CN111020043A

CN111020043A - 一种mtb的检测引物及其试剂盒

Info

Publication number: CN111020043A
Application number: CN202010026349.8A
Authority: CN
Inventors: 钱学庆; 秦炜; 宋成林; 贺笑非; 吴小虎; 胡雄敏; 崔丹; 杨觐瑜; 赵垠莹; 侯隽杰
Original assignee: Shanghai Runda Rongjia Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Runda Rongjia Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-04-17

Abstract

本发明提供了一种MTB的检测引物，属于基因检测技术领域，所述检测引物包括扩增MTB基因的正向引物、反向引物及MGB探针引物，本发明采用数字PCR技术检测MTB，设计的引物和MGB探针可以扩展适用于其它数字PCR系统；可检测出低浓度的MTB核酸样本，具有很高的特异性及灵敏度，引物扩增效率高，将极大地提高MTB的检出率，为临床检测MTB提供一种可靠方法。

Description

一种MTB的检测引物及其试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及数字PCR检测人类MTB的引物及其试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，简称为结核杆菌(tuberclebacilli)，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80％，其中约5％～10％携带者可发展为活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。21世纪以来全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。

目前，荧光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction，QPCR)是检测定量 MTB使用的比较多的技术手段，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光标记的探针(如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，以此来评估PCR的扩增效果。荧光定量PCR主要依赖于校准物制备的标准曲线，进而确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。该技术存在众多不足：1.校准品和样品间背景的差异易影响PCR的效率和测量响应；2.低拷贝数的目标DNA分子不能通过扩增检测到；3.样品的PCR扩增效率可能与校准物的扩增效率不同；4.DNA提取时引入DNA 溶液的杂质或者DNA降解影响了PCR动态扩增过程。因此，荧光定量PCR很难达到对低拷贝值MTB的检测与绝对定量。

数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)是一项针对单分子靶标DNA的绝对定量技术。该技术是将含有DNA模板的PCR溶液稀释后分布到大量的独立反应室(如芯片)，液体分子遵从泊松分布，单分子间通过稀释分离，并且独自进行PCR扩增，这种样品的分配可以极大降低本底信号的影响，提高低丰度靶标的扩增灵敏度，最后分析每个扩增产物，通过泊松概率分布公式计算出DNA模板的原始拷贝数而不需要采用参考标准物或者外标。准确的定量依赖于40～45个循环的扩增，假阴性检出水平(单DNA模板出现在反应室而未被检出) 非常低。其具有操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确等优点。

数字PCR作为DNA定量的新技术，克服了实时荧光定量PCR的一系列缺点，实现了单分子DNA绝对定量。避免了荧光定量PCR使用标准曲线对测量结果产生影响等问题。此技术可代替荧光定量PCR应用于MTB的定量检测。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供了一组特异性强，扩增效率高的PCR引物及MGB探针，再结合高灵敏度的数字PCR技术，以达到检测和绝对定量低拷贝值MTB的目的。

MGB探针是在普通探针的基础上设计了非荧光淬灭基团，降低了本底信号强度。同时 MGB基团对DNA双链小沟具有高亲和性，提高了检测的特异性和信噪比，又降低了检测成本。在本发明中，MGB探针的Tm值特异地统一设计为70℃，而PCR扩增引物特异地统一设计为60℃，使得MGB探针能够特异地结合到PCR扩增产物序列中。在PCR扩增过程中，利用Taq酶5’-3’外切酶特点，水解MGB探针，产生荧光信号。

即本发明提供了一种MTB的检测引物，所述检测引物包括MTB的正向引物、反向引物以及MGB探针引物。

所述正向引物及反向引物位于MTB基因1043131-1043149和1043198-1043217碱基，优选地，其序列如SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示。

所述MGB探针引物位于MTB基因1043153-1043170碱基，其序列如SEQ ID NO.：3所示。所述引物扩增基因序列位于MTB基因1043131-1043217碱基，扩增片段大小为87个碱基，如SEQ ID NO.：4所示。

