵 균주(8종)에 대해서도 비특이적 검출 결과가 나타남을 확인하였다(도 1c).
NCBI BLAST 분석을 실시하였을 때 본 발명에 따른 결핵 균주 검출용 프라이머 세트 1, 4 내지 6 는 모두 결핵 균주 내 일치 비율이 매우 높은 것으로 확인되어 결핵 검출에 대한 결과가 예상되었으나, PCR을 실시한 결과에서는 결핵 검출 결과가 다른 것을 확인하였다(프라이머 세트 4 내지 6 에서는 낮은 결핵 검출 및 비특이적 검출 결과가 발생함). 상기 결과들을 통하여, 본 발명에 따른 결핵 균주 검출용 프라이머 세트 중 세트 1이 결핵 균주의 검출에서 가장 효과적인 프라이머 세트임을 확인할 수 있었다.
3.3 비결핵 균주 검출
비결핵 균주 검출을 위해 디자인한 프라이머 세트를 이용하여 비결핵 균주 검출을 실시하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 비결핵 균주 검출용 프라이머 세트 중 세트 2 는 다양한 비결핵 균주를 특이적으로 검출하였다(도 2a). 하지만, 프라이머 세트 7 은 비결핵 항산균 중 일부 균주를 검출할 수 없음이 확인되었다. (도 2b). 따라서, 비결핵 균주를 검출하는데 있어서, 프라이머 세트 2 가 가장 효과가 좋다는 것을 확인할 수 있었다. 비결핵 균주 검출에서의 결과도 프라이머 제작 프로그램을 사용하여 제작한 프라이머 서열에 대하여 NCBI BLAST에 의한 예측만으로는 정확한 검출 결과를 확신할 수 없다는 것을 검증하고 있다.
3.4 내적 대조군 검출
내적 대조군에 대하여 제작한 프라이머 세트 3은 정상적으로 작동함을 확인하였다(도 3).
실시간( Real - time ) PCR
4.1 단일 검출
실시예 2를 통하여 선택한 프라이머 세트들(1, 2 및 3)을 이용하여 결핵, 비결핵 및 내부 대조군 표준 균주에 대한 실시간 PCR을 실시하여 프라이머 세트 및 탐침이 표적 균주 내 표전 유전자에 대하여 정상적으로 작동함을 확인하였다(도 4a 내지 도 4c). PCR용 premix(Cat No. NexQ-4000)는 GLS(Genes Laboratories) 사로부터 구입하였고, PCR 반응을 위한 조성물의 구성 및 PCR 조건은 하기 표와 같다.
단일 검출용 실시간 PCR 조성물
구분 부피
iQ Multiplex power mix 25 ㎕
프라이머 F+R mix(10pmol) 2 ㎕
탐침 (5pmol) 1 ㎕
템플레이트 DNA(1/5) 1 ㎕
증류수 21 ㎕
전체 부피 50 ㎕
단일 검출용 실시간 PCR 조건
단계별 온도 시간
95℃ 15 min
95℃ 20 sec
63℃ 40 sec
사이클 수: 45
4.2 동시 검출
결핵, 비결핵 및 내부 대조군 표준 균주에 대한 동시 검출 실시간 PCR을 수행하여 프라이머 세트 및 탐침이 정상적으로 작동함을 확인하였다(도 4d).
동시 검출용 실시간 PCR 조성물
구분 부피
iQ Multiplex power mix 25 ㎕
프라이머 F+R mix(3종, 10pmol) 3 ㎕
탐침 mix(3종, 5pmol) 1.5 ㎕
템플레이트 DNA(MTB+NTM+IC) 1 ㎕
증류수 19.5 ㎕
전체 부피 50 ㎕
동시 검출용 실시간 PCR 조건
단계별 온도 시간
95℃ 15 min
95℃ 20 sec
63℃ 40 sec
사이클 수: 45
멀티플렉스 실시간( Real - time ) PCR
결핵, 비결핵 및 내부 대조군에 대한 멀티플렉스 실시간 PCR을 수행하여 결핵 검출(도 5a), 비결핵 양성 균주에 대한 검출(도 5b 및 도 5c) 및 음성 균주에 대한 미검출(도 5d 및 도 5e)을 확인하였다.
