KR20230057778A - Pna 프로브를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트 - Google Patents

Pna 프로브를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소 결핵병의 진단방법과 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Mycobacterium tuberculosis complex(MTC)의 IS1081, IS6110 및 IS1561 유전자 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 MTC 진단용 키트 및 방법은 높은 민감도와 특이도로 소 결핵병을 효과적으로 검출할 수 있기 때문에, 도축장 및 시험소에서의 소 결핵병 의심축의 확진 및 균배양 이전의 신속한 소 결핵병의 진단 및 활용 연구에 유용할 뿐만 아니라, 다양한 시료의 병성감정에 이용될 수 있어 유용하다.

Description

PNA 프로브를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트{Method and Kit for Diagnosing Bovine tuberculosis using PNA}
본 발명은 소 결핵병의 진단방법과 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Mycobacterium tuberculosis complex(MTC)의 IS1081, IS6110 및 IS1561 유전자 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트에 관한 것이다.
소 결핵병(Bovine tuberculosis)은 세포 내 기생하는 결핵균 Mycobacterium tuberculosis complex인 Mycobacterium bovis 에 의해 수개월 내지 수년에 걸쳐 만성적인 쇠약 등을 특징으로 하는 소모성 질병으로 법정 제 2종 가축전염병이며, 인수공통전염병으로서 대부분의 포유동물에 감수성이 있으며, 가축에서는 주로 소에서 문제가 되고 있다.
오염된 사료 ·물 ·젖 등에 의해 경구적으로 전염되고, 비말감염(飛沫感染), 공기전염, 자궁 내 감염도 가능하다. 외관상 특이한 임상증세는 없고 가끔 기침이나 호흡곤란 등을 일으키며, 체표림프절이 붓고 열통이 없이 유방이 붓고 유량이 감소되거나 분비가 중지된다. 결핵 결절은 주로 폐, 늑막 등의 호흡기 계통에 형성되며, 간, 지라, 복막, 림프절 등에도 형성되는데, 결절의 중심부는 괴사에 이어 건락화되며 시간이 경과되면서 석회화한다. 소에서 흔히 늑막, 복막에서 광택이 있는 진주 모양의 작은 결핵결절을 볼수 있어 진주병이라고도 불린다.
이러한 소 결핵병의 진단 방법은 주로 세포성면역반응을 이용한 것으로 국제수역사무국(OIE)에서는 국가 간 교역시에 이용가능한 공인진단법으로 소결핵균(Mycobacterium bovis)에서 추출한 단백항원인 PPD-B (Purified Protein Derivatives)를 이용한 피내검사법 (Skin test)을 인정하고 있으며, 감마인터페론법 (IFN-γassay) 역시 보조적인 진단법으로 인정하고 있으며(한국 공개특허 제10-2011-0052295호), 이외에도 항체 ELISA, 원인체 확인을 위한 결핵균 분리동정, PCR 등의 방법이 있다. 이 중 피내검사 또는 IFN-γ assay를 이용한 살아있는 소에 대한 진단과 도축장으로 출하되는 소에 대한 도축검사가 결핵병 관리의 큰 틀을 이루고 있다.
소 결핵병 감염소에서 확인되는 결핵소견은 조직의 중심부가 괴사되면서 건락화하거나 석회화되는 특징이 있다. 주로 폐, 흉벽 등 호흡기 장기와 두경부 림프절(인후두 림프절, 악하 림프절 등)에서 주로 확인되나, 간, 장간막림프절, 신장 등 폐외장기에서도 종종 확인된다. 도축검사 과정에서 발견되는 결핵병 감염 의심 조직은 병리조직검사로 진단하거나 조직에서 추출한 DNA를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 최종 진단하게 되는데 대부분의 가축방역기관에서는 민감도와 편이성을 이유로 PCR법을 이용하고 있다.
