CN106868113A - 用于鉴定牛型结核分枝杆菌的snp标记及其应用 - Google Patents

用于鉴定牛型结核分枝杆菌的snp标记及其应用 Download PDF

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蒋毅
刘海灿
李马超
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Abstract

本发明提供一种用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记及其应用，所述SNP标记位于牛型结核分枝杆菌PstS基因上，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，该序列第53位碱基C为SNP突变位点。在此SNP标记基础上建立了一套高效、灵敏、特异度高的检测牛型结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR方法。本发明的检测方法可用于结核病的辅助诊断，流行病学监测与感染筛查等相关领域。

Description

用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记及其应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患慢性消耗性传染病。根据世界卫生组织的统计，目前全球有超过1/3的人口感染了结核分枝杆菌，每年有200万人因结核病死亡。结核分枝杆菌除感染人外，还感染50多种哺乳动物和20多种禽类；在家畜中，牛最易感染牛型结核分枝杆菌而发生结核病，特别是奶牛，其次是水牛和黄牛，不但影响养殖业的发展，造成经济损失，而使人畜健康受到严重威胁。结核病是全球重要的公共卫生问题，在一些发达国家如德国、澳大利亚等国的人结核病患者中，约0.2％～0.3％是由牛型结核分枝杆菌引起的，而在埃塞俄比亚、尼日利亚、坦桑尼亚等不发达国家中，这个比例高达17.0％一26.1％。由此可见，控制牛结核病不仅对于动物疫病防治，还是对人健康，都具有重大的公共卫生学意义。
结核病的早期诊断对结核病的控制至关重要，而结核病防治的最大挑战之一就是缺乏早期、快速、敏感和特异的诊断工具。目前分枝杆菌菌种的鉴定，传统的分类、鉴定系统主要以形态和生理生化特征的综合指标为依据，易受多种因素影响，鉴定结果极不可靠，存在着很大的异质性，鉴定一种菌种耗时长约4周，还不包括培养所需时间4-8周，因此有较大局限性。如PNB、TCH鉴别培养基进行菌种鉴定，虽然已被常规应用，但其为临床提供信息缓慢，而且鉴定出的菌种有一定局限性，只能区分出结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，不能进一步进行种的鉴定。
目前，应用分子生物学技术鉴定分枝杆菌菌种不仅快速可靠，而且具有成本低廉，可建立标准化操作程序的优点，成为快速鉴定分枝杆菌的新方法。基于牛型分枝杆菌PstS基因的特异性突变位点的分子生物学检测技术，高效、灵敏、特异度高，用于检测牛型结核分枝杆菌，可以将牛型结核分枝杆菌与其它分枝杆菌区分开。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记，所述SNP标记位于牛型结核分枝杆菌PstS基因上，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，该序列第53位碱基C为SNP突变位点。利用该特异性突变位点将牛型分枝杆菌从分枝杆菌中分离出来。
本发明所述牛型结核分枝杆菌PstS基因的部分核苷酸序列如SEQID No:2所示。
本发明还提供用于实时荧光定量PCR检测所述SNP标记的引物及探针，上游引物：5'-TTTCTGCACTGGGCGATCA-3'，下游引物：5'-CAACGCGTCAGACAACTTCAC-3'。探针：5'-FAM-ACCAGGCTCATTTC-MGB-3'。
本发明还提供含有所述引物及探针的实时荧光定量PCR检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供所述引物及探针或所述试剂盒在鉴定牛型结核分枝杆菌中的应用。
包括以下步骤：
1)提取待测样品的DNA；
2)以上述提取的DNA为模板，利用所述引物及探针，进行实时荧光定量PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物。
其中，步骤2)中实时荧光定量PCR扩增反应体系：2×Premix Ex Taq(TaKaRaDRR390)10μl，上、下游引物及探针的终浓度为250nmol/L，DNA模板2μl，去离子水加至总量为20μl。
实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，59.3℃退火60s，共40个循环。
实时荧光定量PCR所用的仪器为BIO RAD MJ MiniOpticon。
步骤3)根据是否出现扩增曲线，分析是否含有牛型结核分枝杆菌；含有牛型结核分枝杆菌的待测样品会出现扩增曲线，表现为阳性结果；不含有牛型结核分枝杆菌的待测样品不出现扩增曲线，表现为阴性结果。
