CN115418407A - 鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物，包括引物组和探针组，利用结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌以及利福平的耐药位点的特征性序列设计不同的引物和探针，再通过多重荧光PCR扩增即可快速得到检测结果。还公开了包含该组合物的试剂盒。本发明建立了可快速检测非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法，该方法操作简单，可快速得到检测结果，满足临床需求。

Description

鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法、试 剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
结核病(TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tubercμLosis complex，MTBC)引起的传染病，主要影响肺部。MTBC包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberc μLosis，MTB)、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，人肺结核的致病菌90％为结核分枝杆菌。非结核分枝杆菌(non-tuberc Lous mycobacteria，NTM)是分枝杆菌属内除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官，并可引起全身散播性疾病。
微生物培养是诊断结核病的金标准，涂片镜检则是用于结核病诊断的重要检测之一。AFB(Acid Fast Bacteria Stain，抗酸染色)涂片显微镜虽然快速且便宜，但由于假阳性原因(例如样品中存在NTM)而使其敏感性不高；培养方法则需要2-6周才能产生结核病的诊断结果。与结核病不同，用于诊断NTM疾病、区分MTBC和NTM 以及区分NTM物种的方法是复杂且不发达的。
NTM病与TB病具有相似的临床表现，临床上快速鉴别MTBC和NTM的具体种属存在一定的困难。因此开发一种快速检测且能够有效鉴别MTBC和NTM快速生长型和缓慢生长型的检测产品和检测方法对疾病早期诊断和及时治疗具有极为重要的意义。1998年，随着MTB标准菌株H37Rv全基因组序列的破译，人们对结核菌的研究从表型深入到基因水平，MTB对一线药物的分子耐药机制成为国内外研究的热点，研究者发现MTB耐药性的产生主要与相关基因发生突变有关。一线药物中，利福平(RIF)耐药机制阐释的较为完全，研究发现约95％的RIF耐药性产生与MTB 编码RNA聚合酶β亚基基因(即rpoB基因)特定区域发生突变有关。
目前结核菌常用的诊断方法有括结核菌素试验、细胞免疫介导的结核菌γ干扰素释放试验、标本直接涂片或集菌后涂片检测、病原菌分离培养、基因芯片法、反向杂交法、DNA测序法等，但存在操作步骤繁杂、对人员技术水平要求较高，设备昂贵，无法检测所有突变区域等缺点。因此，本领域亟需开发一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、可用于结核分枝杆菌的检测以及耐药位点的检测，则可大幅度提高检测效率，帮助临床及早确定治疗方案。
发明内容
本发明旨在解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的试剂盒、检测方法及其应用。为了满足对具有更广泛识别范围的简单快速分子检测的需求，可以简单快速识别临床中常见的致病性分枝杆菌，以及是否含有利福平的耐药位点，进而为临床诊断和治疗提供帮助。
本发明的第一个方面，提供了一种检测非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的多重荧光PCR引物组，所述非结核分枝杆菌包括缓慢生长型(包括鸟分枝杆菌复合群和堪萨斯分枝杆菌)和快速生长型(包括脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌)。
本发明的第一个方面，提供了一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物，包括引物组和探针组，所述引物组包括：
NTM引物：
NTM-F：5’-GGAAGTYGCCAAGAAGACYGAC-3’
NTM-R：5’-CTTSAGACCCAKCGGGTT-3’
MTBC引物：
MTBC-F：5’-CAGGACCACGATCGCTGA-3’
MTBC-R：5’-TAGGTGCTGGTGGTCCGA-3
人源基因引物：
IC-F：5’-CGGAGGGAAGCTCATCAG-3’
IC-R：5’-CCCTAGTCTCAGACCTTCCCA-3’；
rpoB基因引物：
rpoB-F:CAGACGTTGATCAACATCCG
rpoB-R：TACGGCGTTTCGATGAAC
所述探针组包括：
龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌群：
NTM-fast-P：5’-CRGCGACGTTACGCAGACCTTCC-3’
鸟分枝杆菌复合群：
NTM-slow-P1：5’-CCGTGGCCGTCGTCGTGC-3’
堪萨斯分枝杆菌：
NTM-slow-P2：5’-CYGGCGACGGCACCACCACG-3’
结核分枝杆菌复合群：
MTBC-P：5’-CACAGCCCGTCCCGCCGA-3’
人源基因：
IC-P探针：5’-CCACGAGCTGAGTGCGTCCTGTC-3；
rpoB基因内参的引物和探针：
rpoB-F:CAGACGTTGATCAACATCCG
rpoB-R：TACGGCGTTTCGATGAAC
其中以靶向rpoB的引物为通用引物，分别设计利福平耐药决定区的516位点的探针、526位点的探针、531位点的探针，分别采用不同荧光修饰。其中下划线位置为锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)，增强探针特异性。
其中，516位点存在2种突变型，分别为GTC、TAC，526位点存在4种突变型，分别为TAC、GAC、CGC、TGC，531位点存在2种突变型，分别为TGG、TTG。
靶向所述516位点探针的核酸序列为：
rpoB-P1-516：TGGACCAGAACAACC
靶向所述526位点探针的核酸序列为：
rpoB-P2-526：ACCCACAAGCGCC
靶向所述531位点探针的核酸序列为：
rpoB-P3-531：CCAGCGCCGACAG
其中N代表碱基A/T/C/G，Y代表碱基C/T，S代表碱基G/C，K代表碱基G/T， R代表碱基A/G；下划线位置为LNA
引物组中添加人源基因为内部控制，作为试剂及实验流程的质量保证；探针组中每条探针的序列两端标记有荧光基团和淬灭基团，设置合理在进行检测时不会产生干扰，且IC-P探针、MTBC-P、NTM-fast-P、rpoB-P1-516、rpoB-P2-526、rpoB-P3-531 使用不同颜色的荧光基团，NTM-slow-P1、NTM-slow-P2使用的荧光基团颜色不同于前述IC-P探针、MTBC-P、NTM-fast-P；
所述非结核分枝杆菌包括缓慢生长型(包括鸟分枝杆菌复合群和堪萨斯分枝杆菌) 和快速生长型(包括脓肿分枝杆菌群和龟分枝杆菌)，通过NTM不同菌种的序列比对，发现鸟分枝杆菌复合群(鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)内序列相近，脓肿分枝杆菌群复合群(脓肿分枝杆菌群、马赛分枝杆菌、博莱分枝杆菌)内序列相近。如果不考虑区分菌种，序列相近的种可以使用同一套引物、探针，这样可以把引物和探针数缩减。
在本发明的一些优选实施方式中，所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX、CY5；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2。
在本发明的一些优选实施方式中，所述NTM-fast-P的荧光基团选用HEX，所述MTBC-P的荧光基团选用FAM，所述NTM-slow-P1、NTM-slow-P2的荧光基团选用 ROX，所述IC-P探针的荧光基团选用CY5；所述516位点的探针使用第一种荧光通道FAM，526位点的探针使用第二种荧光通道HEX，531位点的探针统一使用第三种荧光通道ROX，IC(人源基因)使用第四种荧光通道CY5。
本发明的第二个方面，提供了一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的试剂盒，包括上述的组合物。
在本发明的一些优选实施方式中，所述的试剂盒包括A、B两种反应体系，其中 A体系包括分枝杆菌反应液1、无酶水、酶预混液、阳性质控品1和阴性对照；B体系包括分枝杆菌反应液2、无酶水、酶预混液、阳性质控品2和阴性对照，分枝杆菌反应液1含有上述的NTM引物和探针、MTBC引物和探针及人源的引物组和探针组，分枝杆菌反应液2含有上述的rpoB基因内参的引物、rpoB基因探针、人源的引物组和探针组。
在本发明的一些优选实施方式中，所述的试剂盒中的分枝杆菌反应液1含有权利要求1所述的NTM、MTBC及人源的引物组和探针组，分枝杆菌反应液2含有权利要求1所述的rpoB基因内参、靶向位点及人源的引物组和探针组。
在本发明的一些优选实施方式中，所述的试剂盒中的酶预混液，引入了 dUTP/UDG防污染系统，可消除扩增产物污染对qPCR的影响，购自诺唯赞生物科技有限公司；阴性对照由无酶水制成或DNA提取液，阳性质控品1运用多片段重组方式构建成质粒载体，在LB培养基中培育得到具有阳性表达质粒的菌液，通过QPCR检测和定量稀释从而获得结核及非结核阳性表达质粒，制成阳性质控品；阳性质控品2 为结核分枝杆菌(利福平敏感型)标准质粒。
本发明的第三个方面，提供了一种本发明第一方面所述的引物组和探针组及本发明的第二方面所述的试剂盒的应用。
根据本发明第三个方面在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂盒的使用具体包括以下步骤：
1)提取待测样品中的DNA；