이러한 방법 중 하나는 M. bovis 확인을 위해서 PCR을 통한 유전자 증폭 부위로 결핵균에 특이적인 삽입서열(insertion sequence, IS)인 IS6110과 IS1081을 사용한다(Zumarraga et al., 2005, J Vet Diagn Invest 17: pp.232-238; Taylor et al., 2007, BMC Vet Res 3:12). IS6110은 MTC에서만 존재하고, M. tuberculosis의 유전자내에 일반적으로 5 copy 이상 가지고 있으나, M. bovis 에서는 5 copy 이하로 가지고 있고 대부분의 분리주에서는 1 copy만 존재하는 것으로 보고되었다 (Sreevatsan 등, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 9869-9874쪽). 한편, IS1081은 M. tuberculosis complex(MTC)에서 일반적으로 6 copy가 존재하며, 크기는 1,324 bp이다(Dziadek 등, 2001, Int J Tuberrc Lung Dis 5: 569-574쪽).
또한, M. tuberculosis는 그에만 삽입된 12.7 kb 절편 유전자 부위를 갖는데, 이 12.7kb 유전자 부위로 인해 병원성과 숙주 범위의 차이가 발생한다는 보고에 기초하여 M. bovis와 감별 진단할 수 있는 PCR 방법도 개발되었다(Bakshi et al., 2005, Vet Microbiol 109: pp. 211-216).
대한민국 특허 제10-1323857호에는 우결핵균 검출용 PCR 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법이 기재되어 있으며,
대한민국 특허 제10-2123621호에는 Realtime PCR과 융해온도 측정을 이용한 비결핵균, 결핵균 및 다제내성결핵균의 검출방법이 기재되어 있으나, 정확도가 낮다는 단점이 있다.
한편, PNA는 peptide nucleic acids의 약자로 LNA (Locked nucleic acid), MNA (Morpholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로 인공적으로 합성하며 기본 골격이 전기적으로 중성인 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA의 경우 국내 원천특허로 국가 경쟁력을 가지는 소재로, PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하고, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는 특징이 있다. 또한, 열·화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. DNA-DNA 결합 대비 PNA-DNA 결합력이 우수하며 융해 온도(melting temperature)가 약2배 이상 높으므로, 1개의 뉴클레오티드 미스매치(nucleotide miss match)에도 융해 온도에서10 ~ 15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP 및 In/Del의 핵산 변화를 효과적으로 검출할 수 있게 된다.
PNA 프로브 혼성화 방법(Hybridization method)의 분석 방법으로는 FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis)를 주로 이용하는데, FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후, 만들어진 산물과 넣어준 프로브간의 결합력의 차이를 Tm으로 구분하여 분석하는 방법이다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 9~15 mer의 염기서열을 이용하여 제작하며, 원하는 Tm값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절하거나, PNA 골격gamma 위치에 Lysine, Glutamic acid 또는 Alanine 등 아미노산을 연결하여 Tm 값을 조절할 수 있다.
PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하고 따라서 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 기존의 HRM(High resolution melting) 방법은 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면 PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 정밀한 분석이 가능한 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자를 프라이머로 증폭한 다음, 유전자 특이적 PNA 프로브로 융해 곡선을 분석할 경우, 신속하고 정확하게 마이코박테리움 튜버클로시스군을 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 마이코박테리움 튜버클로시스군을 검출할 수 있는 프로브 및 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브 및 프라이머 쌍을 이용한 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출을 통한 소 결핵병 진단방법 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex)검출용 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (ii) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 또는 (iii) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자 증폭용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 소 결핵병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 소 결핵병 진단방법을 제공한다:
(a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 및;
(d) 상기 (c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 마이코박테리움 튜버클로시스군의 존재 여부를 결정하는 단계.
본 발명에 따른 MTC 진단용 키트 및 방법은 높은 민감도와 특이도로 소 결핵병을 효과적으로 검출할 수 있기 때문에, 도축장 및 시험소에서의 소 결핵병 의심축의 확진 및 균배양 이전의 신속한 소 결핵병의 진단 및 활용 연구에 유용할 뿐만 아니라, 다양한 시료의 병성감정에 이용될 수 있어 유용하다.