本发明基于荧光定量PCR原理，提供一种检测特异性碱基突变位点的实时荧光定量PCR方法。基本原理为：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个猝灭荧光基团。探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被猝灭荧光基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光集团分离，从而荧光监测系统可以接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，即当有目的片段存在时，就会发生扩增反应，并通过荧光信号检测到。
本方法适用于体外检测牛型结核分枝杆菌感染。人或动物在感染了牛型结核分枝杆菌后，可通过检测相应预处理的标本微量基因的方法，确认感染成立。检测标本包括痰，组织，核酸等。
本发明在现有荧光定量PCR技术的基础上，应用牛型结核分枝杆菌的特异性碱基突变位点，建立检测牛型结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR方法，并结合spoligotyping，多位点序列分析等方法对牛型结核分枝杆菌和其他分枝杆菌进行鉴定，从而评价基于该碱基突变位点建立起来的用于检测牛型结核分枝杆菌荧光定量PCR方法的灵敏度和特异度。
本发明建立了一种高效、灵敏、特异度高的用于检测牛型结核分枝杆菌的荧光定量PCR方法。基于本发明的检测方法可用于结核病的辅助诊断，流行病学监测与感染筛查等相关领域。具有优点如下：
(一)本发明采用的碱基突变位点特异性高，能够特异性地将牛型分枝杆菌与其他分枝杆菌区分开来。
(二)本发明与荧光定量PCR方法相结合，即标本中有微弱的细菌存在即能被检测到，因此灵敏度高。
(三)通过批间、批内实验检测，实时荧光定量PCR方法重复性较好，有利于质量控制，且成本较低，适合大规模商业化生产及检测。
附图说明
图1为本发明实施例3中利用实时荧光定量PCR方法检测牛型分枝杆菌的特异度结果；其中，牛型结核分枝杆菌标准株及卡介苗菌株出现阳性扩增曲线，表现为阳性结果，其他19种分枝杆菌标准株未出现阳性扩增曲线，表现为阴性结果。
图2为本发明实施例3中利用实时荧光定量PCR方法检测牛型分枝杆菌的灵敏度结果；其中，A：利用实时荧光定量PCR方法检测牛型分枝杆菌DNA灵敏度结果，DNA浓度范围为1.0×107～1.0×100copies/μl，B：所建立的标准曲线。
图3为本发明实施例3中利用实时荧光定量PCR方法检测牛型分枝杆菌模拟样本的灵敏度结果；其中，A：灵敏度检测结果，浓度范围为1.0×108～1.0×100cell/ml，B：所建立的标准曲线。
图4为本发明实施例1中人型结核分枝杆菌与牛型结核分枝杆菌PstS基因部分序列比对结果；其中，*号上方序列来自人型结核分枝杆菌，*号下方序列来自牛型结核分枝杆菌,*表示相同碱基。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1牛型结核分枝杆菌SNP标记的开发及特异性探针、引物的设计与合成
根据牛型结核分枝杆菌的特异性碱基突变位点及所在DNA序列，利用软件ABIprimer Express 2.0设计引物及探针，由北京天一辉远公司合成MGB标记的探针及普通PCR扩增所用引物。
本发明的牛型结核分枝杆菌SNP标记位于牛型结核分枝杆菌PstS基因上，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，该序列第53位碱基C为SNP突变位点。利用该特异性突变位点将牛型分枝杆菌从分枝杆菌中分离出来。
人型结核分枝杆菌与牛型结核分枝杆菌PstS基因部分序列比对结果见图4。
根据该特异性突变位点设计出用于实时荧光定量PCR检测所述SNP标记的引物及探针。
上游引物：5'-TTTCTGCACTGGGCGATCA-3'
下游引物：5'-CAACGCGTCAGACAACTTCAC-3'
探针：5'-(FAM)ACCAGGCTCATTTC(MGB)-3'
实施例2牛型结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立
试剂组成如下：
(1)基于PstS基因的特异性突变点设计的特异性MGB标记探针及引物；
(2)扩增反应所需的酶，即2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)；
(3)去离子水；
(4)实时荧光定量PCR所用的仪器，即BIO RAD MJ MiniOpticon。
20μl反应总体系包括2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，终浓度为250nmol/L上、下游引物及探针，待测核酸样品2μl，去离子水加至总量20μl。
实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，59.3℃退火60s，共40个循环。
实施例3实时荧光定量PCR检测方法的特异性及灵敏度评价
1、特异性检测
分别取牛型结核分枝杆菌标准株，卡介苗(BCG)，结核分枝杆菌标准株H37RV，非结核分枝杆菌标准株(常见致病菌瘰疬分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，胞内分枝杆菌，脓肿分枝杆菌，鸟分枝杆菌，偶发分枝杆菌，苏尔加分枝杆菌，龟分枝杆菌，蟾蜍分枝杆菌，施氏分枝杆菌，猿猴分枝杆菌，亚洲分枝杆菌，非洲分枝杆菌，戈登分枝杆菌，M.wolinskyi，M.peregrinum，M.diernhoferi，M.malmoense)共21种菌，采用水煮法提取相应基因组核酸存于-20℃冰箱备用。