2)以提取的DNA为模板，使用本发明的第二个方面所述的检测试剂盒进行PCR 扩增，得到扩增产物；
3)结果判定：对扩增产物进行扩增曲线分析，根据实际扩增曲线的CT值，判定待测样本中是否具有相应的结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌及相关利福平耐药位点：其中所述非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌群、龟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述分枝杆菌反应液1的体系为：
Figure BDA0003875575390000051
Figure BDA0003875575390000061
在本发明的一些优选的实施方式中，所述分枝杆菌反应液2的体系为：
组分名称 终浓度 体积(μL/人份)
rpoB-F 100μM 0.6
rpoB-R 100μM 0.6
rpoB-P1-516 100μM 0.6
rpoB-P2-526 100μM 0.6
rpoB-P3-531 100μM 0.6
IC-F 100μM 0.4
IC-R 100μM 0.4
IC-P 100μM 0.2
合计 / 4
在本发明的一些实施方式中，所述A反应体系包括：
试剂 体积(μL)
分枝杆菌反应液1 5.5
酶预混液 20
无酶水 8.5
DNA/阳性质控/阴性对照 6
合计 40
在本发明的一些实施方式中，所述B反应体系包括：
试剂 体积(μL)
分枝杆菌反应液2 4
酶预混液 10.4
无酶水 5.6
DNA/阳性质控/阴性对照 5
合计 25
在本发明的一些优选的实施方式中，多重荧光PCR扩增反应的程序为：
Figure BDA0003875575390000071
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤3)中所述的结果判定的方法为：
(1)前提条件：阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，也可按照软件自定义的阈值。阳性对照CT值＜38，阴性对照为阴性或CT值＞40，且内标ct＜38，否则实验无效。
(2)A体系：
若FAM通道检测出现显著扩增且CT值＜38，表示结核分枝杆菌复合群结果为阳性；
若HEX通道检测出现显著扩增且CT值＜38，表示龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌检测结果为阳性；
若ROX通道检测出现显著扩增且CT值＜38，表示鸟分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌检测结果为阳性；
若FAM/HEX/ROX通道CT值＞40或无扩增信号，表示结核/非结核快型/非结核慢型为阴性；
若FAM/HEX/ROX通道38＜CT值＜40时，重做实验的结果出现显著扩增且 CT值＜40，相应荧光通道对应的病原判读为阳性，否则为阴性。
B体系：
若FAM/HEX/ROX通道出现显著扩增且ct＜38，表示结核分枝杆菌利福平 516/526/531位点无突变；
若HEX/ROX通道出现显著扩增且ct＜38，FAM通道检测为阴性，表示结核分枝杆菌利福平516位点突变；
若FAM/ROX通道出现显著扩增且ct＜38，HEX通道检测为阴性，表示结核分枝杆菌利福平526位点突变；
若FAM/HEX通道出现显著扩增且ct＜38，ROX通道检测为阴性，表示结核分枝杆菌利福平531位点突变；
本发明具有以下有益效果：
1、本发明建立了可快速检测非结核、结核分枝杆菌及结核分枝杆菌利福平耐药型的检测方法，该方法操作简单，可快速得到检测结果。
2.本发明中多重荧光PCR检测过程中均为闭管反应，降低了污染，本发明中的方法含有人源内标，保证了试剂盒扩增过程中的有效性，保证了结果的真实性。
3.本发明中的检测方法具有较高的灵敏度和精密度。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
实施例一种鉴别诊断非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的试剂盒、检测方法及其应用
1.核酸提取
取1例已知结核及非结核快型均为阳性的样本和2例结核阳性且利福平耐药的样本进行核酸提取。
2.试剂配制
按下表分别配制A、B两个反应体系，且进行三次平行实验：
A体系为：
试剂 体积(μL)
分枝杆菌反应液1 5.5
酶预混液 20
无酶水 8.5
DNA/阳性质控/阴性对照 6
合计 40
B体系为：
Figure BDA0003875575390000091
3.按下表的步骤进行Q-PCR扩增。
Figure BDA0003875575390000101
对照例
提取后的核酸采用天隆结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，型号P121进行三次平行测试。对比实施例和对照例的结果CT值，结果如表1所示：
表1：样本结果CT值对比(A反应)
Figure BDA0003875575390000102
B反应：