도 1은 Mycobacteria tuberculosis complex(MTC)의 표준균주에서의 민감도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 형광별 검출 부위의 융해곡선 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 소에게서 흔히 발견될 수 있는 기타 균주에서의 비특이 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Mycobacteria tuberculosis complex(MTC)의 비정형항산균에서의 특이도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 bovine tuberculosis 양성우 50마리의 조직에서의 검출시험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 bovine tuberculosis 음성우 90마리의 조직에서의 검출시험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 각 지자체에서 사용중인 PCR 키트의 성능을 확인한 결과로서, 적색 삼각형이 증폭이 확인되지 않는 샘플을 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 방법으로 설계한 프라이머를 이용해 제작한 증폭산물의 전기영동 결과로서, M은 100bp marker, 1번 레인은 IS1561 AN5 DNA, 2번 레인은 IS1561 clinical DNA, 3번 레인은 IS6110 AN5 DNA, 4번 레인은 IS6110 clinical DNA, 5번 레인은 IS1081 AN5 DNA, 6번 레인은 IS1081 clinical DNA, N은 음성 컨트롤을 의미한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자(IS1081, IS1561, IS6110)를 PNA 프로브로 검출할 경우, 복잡한 과정을 거치지 않고 융해곡선의 분석만으로 마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex)을 검출할 수 있음을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자(IS1081, IS1561, IS6110)에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 설계하고, 이를 이용하여 융해곡선을 분석할 경우, 추가적인 분석 작업 없이 융해곡선의 분석만으로 마이코박테리움 튜버클로시스군을 검출할 수 있다는 것을 확인하였다(도 2).
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex) 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, 또는 Alexa680 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, BHQ3 및 Dabcyl로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하고, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 유무를 검출할 수 있다.
PNA(Peptide Nucleic Acid)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로, 인공적으로 합성하며 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성 (selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한 DNA-DNA 결합 대비 PNA-DNA 결합력이 우수하며 융해 온도(melting temperature)가 약 2배 이상 높으므로, 1개의 핵산 불일치(nucleotide mismatch)에도 10~15℃가량 융해온도(Tm) 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertion/deletion) 핵산 변화를 검출할 수 있게 된다.
본 발명의 용어 "프로브"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, LNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. PNA는 단일 염기부정합 때문에 이중가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에서 표적핵산은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
PNA 프로브의 핵산과 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 응용기술의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 수화(hydrolysis) 반응과는 다른 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 표지 프로브(molecular beacon probe), 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
혼성화 반응의 분석 방법으로는 형광융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)를 이용하며, 형광융해곡선분석은 PCR 반응 종료 후 생성된 산물과 투입한 프로브 간의 결합력 차이를 융해온도로 구분하여 분석한다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 11~18 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 융해온도를 갖는 프로브를 설계하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절할 수 있으며, PNA 골격 gamma 위치에 Lysine, Glutamic acid 또는 Alanine 등 아미노산을 연결하여 Tm 값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM method는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되고 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면, PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 빠르고 정확한 분석이 가능하다.