20μl反应总体系包括2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，终浓度为250nmol/L上、下游引物及探针，待测核酸样品2μl，去离子水加至总量20μl。
实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，59.3℃退火60s，共40个循环。
实验结果，除了牛型分枝杆菌标准株及BCG采用该方法结果为阳性，其余菌株都表现为阴性，该方法显示出良好的特异性。(图1)
2、灵敏度检测
2.1构建质粒评估所述方法的灵敏度
将含有目的片段(SEQ ID No:1)的PCR产物链接到pMD-19T载体上，将重组体转化到大肠杆菌DH-5α上并37℃过夜培养，使用天根中提质粒试剂盒提取含有目的片段的质粒，并通过测序验证目的片段，然后测量质粒浓度并换算为拷贝数，并倍比稀释质粒拷贝数形成以下梯度1.0×107～1.0×100copies/μl。
20μl反应总体系包括2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，终浓度为250nmol/L上、下游引物及探针，待测核酸样品2μl，去离子水加至总量20μl。
实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，59.3℃退火60s，共40个循环。
实验结果，以上述的梯度浓度质粒为模板，检测该方法能够检测DNA的最低限，结果显示最低限为1.0×101copies/μl，表明该方法灵敏度高。(图2A和B)
质量控制评估：
(1)批内实验，同时做三组不同浓度梯度的平行实验，观察Ct值差异情况。(表1)
表1批内实验ct值及变异系数分析
(2)批间实验，不同时期做三组不同浓度梯度的平行实验，观察Ct值差异情况。(表2)
表2批间实验ct值及变异系数分析
批间批内实验结果表明，变异系数范围分别为0.38-3.65，0.09-2.44，表现出良好的重复性。
2.2模拟样本灵敏度检测
将牛型结核分枝杆菌培养物磨菌比浊到1个麦氏浓度(对应的细菌数为3.0×108cell/ml)，并分别稀释到以下梯度浓度(1.0×108～1.0×100cell/ml)，然后80℃灭活以上梯度标本，100℃沸水浴提取基因组，采用上述方法，检测模拟样本最低限。结果显示模拟样本最低检测限为1.0×101cell/ml，显示良好的敏感度。(图3A和B)
实施例4实时荧光定量PCR检测方法用于检测临床样本
选取经spoligotyping分析结果验证为牛型结核分枝杆菌或BCG菌株共27株进行验证，该27株菌采用上述荧光定量PCR方法检测结果为阳性；选取经spoligotyping分析结果验证为北京家族，T家族，U家族，MANU家族等共12种家族26株人型结核分枝杆菌临床株进行验证，结果为阴性；选取经多位点序列分析(MLSA)结果验证为胞内分枝杆菌，脓肿分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌等6种16株非结核分枝杆菌临床菌株进行验证，结果为阴性。表明上述建立的方法具有良好的特异性。
以上结果表明，本发明构建的用于鉴定牛型分枝杆菌的实时荧光定量PCR方法，最低DNA检测限为1.0×101copies/μl，最低模拟样本检测限为1.0×101cell/ml，显示出良好的敏感度。根据DNA检测灵敏度所建立的标准曲线，相关系数为0.997，斜率-3.144，表明线性关系较好。此外模拟样本较DNA线性关系差，可以理解，因为菌液相比于纯基因组中存在一些干扰杂质，影响线性关系。
经临床菌株验证，除牛型分枝杆菌及卡介苗菌株采用上述方法显示阳性，其余分枝杆菌均为阴性，显示良好的特异性。
批间批内实验，可见变异系数范围分别为0.38-3.65，0.09-2.44，表现出良好的重复性，有利于质量控制。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记及其应用
<130> KHP171110553.4
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 102
<212> DNA
<213> 牛型结核分枝杆菌
<400> 1
tttctgcact gggcgatcac cgacggcaac aaggcctcgt tcctcgacca ggctcatttc 60
cagccgctgc cgcccgcggt ggtgaagttg tctgacgcgt tg 102
<210> 2
<211> 1125
<212> DNA
<213> 牛型结核分枝杆菌
<400> 2
gtgaaaattc gtttgcatac gctgttggcc gtgttgaccg ctgcgccgct gctgctagca 60
gcggcgggct gtggctcgaa accaccgagc ggttcgcctg aaacgggcgc cggcgccggt 120
actgtcgcga ctacccccgc gtcgtcgccg gtgacgttgg cggagaccgg tagcacgctg 180
ctctacccgc tgttcaacct gtggggtccg gcctttcacg agaggtatcc gaacgtcacg 240
