JPH0436199A - ミコバクテリア属微生物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
）属に属する微生物の検出方法に関する。

［従来の技術］ ヒト型結核菌（即ち、ミコバクテリウム・ツベルキュロ
シス；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕ　
ｌｏｓ　ｉ　ｓ）は、ヒトの結核の病原微生物であり、
その検査は臨床上極めて重要である。ヒト型結核菌は、
ヒトに対して強い病原性を示し、はとんど全ての臓器お
よび組織に結核性病変を起こす。特に肺結核が圧倒的に
多い。ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属
に属する微生物として、前記のヒト型結核菌のほかに、
非定型抗酸菌例えばウシ型結核菌（即ち、ミコバクテリ
ウム・ボビス；Ｍ、ｂｏｖｉｓ）またはトリ型結核菌（
即ち、ミコバクテリウム・アビウム；Ｍ、ａｖｉｕｍ）
が知られている。これらの非定型抗酸菌は病原性が弱い
が、ヒト、特にヒトの肺をしばしば侵す、しかし、肺結
核と臨床症状が酷似しているため、その鑑別が極めて重
要である。

従って、ヒト型結核菌の同定と非定型抗酸菌との分別を
短時間に行なうことは、的確な化学療法を実施するにあ
たり、特に重要な意義を有する。

従来、結核菌の検出方法としては培養法が汎用されてい
た０例えば、特公昭５１−７７２３号公報には、小川培
地に結核菌を接種して培養し、ヒト型結核菌とウシ型結
核菌とを識別する技術が記載されている。しかしながら
、これら従来の培養法によれば、培養に３〜８週間の期
間が必要であり、更に最終的な同定に２〜４週間かかる
。従って、早期診断には不都合であった。

一方、早期診断方法として、特開昭６３−１８０８５９
号公報には、ヒト型結核菌に特異的なモノクローナル抗
体をハイブリドーマ細胞ラインによって産生させ、この
モノクローナル抗体を用いる測定方法が記載されている
。しかし、この方法では被検試料の前処理が煩雑であっ
た。また、各種の結核菌に特異的な１１２５ラベル化Ｄ
ＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション法も開発
されている（例えば、Ｄ　ｉ　ａｇｎ、　Ｍｉ　ｃ　ｒ
ｏ　−ｂｉｏｌ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１９８７；８
：６９−７８）、Ｌかしながら、この方法は放射性物質
を用いるので特殊な設備を必要とし、更に、臨床試料か
らヒト型結核菌を直接的に検出・同定することが必ずし
も常に可能なわけではなかった。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明者は、臨床試料中に含まれているヒト型結核菌お
よび非定型抗酸菌に関する早期の検出および分別を実現
するために種々研究を重ねた結果、特定のＤＮＡプライ
マーを用いて、臨床試料中の抗酸菌（即ち、ヒト型結核
菌および非定型抗酸菌）のＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡ
を制限酵素で処理し、そしてその処理パターンを解析す
ることによって、抗酸菌（即ち、ヒト型結核菌および非
定型抗酸菌）を特異的に、高感度で、しかも迅速に検出
しそして分別することができることを見いだした。従っ
て、本発明の目的は、抗酸菌を特異的に、高感度で、し
かも迅速に検出・分別する手段を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 前記の目的は、本発明により、 （５’　）−ＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧ−（３’　　）で表
される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含有
する第１のＤＮＡプライマーと、式％式％（３） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマーと、ＤＮＡポリメラー
ゼと、水性液体被検試料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工
程にかけ、得られた反応液を制限酵素処理工程にかけ、
続いて、得られた処理液をＤＮＡ分画検査工程にがける
ことを特徴とする、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉａ）属に属する微生物の検出方法によって達成す
ることができる。

本明細書においては記載の簡略化のために以下の記号を
用いる。

Ａ：アデニン Ｃニシトシン Ｇニゲアニン Ｔ：チミン ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 ｔＲＮＡ：転写リボ核酸 ｄＡＴＰ　：デオキシアデノシン三すン酸ｄＣＴＰ　：
デオキシシチジン三すン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシ
ン三リン酸ｄＴＴＰ　：デオキシチミジン三すン酸ｄＮ
ＴＰ　：デオキシヌクレオシド三すン酸ｂｐ：塩基対 本発明方法で検出することのできる微生物は、ミコバク
テリア属に属する微生物である。これらは、抗酸菌と称
され、具体的には、ヒト型結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）、トリ
型結核菌（Ｍ。

ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・フォートライタム（
Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、ミコバクテリウム・チェロ
ナイ（Ｍ、ｃｈｅ　１　ｏｎｅｉ）　、ミコバクテリウ
ム・ゴルドネアー（Ｍ、ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバク
テリウム・イントラセルラーレ（Ｍ、１ｎｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｒｅ＞、ミコバクテリウム・カンサシ−（Ｍ、
ｋａｎ−ｓａｓｉｉ）、ミコバクテリウム・マリーナム
（Ｍ、ｍａｒｉｎｕｎ）　、ミコバクテリウム・スクロ
フラセウム（Ｍ、ｓｃｒｏｆｕｒａ−ｃｅｕｍ）、ミコ
バクテリウム・スメグマテイス（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔ　
ｉ　ｓ）　、ミコバクテリウム・スッルガイ（Ｍ、ｓｚ
ｕｌｇａｉ）またはミコバクテリウム・ガストリ（Ｍ、
ｇａｓｔｒｉ）を挙げることができる。特に重要な微生
物は、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、トリ型結核菌、Ｍ
、イントラセルラーレ、およびＭ、カンサシ−である。

本発明では、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
　　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法をＤＮＡ増幅工程として用い
ることができる。ＰＣＲ法を利用すると、微量の細胞Ｄ
ＮＡから、目的とするＤＮＡ領域のみを自動的に約１０
０万倍にまで増幅することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２３９：４８７−４９１．１９８８）、ＰＣＲ法では、
増幅させるＤＮＡ領域を挟んで十鎖および一鎖に対する
２種のＤＮＡプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
とを用いて増幅サイクルを繰り返す。

本発明方法で用いることのできる第１および第２のＤＮ
Ａプライマーは、ミコバクテリア属に属する微生物、特
にヒト型結核菌ＤＮＡ、トリ型結核菌ＤＮＡ、Ｍ、イン
トラセルラーレＤＮＡ、およびＭ、カンサシ−ＤＮＡに
おいて、はぼ共通の特異的タンパク質であるデイナＪ　
（ｄｎａ　　Ｊ）タンパク質をコードするＤＮＡ配列（
第１３９３位から第１３６０位）の上流５′側の１０〜
３０塩基のオリゴヌクレオチドおよび３′側の１０〜３
０塩基のオリゴヌクレオチドである。具体的には、第１
のＤＮＡプライマーとして、塩基配列（５”）−ＡＣＧ
ＣＧＧＣＡＴＧ−（３°）からなるデカヌクレオチド部
分を少なくとも含有するオリゴヌクレオチド、好ましく
は塩基配列（５°）−ＴＧＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣ−
（３′） からなるテトラデカヌクレオチド部分を少なくとも含有
するオリゴヌクレオチド、更に好ましくは塩基配列 （５’　）−ＧＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣ
Ａ−（３”） からなるエイコサヌクレオチド部分を少なくとも含有す
るオリゴヌクレオチドを用いることができる。

また、本発明方法では第２のＤＮＡプライマーとして、
具体的には、塩基配列 （５°）−ＴＴＣＧＴＣＧＴＡＣ−（３”）からなるデ
カヌクレオチド部分を少なくとも含有するオリゴヌクレ
オチド、好ましくは塩基配列（５°）−ＧＴＴＴＣＧＴ
ＣＧＴＡＣＴＣ−（３′） からなるテトラデカヌクレオチド部分を少なくとも含有
するオリゴヌクレオチド、更に好ましくは塩基配列 （５’　）−ＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＴ
Ｔ−（３’　） からなるエイコサヌクレオチド部分を少なくとも含有す
るオリゴヌクレオチドを用いることができる。

第１および第２のＤＮＡプライマーとして、１０塩基未
満のオリゴヌクレオチドを用いると特異性が充分ではな
いので好ましくない、また、３０塩基を越えるオリゴヌ
クレオチドを用いると自己重合する可能性が高くなるの
で好ましくない。

本発明方法で用いる第１および第２のＤ　、＋％ＪＡプ
ライマーを構成する各塩基は、当業者に公知の任意の態
様で修飾（例えば、ビオチン化、発光物質によるラベル
化）されていてもよい。