본 발명에서 "PNA 프로브(probe)"는 표적핵산이 존재하는 경우 표적핵산에 우선적으로 결합하여 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 표적핵산이 없는 경우 내부컨트롤에 결합하여 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있으며, 내부컨트롤과 표적핵산 융해곡선 차이를 이용하여 위양성 및 위음성 시그널을 구분할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (i) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 또는
(iii) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자 증폭용 프라이머 쌍(primer pair)에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자는 IS1081, IS1561 또는 IS6110인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 내부대조물질; 및 이를 검출하기 위한 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍, 및 서열번호 4의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 때, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍은 내부대조물질을 증폭시키고, 서열번호 4의 PNA 프로브는 내부대조물질과 혼성화되어, 마이코박테리움 튜버클로시스의 존재 유무와는 상관없이 실시간 PCR(real-time PCR)의 성공 유무를 판별할 수 있다. 따라서, 상기 내부대조물질은 시료에 일반적으로 포함되는 유전자(예를 들어, 하우스 키핑 유전자) 또는 따로 주입하는 주형 핵산을 의미하는 것으로, 바람직하게는 마이코박테리움 튜버클로시스에 존재하지 않는 유전자(본 발명에서는 Cymbidium sinense의 psbA 유전자) 부위, 더욱 바람직하게는 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다. 이와 같은 맥락에서, 해당 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍 및 상기 유전자에 혼성화되는 프로브는, 본 발명에서 제시하는 프라이머 쌍 및 PNA 프로브 이외에도, 당업자가 용이하게 선택하여 적용할 수 있을 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 소 결핵병 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 버퍼(buffer), DNA 중합효소(DNA polymerase), DNA 중합효소 조인자(DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP)와 같은 핵산 증폭 반응(예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 분자, 역전사효소(reverse transcriptase), 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서의 기재사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기 및 프라이머 또는 프로브를 포함하는 용기를 포함할 수 있다.
상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면 완충액 제조방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 소 결핵병 진단방법에 관한 것이다:
(a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 마이코박테리움 튜버클로시스군의 존재 여부를 결정하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자는 IS1081, IS1561 또는 IS6110인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 시료는 소 결핵병을 진단하고자 하는 검체로부터 유래한 것으로, DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 것이고, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형태일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일 가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 시료는 혈액, 분비액, 대변, 세포, 조직, 기관 또는 신체 일부일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 단계의 증폭은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥 (double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 내부대조물질 증폭을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 내부대조물질의 증폭은 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍을 이용하여 수행하고, 서열번호 4의 프로브로 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 융해곡선 분석은 타겟 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 핵산을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨 후, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한 다음, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 표적 핵산의 유무를 판단하는 방법이다.
Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 표적 핵산을 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준 값보다 낮으면, 미스매치, 즉 타겟 DNA가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 마이코박테리움 튜버클로시스군( Mycobacterium tuberculosis complex) 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작
마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex) 감염여부를 확인하기 위하여, 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출용 프라이머 및 프로브의 경우, NCBI Gene bank에 등록되어 있는 마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex)의 IS1081 sequence(GeneBank accession no. X61270.1), IS6110 sequence(GeneBank accession no. AJ242908.1) 그리고 IS1561 sequence(Rv3349c)을 분석하여 마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex)을 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머 세트를 설계하고, 상기 프라이머를 이용한 증폭산물 안에서 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 제작하였다(표 1).
마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자 검출에 사용한 프라이머 및 프로브 서열
이름 Sequence (5’→3’) 서열번호
IS1561 Probe Dabcyl-TCGTTGGCCAGCG-O-K(FAM) 1
IS6110 Probe Dabcyl-TGTGGGCCTTGAT-O-K (Hex) 2
IS1081 Probe Alexa680-TCCCCAAGCTGCGC-O-K (BHQ3) 3
IPC Probe Dabcyl-ATCCGAATTCTCGTTC-O-K(TxR) 4
IS1561 Forward TCGTGGAACGCCCAGGTCAC 5
IS1561 Reverse ACGCCAAGCTCGTCGTCGAC 6
IS6110 Forward GAGCAGGTCGACGGGCG 7
IS6110 Reverse ACCACCAGGTACTTGCCGCAC 8
IS1081 Forward ACCGCCACCGTGATTTCGACAC 9
IS1081 Reverse TGCAGCAGCCAGTCCGGGA 10
IPC Forward GCTATCTTGTTGGGTTCAGGTGC 11
IPC Reverse GGCACTTATCATTCATTGGCGGG 12
IPC TGTTCTTAGAACAAGATATTGGGGGATTGCTATCTTGTTGGGTTCAGGTGCTTTTTGCTTCTCTATCCGAATTCTCGTTCTTTATCATAAAAGTTCTCCCCCGCCAATGAATGATAAGTGCCTAGGTGAAGCATAGTATAAGATAAGTCAGAAAAGTCTAAGTCTTATGAAAAAGAAAATAAAT 13
프라이머 세트와 프로브는 모두 시선바이오(Seasunbio, Korea)에 주문 의뢰하여 제작하여 사용하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출을 위한 PNA 프로브는 융해온도가 75℃ 넘지 않도록 하여 중합효소연쇄반응에 영향을 주지 않도록 제작하였다.