atcaccgctc agggcaccgg ttctggtgcc gggatcgcgc aggccgccgc cgggacggtc 300
aacattgggg cctccgacgc ctatctgtcg gaaggtgata tggccgcgca caaggggctg 360
atgaacatcg cgctagccat ctccgctcag caggtcaact acaacctgcc cggagtgagc 420
gagcacctca agctgaacgg aaaagtcctg gcggccatgt accagggcac catcaaaacc 480
tgggacgacc cgcagatcgc tgcgctcaac cccggcgtga acctgcccgg caccgcggta 540
gttccgctgc accgctccga cgggtccggt gacaccttct tgttcaccca gtacctgtcc 600
aagcaagatc ccgagggctg gggcaagtcg cccggcttcg gcaccaccgt cgacttcccg 660
gcggtgccgg gtgcgctggg tgagaacggc aacggcggca tggtgaccgg ttgcgccgag 720
acaccgggct gcgtggccta tatcggcatc agcttcctcg accaggccag tcaacgggga 780
ctcggcgagg cccaactagg caatagctct ggcaatttct tgttgcccga cgcgcaaagc 840
attcaggccg cggcggctgg cttcgcatcg aaaaccccgg cgaaccaggc gatttcgatg 900
atcgacgggc ccgccccgga cggctacccg atcatcaact acgagtacgc catcgtcaac 960
aaccggcaaa aggacgccgc caccgcgcag accttgcagg catttctgca ctgggcgatc 1020
accgacggca acaaggcctc gttcctcgac caggctcatt tccagccgct gccgcccgcg 1080
gtggtgaagt tgtctgacgc gttgatcgcg acgatttcca gctag 1125
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttctgcact gggcgatca 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caacgcgtca gacaacttca c 21
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
accaggctca tttc 14

Claims (8)

1.用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于牛型结核分枝杆菌PstS基因上，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，该序列第53位碱基C为SNP突变位点。
2.用于实时荧光定量PCR检测权利要求1所述SNP标记的引物及探针，其特征在于，上游引物：5'-TTTCTGCACTGGGCGATCA-3'，下游引物：5'-CAACGCGTCAGACAACTTCAC-3'，探针：5'-FAM-ACCAGGCTCATTTC-MGB-3'。
3.含有权利要求2所述引物及探针的实时荧光定量PCR检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求2所述引物及探针或权利要求3或4所述试剂盒在鉴定牛型结核分枝杆菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品的DNA；
2)以上述提取的DNA为模板，利用所述引物及探针，进行实时荧光定量PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中实时荧光定量PCR扩增反应体系：2×Premix Ex Taq 10μl，上、下游引物及探针的终浓度为250nmol/L，DNA模板2μl，去离子水加至总量为20μl；
实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，59.3℃退火60s，共40个循环。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤3)根据是否出现扩增曲线，分析是否含有牛型结核分枝杆菌；含有牛型结核分枝杆菌的待测样品会出现扩增曲线，表现为阳性结果；不含有牛型结核分枝杆菌的待测样品不出现扩增曲线，表现为阴性结果。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111020043A (zh) * 2020-01-10 2020-04-17 上海润达榕嘉生物科技有限公司 一种mtb的检测引物及其试剂盒
CN111088401A (zh) * 2020-01-10 2020-05-01 上海润达榕嘉生物科技有限公司 一种多病毒检测引物及其试剂盒