本発明で用いる前記の第１および第２のＤＮＡプライマ
ーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えば、アプライドバ
イオシステムズ社の自動合成機）を用いて、公知のＤＮ
Ａ合成法（例えば、ホスホアミタイト法）によって調製
することができる。

本発明では、ＤＮＡポリメラーゼとして、耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ、特に約９５℃までの温度で活性を維持す
ることのできる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、市
販のＴａｑポリメラーゼを用いることができる。

本発明方法で用いる液体被検試料は、ミコバクテリア属
に属する微生物、即ち、抗酸菌（ヒト型結核菌および非
定型抗酸菌、例えば、トリ型結核菌、Ｍ、イントラセル
ラーレおよびＭ、カンサシ−）を含有している疑いのあ
る試料であれば特に制限されない０例えば、喀痰、胃吸
引液、気管支肺胞洗浄液、便、尿、髄液または血液を用
いることができる。これらの液体被検試料に対して、Ｄ
ＮＡ増幅工程にかける前に、ＤＮＡ抽出処理（例えば、
フェノール／クロロホルム処理）を実施するのが好まし
い。

本発明方法では、前記の第１および第２のＤＮＡプライ
マー、ＤＮＡポリメラーゼならびに液体被検試料を含む
混合液を用いる。第１および第２のＤＮＡプライマーお
よびＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検試料の種
類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程
を実行することができる範囲で容易に決定することがで
きる。

この混合液は、場合により、緩衝液（例えば、トリス塩
酸Ｉ！衝液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、または
塩類（例えば、塩化ナトリウム）を含有することができ
る。

本発明方法では、前記の混合液を用いてＰＣＲ法の増幅
サイクルを実施する。増幅サイクルは、（ｉ）ＤＮＡの
変性工程（約り０℃〜約９５℃で、約１０秒間〜約２分
間）、 （ｉｉ）　１本ｇＤＮＡとプライマーとのアニーリング
工程（約り７℃〜約７０℃で、約３０秒間〜約３分間）
、および （ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（
約り５℃〜約８０℃で、約３０秒間〜約５分間）とから
なる、１サイクル毎にＤＮＡは２倍に増幅され、ｎサイ
クル後には２″′倍に増幅される。本発明においては、
前記の増幅サイクルを１０〜６０回、好ましくは２０〜
４０回繰り返す、最後のサイクルにおいては、工程（ｉ
ｉｉ）で加熱時間を約５〜１０分間に延長してＤＮＡ合
成が完全に行なわれるようにするのが好ましい。

被検試料中にミコバクテリア属に属する微生物、特にヒ
ト型結核菌、トリ型結核菌、Ｍ、イントラセルラーレま
たはＭ、カンサシ−のいずれかが存在すると、前記の増
幅サイクル終了後に、約５０〜１ｏｏｏｂｐのＤＮＡが
大量に合成される。このＤＮＡを次の制限酵素処理工程
によって処理する。

本発明方法の制限酵素処理工程では、前記の工程で増幅
されたＤＮＡを１種または複数種（特には、２種）のＩ
Ｉ型制限エンドヌクレアーゼによって処理する。増幅の
鋳型となるＤＮＡ部分は、ヒト型結核菌、トリ型結核菌
、Ｍ、イントラセルラーレまたはＭ、カンサシ−の種類
に応じて別異の塩基配列部分をそれぞれ有している。従
って、その別異の塩基配列部分を認識する特定の制限エ
ンドヌクレアーゼを用いると、鋳型ＤＮＡ　（即ち、増
幅されたＤＮＡ）の種類に応じて様々な態様の消化が行
なわれたり、あるいは消化が行なわれないことになる。

制限エンドヌクレアーゼとしては、前記の別異の塩基配
列部分を認識することのできるものであれば任意のもの
を用いることができるが、特には４塩基〜１４塩基（好
ましくは、６塩基）のパリンドロームを認識する制限エ
ンドヌクレアーゼを用いる。これらの制限エンドヌクレ
アーゼは、例えば、ＳｍａＩ、Ｎａｅ　Ｉ　、　Ａｃ　
ｃｌＩＩまたはＨｉｎｆＩである。前記の制限エンドヌ
クレアーゼを組み合わせて用いることができ、例えば、
ＳｍａＩとＮａｅ　Ｉとの組み合わせか好ましい、Ａｃ
ｃＩＩＩは、単独での使用が可能である。