在上述的MTB检测引物中，所述MTB引物序列选自PubMed数据库中MTB基因1043131-1043149和1043198-1043217碱基，MTB基因组编号NCBI编码为NC_000962.3，其序列如SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示。其引物3’端无连续的G或C碱基聚集，3’端不存在自身互补重叠序列，可避免发夹结构和引物二聚体的产生。

在上述的MTB检测引物中，所述正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.：1和SEQID NO.：2所示。

MTB-正向：GATCACCGACGGCAACAAG(SEQ ID NO.1)

MTB-反向：AACGCGTCAGACAACTTCAC(SEQ ID NO.2)

所述MGB探针引物序列如SEQ ID NO.：3所示。

MTB探针：A425-TCGTTCCTCGACCAGGTT-MGB(SEQ ID NO.3)

所述扩增区域序列如SEQ ID NO.：4所示。

引物扩增序列：

GATCACCGACGGCAACAAGGCCTCGTTCCTCGACCAGGTTCATTTCCAGCCGCTGCCGCCCGCGGTGGTGAAGTTGTCTGACGCGTT(SEQ ID NO.4)

设计的MGB探针引物利用A425荧光染料进行5’端修饰如SEQ ID NO.：3所示，荧光信号强，检测效率最高。

在上述的MTB检测引物中，所述检测引物的使用方法：

1)提取样品DNA；

2)利用SEQ ID NO.：1-3所示的正、反向扩增引物及MGB探针引物，对步骤1)所述DNA 样品利用芯片PCR扩增仪进行扩增，获得MTB的扩增产物；

3)利用生物芯片阅读仪对步骤2)所述扩增产物进行扫描和分析，获得所述扩增产物的拷贝值。

本发明还提供了一种检测人类MTB的试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测引物。

进一步地，所述检测试剂盒包括样品DNA抽提试剂、70％乙醇、异丙醇、检测体系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品；

其中检测体系PCR反应液包括：1对扩增引物和1条MGB探针引物，序列如SEQ IDNO.： 1-3所示。

优选地，所述检测体系PCR反应液还包括：2x Multiplex PCR Plus Buffer；dNTPMix；HotStar Taq Plus DNA Polymerase。

本发明设计了检测MTB的正、反向引物及MGB探针引物，可同时用于荧光定量PCR及数字PCR扩增反应。通过荧光定量PCR扩增对比发现其扩增效率高于其它引物。对质粒标准品及送检样本进行数字PCR检测，均可以精确地检测MTB的绝对拷贝值。通过调整正反向引物及探针的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。

本发明取得的有益效果：设计的MTB正反向扩增引物，可以高效的扩增出目的基因，具有很高的特异性及精确性，其扩增效率优于其它扩增引物；采用数字PCR方法扩增目的基因，具有灵敏度高，能够绝对定量等优点。将极大地提高MTB的检出效率，为临床检测MTB提供一种可靠方法。

附图说明：

图1为本发明实施例与文献报道引物的扩增对比；

图2为本发明实施例与其它引物的扩增对比。

具体实施方式

以下优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例已对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例1

检测MTB扩增的引物序列

包括SEQ ID NO.：1-3所示的序列，为扩增MTB的正、反向引物及MGB探针引物。

本发明设计的正、反向引物碱基分布随机，引物3’端无连续的G或C碱基聚集，3’端不存在自身互补重叠序列，可避免发夹结构和引物二聚体的产生。相关文献(Harkins K M,Buikstra J E,Campbell T,et al.Screening ancient tuberculosis with qPCR:challenges and opportunities[J].Philosophical Transactions of the RoyalSociety B:Biological Sciences,2015, 370(1660):20130622.)报道引物如SEQ ID NO.：5-7所示，其反向引物存在自身互补序列，易形成发夹结构，不利于PCR扩增。

文献报道正向引物：GCACTCCATCTACGACCAG(SEQ ID NO.：5)