CN114277162A (zh) * 2021-11-06 2022-04-05 江汉大学 一种结核分枝杆菌的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1478777A2 (en) * 2002-02-25 2004-11-24 Institut Pasteur Sequences specifically deleted from mycobacterium tuberculosis genome and their use in diagnosistics and as vaccines
WO2009087688A3 (en) * 2008-01-04 2009-10-15 Premas Biotech Pvt.Ltd Method for detection of nucleic acid of mycobacterium and uses thereof
CN104561339A (zh) * 2015-01-22 2015-04-29 首都医科大学附属北京胸科医院 一种检测来源于结核分枝杆菌的待测dna分子中snp位点的试剂盒
CN104630365A (zh) * 2015-02-09 2015-05-20 云南农业大学 一种检测奶牛结核易感性的检测标靶及引物
CN105483214A (zh) * 2015-11-24 2016-04-13 北京博瑞立安生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1478777A2 (en) * 2002-02-25 2004-11-24 Institut Pasteur Sequences specifically deleted from mycobacterium tuberculosis genome and their use in diagnosistics and as vaccines
WO2009087688A3 (en) * 2008-01-04 2009-10-15 Premas Biotech Pvt.Ltd Method for detection of nucleic acid of mycobacterium and uses thereof
CN104561339A (zh) * 2015-01-22 2015-04-29 首都医科大学附属北京胸科医院 一种检测来源于结核分枝杆菌的待测dna分子中snp位点的试剂盒
CN104630365A (zh) * 2015-02-09 2015-05-20 云南农业大学 一种检测奶牛结核易感性的检测标靶及引物
CN105483214A (zh) * 2015-11-24 2016-04-13 北京博瑞立安生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARCIA PELAYO MC等: "A Comprehensive Survey of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) across Mycobacterium bovis Strains and M. bovis BCG Vaccine Strains Refines the Genealogy and Defines a Minimal Set of SNPs That Separate Virulent M. bovis Strains and M. bovis BCG Strains", 《INFECT IMMUN》 *
LIU H等: "pstS1 polymorphisms of Mycobacterium tuberculosis strains may reflect ongoing immune evasion", 《TUBERCULOSIS (EDINB)》 *
REHREN G等: "Differential gene expression between Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis", 《TUBERCULOSIS (EDINB)》 *
刘海灿等: "中国结核分枝杆菌复合群菌株pstS1基因中人T/B细胞表位多态性分析", 《疾病监测》 *
周晶等: "牛结核分枝杆菌PstS3基因克隆与序列分析", 《宁夏大学学报(自然科学版)》 *
王春雨: "结核杆菌Taqman PCR检测方法建立及吉林省鹿结核杆菌MLVA分型研究", 《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111020043A (zh) * 2020-01-10 2020-04-17 上海润达榕嘉生物科技有限公司 一种mtb的检测引物及其试剂盒
CN111088401A (zh) * 2020-01-10 2020-05-01 上海润达榕嘉生物科技有限公司 一种多病毒检测引物及其试剂盒
CN114277162A (zh) * 2021-11-06 2022-04-05 江汉大学 一种结核分枝杆菌的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用
CN114277162B (zh) * 2021-11-06 2023-09-08 江汉大学 一种结核分枝杆菌的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用

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