本発明方法の制限酵素処理工程は、ＰＣＲ増幅工程によ
って得られた反応液に緩衝液を加え、更に前記の制限酵
素を添加し、酵素反応に適切な温度（例えば、２０〜４
０℃）にて、酵素による消化が充分に行なわれる時間（
例えば、３０分〜２時間）にわたって実施する。

こうして処理されたＤＮＡを含有する処理液をＤＮＡ分
画検査工程によって解析する。即ち、処理液中に含まれ
ているＤＮＡ分画の大きさから消化の態様を把握し、そ
の消化の態様から、処理前の増幅ＤＮＡ　（即ち、鋳型
ＤＮＡ）の種類を解析することができる。

ＤＮＡ分画検査工程としては、ゲル電気泳動およびエチ
ジウムブロマイド染色を利用する方法、ドツト・ハイブ
リダイゼーション法、またはジデオキシ法による塩基配
列決定法などを用いることができる、ゲル電気泳動を行
なう場合には、例えば、アガロースゲルを担′体とした
サブマリーン型電気泳動、またはアクリルアミドを用い
たスラブ型電気泳動を使用することができる。

ドツト・ハイブリダイゼーション法を行なう場合には、
非放射性プローブ（例えば、ビオチン化プローブまたは
化学発光物質でラベルしたプローブ）を用いることがで
きる。

更に、ジデオキシ法による塩基配列決定法を利用する場
合には、蛍光ラベルを使用したＤＮＡオートヒトクエン
サー（アプライドバイオシステムズ社）を用いることが
できる。

［実施例コ 以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

１ニプライマーの４ 第１のプライマー、即ち、 （５’　）−ＧＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣ
Ａ−（３’　）および、第２のプライマー、即ち、 （５’　）−ＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＴ
Ｔ−（３’　） の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、３８０Ａ−
ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステムズ社）によ
り、トリチル−オンの条件下で合成した。２７％アンモ
ニア水溶液でカラムから切り出し、５５℃で１晩加熱し
た。得られた溶液２ｍｌをイオン交換水１ｍｌで希釈し
、希釈液をＯＰＣ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｃｏｌｕｍｎ）カートリッ
ジ（アプライドバイオシステムズ社）に１〜２滴／秒の
速度で加えた。溶出液を希釈アンモニア水溶液５ｍｌで
３回、イオン交換水５ｍｌで２回、２％ＴＦＡ溶液５ｍ
ｌで２回、そして更にイオン交換水５ｍｌで２回洗浄し
た。吸着した１ヌクレオチドを２０％アセトニトリル溶
液１ｍｌで３回溶出して精製オリゴヌクレオチドを得た
。こうして得られた第１のプライマー（以下、プライマ
ー１と称する）および第２のプライマー（以下、プライ
マー２と称する）を用いて以下の例２および例４を実施
した。

２：　　　生　ＤＮＡの　百 （１）ヒト型結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ　ｉ　
ｓ　；ＡＴＣＣ２７２９４）　、）り型結核菌（Ｍ、　
ａｖｉｕｍ；ＡＴＣＣ１５７６９）、Ｍ。

イントラセルラーレ（Ｍ、１ｎｔｒａｃｅ−１１ｕｌａ
ｒｅ　；ＡＴＣＣ１５９８４）およびＭ。

カンサシ−（Ｍ、ｋａｎｓａｓ　ｉ　ｉ　；ＡＴＣＣＩ
２４７８）の各培養液からフェノールクロロホルムでＤ
ＮＡ抽出し、前記例１で調製したプライマーを用いて、
以下の反応液により増幅した。

５００μｌのエッペンドルフチューブ中で、以下の成分
からなる反応液１００μｍを調製した。

成分 液量　　　　　終濃度 ５３．５ 反応緩衝液 （１０倍濃度） １濃度度 各ｄＮＴＰ混合物　　　　１６　　　　　　２００μＭ
１．２５ｍＭ プライマー１　　　　　　５　　　　　　１．０μＭプ
ライマー２　　　　　　５　　　　　　１．０μＭ被検
体Ｄ　Ｎ　Ａ　　　　　　１０　　　　　　１ｎｇ／ａ
ｓｓａｙＴ　　ＤＮＡポリメラーゼ　０．５　　　　　
２．５Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ａｍｐ
ｌｉＴａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ（シータス社）を用
いた。