실시예 2. 마이코박테리움 튜버클로시스군의 검출결과 분석
PNA 프로브를 이용한 소 결핵병의 진단을 위하여 IS1081, IS1561, IS6110유전자 안에서 최적의 프라이머 및 PNA 프로브 위치를 선정하였다. 또한 실험 중 오염에 따른 위양성 판별 여부를 판단하기 위해 내부 대조군을 합성 제작하였다.
실험장비로는 CFX96TM (Bio-Rad, 미국)를 사용하였고, 실험 조성의 경우 하기 표 2와 같은 조성을 사용하였으며, 실시간중합효소연쇄반응 실험 조건은 50℃, 5분간 반응으로 오염방지 단계인 UDG(uracil DNA glycosylase)활성 후, 선변성(pre-denaturation) 95℃, 10분; 변성(denaturation) 95℃, 30초; 결합(annealing) 58℃, 30초; 및 신장(Extension) 74℃, 30초를 45회 반복한 후, 융해곡선 분석법을(Melting curve analysis) 수행하였다.
융해곡선은 95℃, 5분; 75℃, 1분; 55℃ 1분으로 혼성화 시킨 후, 45℃에서 85℃까지 5초당 1℃씩 증가하면서 형광값을 측정하는 Melting curve 분석단계를 수행하였다.
실험 조성
물질 양(농도)
(표준균주) 3 ul (농도)
서열번호 1 Forward primer 0.5 ul (3 pmol)
서열번호 1 Reverse primer 0.5 ul (40 pmol)
서열번호 2 Forward primer 0.5 ul (3 pmol)
서열번호 2 Reverse primer 0.5 ul (40 pmol)
서열번호 3 Forward primer 0.5 ul (3 pmol)
서열번호 3 Reverse primer 0.5 ul (30 pmol)
서열번호 4 Forward primer 0.5 ul (2 pmol)
서열번호 4 Reverse primer 0.5 ul (10 pmol)
서열번호 1 Probe 0.5 ul (3.5 pmol)
서열번호 2 Probe 0.5 ul (2.5 pmol)
서열번호 3 Probe 0.5 ul (3.5 pmol)
서열번호 4 Probe 0.5 ul (1 pmol)
2X qPCR PreMix 10 ul
DW 1 ul
전체 부피 20 ul
PCR을 통해 IS1081, IS1561은 94bp, IS6110은 113bp 크기의 마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex) 유전자 산물이 형성됨을 확인하였다(도 8).
표준균주인 Mycobacterium bovis AN5 균주(ATCC 35726)를 이용하여 융해곡선 분석 결과, 도 2와 표 3에 기재된 바와 같이, IS1081의 경우, Tm 값이 Alexa680 70±2℃IS1561의 경우 FAM 67±2℃IS6110의 경우 HEX 63±2℃내부 대조군의 경우 TxR 60±2℃에서 피크를 보이는 융해곡선을 나타내어 본 발명에 따른 PNA 프로브가 내부대조군과 표준균주를 명확히 판별할 수 있는 것을 확인하였다.