Figure BDA0003875575390000103
从表1结果可以看出，本鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的试剂盒、检测方法及其应用，实现了对结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tubercμLosiscomplex，MTBC)与非结核分枝杆菌(non-tuberc Lous mycobacteria，NTM)缓慢生长型(包括鸟分枝杆菌复合群和堪萨斯分枝杆菌)和快速生长型(包括脓肿分枝杆菌群和龟分枝杆菌)以及结核利福平耐药性的快速和准确的检测和鉴别，且灵敏度、真实性高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物，包括引物组和探针组，所述引物组包括：
NTM引物：
NTM-F：5’-GGAAGTYGCCAAGAAGACYGAC-3’
NTM-R：5’-CTTSAGACCCAKCGGGTT-3’
MTBC引物：
MTBC-F：5’-CAGGACCACGATCGCTGA-3’
MTBC-R：5’-TAGGTGCTGGTGGTCCGA-3
人源基因引物：
IC-F：5’-CGGAGGGAAGCTCATCAG-3’
IC-R：5’-CCCTAGTCTCAGACCTTCCCA-3’；
所述探针组包括：
NTM-fast-P：5’-CRGCGACGTTACGCAGACCTTCC-3’
NTM-slow-P1：5’-CCGTGGCCGTCGTCGTGC-3’
NTM-slow-P2：5’-CYGGCGACGGCACCACCACG-3’
MTBC-P：5’-CACAGCCCGTCCCGCCGA-3’
IC-P探针：5’-CCACGAGCTGAGTGCGTCCTGTC-3；
还包括rpoB基因内参的引物：
rpoB-F:CAGACGTTGATCAACATCCG
rpoB-R：TACGGCGTTTCGATGAAC
还包括rpoB基因探针：
rpoB-P1-516：TGGACCAGAACAACC
rpoB-P2-526：ACCCACAAGCGCC
rpoB-P3-531：CCAGCGCCGACAG
其中N代表碱基A/T/C/G，Y代表碱基C/T，S代表碱基G/C，K代表碱基G/T，R代表碱基A/G；
其中探针组中每条探针的序列两端标记有荧光基团和淬灭基团，且IC-P探针、MTBC-P、NTM-fast-P使用不同颜色的荧光基团，NTM-slow-P1、NTM-slow-P2使用的荧光基团颜色不同于前述IC-P探针、MTBC-P、NTM-fast-P。
2.根据权利要求1所述的鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物，其特征在于：所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX、CY5；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2。
3.根据权利要求2所述的鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物，其特征在于：所述NTM-fast-P的荧光基团选用HEX，所述MTBC-P的荧光基团选用FAM，所述NTM-slow-P1、NTM-slow-P2的荧光基团选用ROX，所述IC-P探针的荧光基团选用CY5；所述rpoB-P1-516探针的两端分别修饰FAM基团和BHQ1基团，所述rpoB-P2-526探针的两端分别修饰HEX基团和BHQ1基团，所述rpoB-P3-531探针的两端分别修饰ROX基团和BHQ2基团。
4.一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的试剂盒，其特征在于含有权利要求1-3中任一项所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括A、B两种反应体系，其中A体系包括分枝杆菌反应液1、无酶水、酶预混液、阳性质控品1和阴性对照；B体系包括分枝杆菌反应液2、无酶水、酶预混液、阳性质控品2和阴性对照，分枝杆菌反应液1含有权利要求1-3中任一项所述的NTM引物和探针、MTBC引物和探针及人源的引物组和探针组，分枝杆菌反应液2含有权利要求1-3中任一项所述的rpoB基因内参的引物、rpoB基因探针、人源的引物组和探针组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中的酶预混液引入了dUTP/UDG防污染系统；阴性对照为无酶水或DNA提取液，阳性质控品1运用多片段重组方式构建成质粒载体，在LB培养基中培育得到具有阳性表达质粒的菌液，通过QPCR检测和定量稀释从而获得结核及非结核阳性表达质粒，制成阳性质控品1；阳性质控品2为利福平敏感型结核分枝杆菌标准质粒。
7.权利要求1-3中任一项所述的组合物在鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性中的应用。
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