文献报道反向引物：GGGAGTTTGTCGGTCAGAG(SEQ ID NO.：6)

文献报道探针：ATTGGGCAACAACTGATTCGGCGTCG(SEQ ID NO.：7)

本发明中同时设计了其它引物和探针，引物探针序列如SEQ ID NO.：8-10所示

其它正向引物：GTACTGTCGCGACTACCCC(SEQ ID NO.：8)

其它反向引物：AGGTTGAACAGCGGGTAGAG(SEQ ID NO.：9)

其它探针：TCGTCGCCGGTGACGT(SEQ ID NO.：10)

在检测中，利用上述权利要求书中所述的正、反向引物及MGB探针引物与相关文献的引物探针和其它引物探针进行对比，以人工合成MTB基因(上海生物工程股份有限公司)作为模板，同时进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线图(图1，2)，上述权利要求书中所述引物的扩增效率明显优于文献和其它引物。本实验中中使用GAPDH基因作为内参基因，扩增效果良好，引物序列详见参考文献(PMID:17229868)。

实施例2

测试基于数字PCR技术的MTB检测试剂盒

包括：组织DNA抽提试剂盒(凯捷公司的提取试剂盒，货号158467)；70％乙醇；异丙醇；芯片试剂盒(杭州领航基因公司提供的芯片试剂盒，货号V1)；检测体系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品。其中检测体系PCR反应液包括：2x Multiplex PCR Plus Buffer；dNTPMix；HotStar Taq Plus DNA Polymerase；SEQ ID NO.：1-3所示的扩增MTB的正、反向引物及MGB探针引物。本文中2x Multiplex PCR Plus Buffer、dNTP Mix；HotStar Taq PlusDNA Polymerase、ROX dye均为商用常规的试剂，可直接检索到相应品牌，实验人员可根据自我需求进行相应的商用调整或根据处方进行自配调整成分。

实施例3

基于数字PCR技术检测MTB的方法

(1)抽提全血液样品中的基因组DNA：

1)抽取600μL血液加900μl红细胞裂解液，颠倒混匀10次，室温放置1min，期间再颠倒混匀几次，16000x g离心1min，吸去上请，留下白细胞沉淀，加600μl细胞裂解液，振荡10s使白细胞彻底悬浮混匀。

2)加入18μl蛋白酶K溶液，混匀，58孵育2h。

3)加入200μl蛋白沉淀液，高速振荡混匀20s。

4)16000x g离心1min，留下上清液，丢弃沉淀。

5)将上一步上清液加入到提前装有600μl异丙醇的1.5ml离心管中，上下轻柔颠倒混匀 50次，此时可观察到絮状DNA析出。

6)16000x g离心1min，此时DNA全部沉淀至管底形成一个小白点。

7)用干净的吸水纸将管中残留液体吸干，注意不能将DNA沉淀吸走。

8)加入70％乙醇并上下颠倒几次清洗DNA沉淀。

9)16000x g离心1min，弃上清液，用干净的吸水纸将管中残留液体吸干，注意不能将 DNA沉淀吸走。

10)于超净工作台内静置5min吹干。

11)加入10μl DNA溶解液，高速振荡5s。

12)65孵育5min后室温静置过夜使DNA充分溶解。

(2)试剂配置:

检测体系PCR反应液配制如下:

试剂名称	用量
		2X Multiplex PCR Master Mix	12.5μl
正向引物(6μM)	2.5μl
		反向引物(6μM)	2.5μl
MGB探针引物(3μM)	2.5μl
		ROX dye(12.5μM)	1.0μl
样品DNA模板	4.0μl
		总计	25.0μl

其中，正反向扩增引物及MGB探针引物碱基序列如SEQ ID NO.：1-3所示。

按检测人份数总共配置PCR反应液Xμl，每人份21μl分装：

X＝21μl反应液X(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照)

n为检测标本数。

(3)加样：将4μl步骤(1)中获得的血液基因组DNA溶液加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加4μl阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加4μl ddH2O。