Type Fluor. Tm (℃)
IS1081 Alexa680 70 ± 2
IS1561 FAM 67 ± 2
IS6110 HEX 63 ± 2
IPC TxR 60 ±2
실시예 3. 표준균주에 대한 민감도 테스트
IS1081 / IS1561 / IS6110 real-time PCR kit의 양성조직 내에서의 프라이머가 증폭할 수 있는 최소 병원체 DNA 농도를 확인하기 위하여, real-time PCR을 이용하여 각 병원체 프라이머의 민감도(sensitivity) 테스트를 수행하였다.
표준균주인 Mycobacterium bovis AN5 균주 DNA 1ng/㎕를 5배와 10배 비율로 단계 희석(10-1ng/㎕ ~ 10-5.2ng/㎕)한 후, 상기 표 2의 농도로 프라이머와 프로브를 조합하여 real-time PCR을 실시예 2와 동일한 방법으로 민감도 테스트를 수행하였다.
그 결과, 도 1에 기재된 바와 같이, IS1081, IS1561, IS6110 real-time PCR kit는 10-4.4ng/㎕ 까지 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 기타 균주들에 대한 특이도 테스트
MTC의 DNA 타겟 병원체의 특이도(specificity)를 검증하기 위하여, 소에게서 흔히 발견될 수 있는 균주들 (E.coli spp., Salmonella spp., Bacillus spp. Clostridium spp.)에서 추출한 DNA에 대한 특이도 테스트를 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 3에 기재된 바와 같이, 19종의 병원체에서는 IPC를 제외한 모든프로브에서 유의미한 TM 값이 나타나지 않는 것을 확인하여 본 발명에서 제작한 키트의 특이도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. NTM 균주들에 대한 특이도 테스트
MTC의 DNA 타겟 병원체의 특이도(specificity)를 검증하기 위하여, Mycobacterium tuberculosis complex 이외의 비결핵성 항산균 (Nontuberculous mycobacteria, NTM) 에서 추출한 DNA에 대한 특이도 테스트를 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 4에 기재된 바와 같이, 5종의 병원체에서는 IPC를 제외한 모든프로브에서 유의미한 TM 값 및 Ct 값이 나타나지 않는 것을 확인하여 본 발명에서 제작한 키트의 특이도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 임상적 민감도 테스트
소결핵 양성 임상시료 50건을 대상으로 하여, 실시예 2의 방법으로 IS1081 / IS1561 / IS6110 real-time PCR을 수행하여, 소 결핵병 병원체에 대한 민감도를 테스트하였다.
양성우 검체 수 IS1081 / IS1561 / IS6110 detection
MTC detect 50 개 50 개
그 결과, 상기 표 4와 도 5에 기재된 바와 같이, IS1081 / IS1561 / IS6110 real-time PCR은 고 감도의 검출능력과 Melting curve의 Tm값 확인으로 위양성에 대한 2차 검증을 동시에 진행하여 소결핵 양성 임상시료 50건 모두 검출할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 6. 임상적 특이도 테스트
소결핵 음성시료 90건을 대상으로 하여, 실시예 2의 방법으로 IS1081 / IS1561 / IS6110 real-time PCR을 수행하여, 소 결핵병 병원체에 대한 특이도를 테스트하였다.
음성 검체 수 IS1081 / IS1561 / IS6110 detection
MTC detect 90 개 0 개
그 결과, 상기 표 5와 도 6에 기재된 바와 같이, 90개의 소 결핵병 음성시료에 대하여 IPC를 제외한 다른 프로브에서는 유의미한 TM값이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
실시예 7. 성능 확인
제작된 Real time PCR키트는 현재 각 지자체에서 진단용으로 사용중인conventional PCR 키트(이하 A키트라 함)와 비교해보았다. A 키트도 본 발명의 키트와 마찬가지로 다수의 개의 목표유전자에 대한 multiplex PCR제품이며, 결핵균 특이 유전자 중 IS1081과 IS6110에 대한 증폭 여부를 확인할 수 있다.
먼저 두 키트의 민감도 비교를 위해 소 결핵균의 분리가 확인된 양성 조직검체 50개에서 추출한 DNA로 본 발명의 키트는 실시예 2의 방법으로 성능을 테스트 하였으며, A 키트는 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였다.