멀티플렉스 실시간 PCR 조성물
구분 부피
iQ Multiplex power mix 25 ㎕
프라이머 F+R mix(3종, 10pmol) 3 ㎕
탐침 mix(3종, 5pmol) 1.5 ㎕
템플레이트 DNA(MTB+NTM+IC) 5 ㎕
증류수 5.5 ㎕
전체 부피 40 ㎕
멀티플렉스 실시간 PCR 조건
단계별 온도 시간
95℃ 10 min
95℃ 15 sec
63℃ 40 sec
사이클 수: 45
민감도 테스트
본 발명에 따른 프라이머 세트에 대하여 실시간-PCR에서의 민감도를 테스트하였다. 결핵(MTB, 도 6a 및 도 6b), 비결핵(NTM, 도 6c 및 도 6d) 및 내적대조군(도 6e 및 도 6f)의 양성 표준 균주 유래 플라스미드 DNA의 농도를 다양한 배율로 희석하여 제조한 뒤, 실시간-PCR을 실시하였다(도 6). 상기 결과를 통하여, 결핵 균주의 경우에는 0.05pg의 농도에서도 검출이 되는 것을 확인하였으며, 비결핵 균주의 경우에는 0.57pg의 농도에서도 검출이 되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, 본 발명에 따른 프라이머 세트 1 및 2 는 매우 높은 민감도를 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
객담 검체 분석
7.1 시료 준비
객담 검체는 15㎖ 또는 50㎖ 튜브에 담긴 객담의 양과 동일한 용량의 1N NaOH를 첨가하여 10분 동안 방치하여 객담을 액화시켰다. 14000rpm에서 2분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 남은 침전물에 멸균 증류수 1㎖을 넣고 10초 동안 혼합하였다. 14000rpm에서 2분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 남은 침전물에 멸균 증류수 1㎖을 넣고 10초 동안 혼합한 후 14000rpm에서 2분 동안 원심 분리한 후 상층액을 버리고 침전물을 회수하였다. 침전물에 5% 킬렉스 수지(chelex resin) 100㎕와 10㎎/㎖의 프로테나아제 K 1㎕를 첨가하여 혼합하였다. 56℃에서 15분 동안 방치한 후 끓는 물에 10분 동안 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후, 14000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 PCR의 DNA 주형(template)로 사용하였다.
7.2 검출 결과
실시예 6.1에서 획득한 검체에 대하여 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 녹십자 MS 키트를 사용한 멀티플렉스 실시간 PCR을 실시하였다(도 7a 내지 도 7c).
또한, 상기 검체에 대한 검출 효과를 본 발명에 따른 프라이머 세트를 시판 중인 녹십자 MS 키트와 비교하였다(표 10 및 표 11).
결핵(MTB) 양성 검체 분석 결과
구분 전체 검체 MTB 양성 검체
MTB(결핵) NTM(비결핵)
YD 생명과학 220 검체 211(95.9%) 0
녹십자 MS 220 검체 190(86.4%) 0
비결핵(NTM) 양성 검체 분석 결과
구분 전체 검체 NTM 양성 검체
MTB(결핵) NTM(비결핵)
YD 생명과학 50 검체 0 50(100%)
녹십자 MS 50 검체 0 50(100%)
상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 결핵 양성 검체에 대한 검출 효과에서 본 발명에 따른 프라이머 세트가 시판 중인 녹십자 MS 키트에 비해 높은 검출 효율을 나타냄을 확인하였다.
또한, 녹십자 키트를 사용한 결핵 검출시 비특이적인 비결핵균 탐지가 관찰되었으므로(도 7d), 본 발명에 따른 프라이머 세트가 녹십자 MS 키트에 비해 민감도가 우수함을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> YD Global Life Science Company <120> Primer set for detection of mycobacterium tuberculosis and non-Tuberculosis mycobacteria and use thereof <130> DPB162630 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> mycobacterium tuberculosis <400> 1 gtggccaact cgacatcctc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> mycobacterium tuberculosis <400> 2 gagcggtcgg aagctcctat 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NonTuberculous Mycobacteria <400> 3 ttgtcctatg ttgccagcgg g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NonTuberculous Mycobacteria <400> 4 ttcatggggt cgagttgcag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control (GAPDH) <400> 5 ccatggagaa gactggggct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control <400> 6 ggtgatggca tggactgtgg 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> mycobacterium tuberculosis <400> 7 ataggccgtt gatcgtctcg gcta 24 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NonTuberculous Mycobacteria <400> 8 acagagggct gcgaygccgy 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control (GAPDH) <400> 9 accaactgct tagcgccccg 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 3 프라이머 세트; 서열번호 7의 제 1 탐침, 서열번호 8의 제 2 탐침 및 서열번호 9의 제 3 탐침을 포함하는, 결핵균(MTB, mycobacterium tuberculosis) 및 비결핵(NTM, Non-tuberculosis mycobacteria) 항산균의 동시 검출용 조성물로서, 상기 제 1 프라이머 세트 및 제 1 탐침은 결핵균 내 IS6110 유전자에 대하여 결합 특이성을 갖고 상기 제 2 프라이머 세트 및 제 2 탐침은 비결핵 항산균 내 16s rRNA 유전자에 대한 결합 특이성을 가지며 상기 제 3 프라이머 세트 및 제 3 탐침은 내적 대조군으로서 GAPDH(GlycerAldehyde 3-Phosphate DeHydrogenase) 유전자에 대한 결합 특이성을 가지며, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium); 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae); 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare); 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii); 마이코박테리움 오슬로엔시스(Mycobacterium osloensis); 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei); 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis); 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae); 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus); 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae); 마이코박테리움 뮤코제니쿰(Mycobacterium mucogenicum); 마이코박테리움 페레그리눔(Mycobacterium peregrinum); 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae); 마이코박테리움 