次に、反応液をミネラルオイル（Ｓ　ｉ　ｇｍａＣａｌ
　　Ｍ−３５１６）１００μｌで覆った。得られた試料
をＤＮＡ　　ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃ　１　ｅ　ｒ　（Ｐ
ｅ　ｒｋ　ｉ　ｎ−Ｅ　１ｍｅ　ｒＣｅｔｕｓ社）に入
れた。（ｉ）９４℃で１分間、（ｉｉ）６５℃で２分間
および（ｉｉｉ）７２℃で２分間の３工程からなる増幅
サイクルを３７回繰り返した。なお、３７回目の最後の
サイクルでは、工程（ｉｉｉ）を５分間行なった。

前記のＤＮＡ増幅操作によって得られた反応液各１０μ
ｌについて、エチジウムブロマイド（０，５μｇ／ｍｌ
）含有の２％アガロースゲルで電気泳動を実施した。結
果を第１図に示す。

第１図において、上段は微生物の種類を示し、右側の数
値（２３６）は塩基対の大きさを意味し、そして下段（
ｕｎｄｉｇｅｓｔｅｄ）は制限酵素を用いていないこと
を示すものである。第１図から明らかなように、４種の
抗酸菌のＤＮＡがすべて増幅され、２３６ｂｐにバンド
を示した。

（２）前記の例２（１）に記載の操作と同じ操作を繰り
返すが、但し、微生物としてウシ型結核菌（Ｍ、ｂｏｖ
ｉｓ　；ＡＴＣＣ１９２７４）、Ｍ。

フォートライタム（Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ；ＡＴＣＣ
１９５４２）、Ｍ、マリーナム（Ｍ。

ｍａｒｉｎｕｍ；ＡＴＣＣ９２７＞、およびＭ。

ガストリ（Ｍ、ｇａｓｔｒｉ　；ＡＴＣＣ１５７５４）
を用いた０例２の結果と同様に、４種の抗酸菌のＤＮＡ
がすべて増幅され、２３６ｂｐにバンドを示した。

３　：　　　　　　ＤＮＡの　　パターンの（１）前記
例２（１）で得られたＤＮＡ増幅反応液８μｌに希釈（
ｘｌｏ）緩衝液（５５ｍＭ−ＭｇＣｌ　２．７０ｍＭの
２−メルカプトエタノール）１μｌを加え、更に制限酵
素５ｎａｐ（ベーリンガー・マンハイム社）（１００７
μｍ）を添加して、３７℃で１時間放置した。得られた
処理液を例２（１）と同様の条件で電気泳動した。結果
を第２図に示す。

前記制限酵素ＳｍａＩに替えてＮａｅＩ（ベーリンガー
・マンハイム社）（ＩＯＵ／μｍ）を用いて同様に処理
し、処理液を電気泳動した。結果を第３図に示す。

第２図および第３図において、上段は微生物の種類を示
し、右側の数値（２３６など）は塩基対の大きさを意味
し、そして下段は使用した制限酵素の種類を示す。

第２図および第３図の結果をまとめると以下の第１表の
とおりである。

Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　＋　十Ｍ、ａｖｉｕｍ
　−十 Ｍ　、　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅＭ、ｋａｎｓａ
ｓｉｉ　十 以上のように、４種の抗酸菌ＤＮＡはそれぞれ別異の消
化パターンを示すので、各々を識別することができる。

（２）前記例３’（１）に記載の操作と同じ操作を繰り
返すが、但し、制限酵素としてＡｃｃｌＩＩ（宝酒造（
株））およびＨｉｎｆＩ（ベーリンガー・マンハイム社
）を使用した。結果を以下の第２表に示す。

（３）前記の例２（２）で得られたＤＮＡ増幅反応液を
用い、例３（１）および例３（２）と同様の操作を実施
した。結果を以下の第３表および第４表に示す。

Ｍ、　ｂｏｖｉｓ Ｍ　、　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ Ｍ、ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ、　　ａｓｔｒｉ ＋ ＋ ＋ Ｍ　、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｍ、ａｖｉｕｍ Ｍ　、　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅＭ、　ｋａｎｓ
ａｓｉｉ ＋ ＋ ＋ ＋ Ｍ、　ｂｏｖｉｓ Ｍ　、　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ Ｍ、ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ、　　　ｔｒｉ ＋ ４：　　：　にお番る　　　の （ｉ）本発明方法による検査 ヒト型結核菌、トリ型結核菌、Ｍ、イントラセルラーレ
およびＭ、カンサシ−の各感染患者から喀痰を採集し、
２％水酸化ナトリウム水溶液で液化し、遠心処理（２０
００Ｘｇ、１０分間）した。