본 발명의 키트는 Bio-rad사의 CFX96장비로 결과를 판독하였고, A 키트는 증폭반응 후, capillary 전기영동방식인 Fragment analyzer(Agilent, 미국)로 결과를 확인하였으며, PCR결과는 두 키트 모두 2개의 목적 유전자 중 한쪽에서만 밴드 또는 peak이 확인되어도(parallel) 양성으로 판정하였다.
그 결과, 본 키트는 IS1561과 IS6110에서 모두 50개에서 증폭이 되었고 IS1081에서는 48개의 시료에서 증폭이 확인되었으며, A 키트는 IS1081에서 46개, IS6110에서 36개의 증폭이 확인되었다(도 7).
따라서, 최종 50개 양성시료에 대한 민감도는 본 발명의 키트는 100%(50/50)인데 비해, A 키트는 92%(46/50)인 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Method and Kit for Diagnosing Bovine tuberculosis using PNA <130> P21-B055 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1561 Probe <400> 1 tcgttggcca gcg 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS6110 Probe <400> 2 tgtgggcctt gat 13 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1081 Probe <400> 3 tccccaagct gcgc 14 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC Probe <400> 4 atccgaattc tcgttc 16 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1561 Forward <400> 5 tcgtggaacg cccaggtcac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1561 Reverse <400> 6 acgccaagct cgtcgtcgac 20 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS6110 Forward <400> 7 gagcaggtcg acgggcg 17 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS6110 Reverse <400> 8 accaccaggt acttgccgca c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1081 Forward <400> 9 accgccaccg tgatttcgac ac 22 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1081 Reverse <400> 10 tgcagcagcc agtccggga 19 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC Forward <400> 11 gctatcttgt tgggttcagg tgc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC Reverse <400> 12 ggcacttatc attcattggc ggg 23 <210> 13 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC <400> 13 tgttcttaga acaagatatt gggggattgc tatcttgttg ggttcaggtg ctttttgctt 60 ctctatccga attctcgttc tttatcataa aagttctccc ccgccaatga atgataagtg 120 cctaggtgaa gcatagtata agataagtca gaaaagtcta agtcttatga aaaagaaaat 180 aaat 184

Claims (13)

  1. 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex)검출용 PNA 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터와 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출용 PNA 프로브.
  3. 제2항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, 또는 Alexa680 로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출용 PNA 프로브.
  4. 제2항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, BHQ3 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출용 PNA 프로브.
  5. (i) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (ii) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 또는
    (iii) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자 증폭용 프라이머 쌍.
  6. 제5항에 있어서, 상기 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자는 IS1081, IS1561 또는 IS6110인 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자 증폭용 프라이머 쌍.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제5항의 프라이머 쌍을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 내부대조물질; 및 이를 검출하기 위한 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍, 및 서열번호 4의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 튜버클로시스군 검출용 조성물.
  9. 제8항의 조성물을 포함하는 소 결핵병 진단용 키트.
  10. 다음 단계를 포함하는 소 결핵병 진단방법:
    (a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 제5항의 프라이머 쌍을 이용하여 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
    (c) 상기 증폭산물을 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 PNA 프로브와 혼성화시키는 및;
    (d) 상기 (c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 마이코박테리움 튜버클로시스군의 존재 여부를 결정하는 단계.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계는 내부대조물질 증폭을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 소 결핵병 진단방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 내부대조물질의 증폭은 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍을 이용하여 수행하고, 서열번호 4의 프로브로 검출하는 것을 특징으로 하는 소 결핵병 진단방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 마이코박테리움 튜버클로시스군 유전자는 IS1081, IS1561 또는 IS6110인 것을 특징으로 하는 소 결핵병 진단방법.
KR1020210141968A 2021-10-22 2021-10-22 Pna 프로브를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트 KR20230057778A (ko)

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