울린스키이(Mycobacterium wolinskyi) 및 마이코박테리움 포투이튬(Mycobacterium fortuitum)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 3 프라이머 세트; 서열번호 7의 제 1 탐침, 서열번호 8의 제 2 탐침 및 서열번호 9의 제 3 탐침을 포함하는, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 키트로서, 상기 제 1 프라이머 세트 및 제 1 탐침은 결핵균 내 IS6110 유전자에 대하여 결합 특이성을 갖고 상기 제 2 프라이머 세트 및 제 2 탐침은 비결핵 항산균 내 16s rRNA 유전자에 대한 결합 특이성을 가지며 상기 제 3 프라이머 세트 및 제 3 탐침은 내적 대조군으로서 GAPDH(GlycerAldehyde 3-Phosphate DeHydrogenase) 유전자에 대한 결합 특이성을 가지며 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium); 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae); 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare); 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii); 마이코박테리움 오슬로엔시스(Mycobacterium osloensis); 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei); 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis); 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae); 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus); 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae); 마이코박테리움 뮤코제니쿰(Mycobacterium mucogenicum); 마이코박테리움 페레그리눔(Mycobacterium peregrinum); 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae); 마이코박테리움 울린스키이(Mycobacterium wolinskyi); 및 마이코박테리움 포투이튬(Mycobacterium fortuitum)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 키트.
  5. 삭제
  6. (a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 분리된 DNA를 주형(template)으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 1 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 2 프라이머 세트, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 3 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 실시하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR에 의해 증폭된 DNA를 주형으로 표지물질로 표지된 서열번호 7의 제 1 탐침, 서열번호 8의 제 2 탐침 및 서열번호 9의 제 3 탐침을 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하여 결핵균 및 비결핵 항산균을 탐지하는 단계;를
    포함하며 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium); 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae); 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare); 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii); 마이코박테리움 오슬로엔시스(Mycobacterium osloensis); 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei); 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis); 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae); 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus); 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae); 마이코박테리움 뮤코제니쿰(Mycobacterium mucogenicum); 마이코박테리움 페레그리눔(Mycobacterium peregrinum); 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae); 마이코박테리움 울린스키이(Mycobacterium wolinskyi); 및 마이코박테리움 포투이튬(Mycobacterium fortuitum)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출 방법.
  7. 제 6항에서,
    상기 표지물질은 탐침 내 5' 말단에서 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이고, 탐침 내 3'-말단에서 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black holequencher-1,2,3(BHQ-1,2,3)인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출 방법.
  8. 제 6항에서,
    상기 (c) 단계의 중합효소연쇄반응은 다중 실시간 PCR(multiplex real-time PCR)인, 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020054906A1 (ko) * 2018-09-11 2020-03-19 한국과학기술정보연구원 목표 유전자를 검출하기 위한 프라이머의 설계 방법
WO2021075912A1 (ko) * 2019-10-18 2021-04-22 고려대학교 산학협력단 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100692484B1 (ko) 2005-11-03 2007-03-13 재단법인서울대학교산학협력재단 결핵균 및 비결핵항산성균 감별 또는 동정 방법 및 이에사용되는 뉴클레오타이드들
KR101403507B1 (ko) * 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100692484B1 (ko) 2005-11-03 2007-03-13 재단법인서울대학교산학협력재단 결핵균 및 비결핵항산성균 감별 또는 동정 방법 및 이에사용되는 뉴클레오타이드들
KR101403507B1 (ko) * 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Elisa Lazzeri et al., Journal of Clinical Microbiology, 50(11), pp3777-3779, 2012*

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020054906A1 (ko) * 2018-09-11 2020-03-19 한국과학기술정보연구원 목표 유전자를 검출하기 위한 프라이머의 설계 방법
WO2021075912A1 (ko) * 2019-10-18 2021-04-22 고려대학교 산학협력단 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
KR20210046887A (ko) * 2019-10-18 2021-04-29 고려대학교 산학협력단 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
KR102274011B1 (ko) * 2019-10-18 2021-07-09 고려대학교 산학협력단 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트

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