(4)芯片上样：用移液枪吸取15μl步骤(3)中配置好的PCR反应液通过上样刷均匀涂刷到芯片中，加入甘油，盖好盖板，密封芯片。

(5)数字PCR扩增：扩增在芯片专用PCR仪上进行，可用仪器包括iThermal 1.0PCR仪 (杭州领航基因科技有限公司)等。反应条件如下：95预变性5分钟30秒；95 30秒，55 90秒，72 30秒，共40个循环；4保存。

(6)荧光扫描及图像分析:

将(5)中扩增完成的芯片放置于生物芯片阅读仪中进行荧光扫描拍照并进行数据分析，分析完成后即可计算出样本中MTB分子的绝对数值。

实施例4

采用本发明中基于数字PCR技术的MTB检测试剂盒检测临床标本。

取送检抗凝血标本14例，其中临床确诊阳性11例，阴性3例。该14例样本按实施例3所述方法提取样本基因组DNA，配制试剂并检测。每份标本加入检测体系PCR反应液中4μl，同时做阳性，阴性对照。每个样本重复2次。数字PCR引物检测结果显示11例阳性，检测拷贝值范围为65-58067拷贝/ml，3例阴性，且与确诊结果一致，准确率为100％。文献报道引物检测结果显示阳性5例，阴性9例，准确率为57.1％。其它引物检测结果显示阳性3例，阴性11例，准确率为42.9％。数字PCR引物检测结果显著高于文献报道引物和其它引物。

检测结果如下表1：

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海润达榕嘉生物科技有限公司

<120> 一种MTB检测引物及其试剂盒

<141> 2020-01-10

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gatcaccgac ggcaacaag 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aacgcgtcag acaacttcac 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcgttcctcg accaggtt 18

<210> 4

<211> 87

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gatcaccgac ggcaacaagg cctcgttcct cgaccaggtt catttccagc cgctgccgcc 60

cgcggtggtg aagttgtctg acgcgtt 87

<210> 5

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gcactccatc tacgaccag 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gggagtttgt cggtcagag 19

<210> 7

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

attgggcaac aactgattcg gcgtcg 26

<210> 8

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gtactgtcgc gactacccc 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aggttgaaca gcgggtagag 20

<210> 10

<211> 16

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tcgtcgccgg tgacgt 16

Claims

1.一种MTB的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括MTB的正向引物、反向引物以及MGB探针引物。

2.根据权利要求1所述MTB的检测引物，所述MTB引物序列对应国际PubMed数据库中MTB基因组1043131-1043149和1043198-1043217处碱基，MTB基因组编号NCBI编码为NC_000962.3。

3.根据权利要求1所述MTB的检测引物，其特征在于，所述MGB探针引物对应于MTB病毒基因1043153-1043170碱基。

4.根据权利要求1所述检测引物，其特征在于，所述正向引物及反向引物序列如SEQ IDNO.：1和SEQ ID NO.：2所示，所述MGB探针引物序列如SEQ ID NO.：3所示。

5.根据权利要求1所述检测引物，其特征在于，所述检测引物的使用方法：

1)提取样品DNA；

2)利用SEQ ID NO.：1-3所示的正向引物、反向引物及MGB探针引物，对步骤1)所述DNA样品利用芯片PCR扩增仪进行扩增，获得MTB的扩增产物；

6.一种检测人MTB的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5任一权利要求所述的检测引物。

7.根据权利要求6所述检测人类MTB的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括样品DNA抽提试剂、70％乙醇、异丙醇、检测体系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品；

其中检测体系PCR反应液包括：正向扩增引物、反向扩增引物和MGB探针扩增引物，序列如SEQ ID NO.：1-3所示。

8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述检测体系PCR反应液还包括：PCR缓冲液及DNA聚合酶。

9.一种权利要求1所述MTB的检测引物在制备MTB检测试剂盒中的用途。