得られたペレットを、１ｍＭ−ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ）
リス緩衝液（ｐＨ８，０）で洗浄し、１％ドデシル硫酸
ナトリウム含有１０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）５
００μｍに懸濁させ、フェノール／クロロホルムでＤＮ
Ａを抽出した。得られたＤＮＡを、酵母ｔＲＮＡ（１０
μｇ）の存在下に、エタノールで沈殿させた。得られた
沈殿を１０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）１００μｍ
に溶かし、その溶液１０μｍについて、前記例２に記載
のＤＮＡ増幅操作、ならびに前記例３に記載の制限酵素
処理およびＤＮＡ分画検査操作を行なった。

ｉｉ　　坪　゛による　査 比較する目的で、前記と同じ各臨床試料について、培養
法による検査を実施した。

前記と同じ喀痰を２倍量の４％水酸化ナトリウム水溶液
と室温で１５分間混合し、混合液１００μｌを１％小川
培地に接種し８週間３７℃で培養した。チール・ネール
ゼン（Ｚｉｅｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ）法で抗酸菌を選別し
抗酸菌をナイアシンテスト（ナイアシンテスト小林；小
林製薬製）により同定したところ、前記（ｉ）と同じ結
果が得られた。

［発明の効果］ 本発明方法によれば、被検試料における各種の抗酸菌の
存在および種類を、特異的に、高感度に、しかも迅速に
検出することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、４種の抗酸菌ＤＮＡ増幅の結果を示す説明図
であって、図面に代わる写真である。 第２図は、４種の抗酸菌ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで処
理した結果を示す説明図であって、図面に代わる写真で
ある。 第３図は、４種の抗酸菌ＤＮＡを制限酵素ＮａｅＩで処
理した結果を示す説明図であって、図面に代わる写真で
ある。 手続補正書く方式） １、事件の表示 平成２年特許願第１４２５８２号 ２、発明の名称 ミコバクテリア属微生物の検出方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　　株式会社ヤトロン ４、代理人 ５、補正命令の日付 ７、補正の内容 （１）　（イ）明細書の第１９頁において、第１行、第
２行および第５行に記載の「第１図」を各々ｒ第１図の
右側欄（ｕｎｄｉｇｅｓｔｅｄｌｌｌ）Ｊと訂正します
。 （ロ）同第２０頁において、第６行、第１１行および第
１５行に記載の「第２図」を各々ｒ第１図の中央欄（Ｓ
ｍａ１欄）１と訂正します。 （ハ）同第２０頁において、第１０行、第１１行および
第１５行に記載の「第３図」を各々「第１図の右側欄（
Ｎａｅｌ欄）」と訂正します。 （２）明細書第２４頁下から第８行〜末行の「第１図は
、・・・写真である。」を以下の通りに訂正します。 ｒ第１図は、４種の抗酸菌ＤＮＡ増幅の結果（左側！１
１）、４種の抗酸菌ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで処理し
た結果（中央欄）および４種の抗酸菌ＤＮＡを制限酵素
ＮａｅＩで処理した結果（右側欄）を示す説明図であっ
て、図面に代わる写真である。Ｊ （３）第１図、第２図および第３図を削除し、別紙のと
おり第１図を加入します。 ８、添付書類の目録

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 （５’）−ＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧ−（３’）で表される
   塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含有する第
   １のＤＮＡプライマーと、式（５’）−ＴＴＣＧＴＣＧ
   ＴＡＣ−（３’）で表される塩基配列からなるオリゴヌ
   クレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーと、
   ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検試料とを含む混合
   液をＤＮＡ増幅工程にかけ、得られた反応液を制限酵素
   処理工程にかけ、続いて、得られた処理液をＤＮＡ分画
   検査工程にかけることを特徴とする、ミコバクテリア（
   Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属に属する微生物の検出方
   法。