CN112195276A - 同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、jc病毒和eb病毒的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂盒及方法。本发明应用实时荧光定量PCR技术，采用单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒高度特异的引物和探针，通过一个PCR反应即可判定待测样本中是否存在这4种病毒，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。利用本发明试剂盒对4种病毒的检测灵敏度均达到10copies/mL，其特异性很好，不和其他病毒发生交叉反应；同时，本发明试剂盒的扩增重复性好，精密度均≤2％。

Description

同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和 EB病毒的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及一种同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂盒及其检测方法。
背景技术
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)可分为I型和II型(HSV-I和HSV-II)。人是HSV唯一的自然宿主。I型单纯疱疹病主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官，如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹。口和口周围发生的疱疹，99％是由I型疱疹病毒感染引起的。临床上又可分为原发型和复发型单纯疱疹。常见者如皮肤疱疹、疱疹性齿龈口腔炎、眼疱疹(急性结膜角膜炎、角膜溃疡)、湿疹样疱疹、疱疹性甲沟炎，重者可发展为全身性单纯疱疹、疱疹性直肠炎、急性脑炎、急性脑膜炎和神经根炎等。HSV-II型主要引起生殖器及腰以下皮肤疱疹。如果孕妇罹患原发性疱疹病毒感染，病毒就有可能在病毒血症期间通过胎盘感染胎儿而形成先天性感染。如果孕妇产道感染疱疹病毒(原发或复发感染)，则病毒可于分娩过程中感染新生儿而引起新生儿感染。无论是先天性感染或新生儿感染，预后都较差。原发感染后4～5天体内产生中和性抗体，但不能防止复发。原发病人可有发热，体温可高达39℃，病程7～9日；疱疹继发细菌感染则呈脓疱样或湿疹样，病程延长且愈后皮肤留瘢痕。复发性单纯疱疹，可有细胞免疫缺陷。
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)，是一种双链DNA病毒，KSHV是卡波氏肉瘤的病原体，卡波氏肉瘤是一种损坏外形并潜在致命的出血性肉瘤形式，其特征在于在皮肤上以深色斑或小结出现的多发性脉管肿瘤。在组织学水平上，其特征在于相对一致的纺锤形细胞的增殖，形成束和脉管裂缝。在炎症浸润中经常出现浆细胞，T细胞和单核细胞，胃肠损害处或相关的淋巴瘤处出血的最终结果可能是死亡。
JC病毒(JC virus，JCV)属乳多空病毒科多瘤病毒种人类多瘤病毒分支。1971年Pagett等首次从进行性多灶性白质脑病(progressivemultifocal leucoencephalopathy，PML)患者脑组织中分离出JC病毒。JC病毒在人群中广泛存在，主要潜伏在人的肾脏等组织内。JC病毒的感染发生在人的童年时期，呈持续亚临床潜伏感染状态，免疫健全状态下可终生无症状，属于无症状感染，但对于AIDS患者或服用免疫抑制药物的患者则可引发PML等系列疾病，PML是一种致死性中枢神经系统脱髓鞘疾病。近年来研究表明，JC病毒与多种人类肿瘤的发生相关，包括脑肿瘤、结直肠癌、胃癌、食道癌及B细胞淋巴系统肿瘤等。随着我国HIV/AIDS患者人数的逐年增加，JC病毒感染作为HIV/AIDS相关的机会感染也会逐年增多，以及肾移植等器官移植患者在施用免疫抑制药物后，JC病毒感染引发PML的概率增大，JC病毒所带来的危害也会更加突出。对JC病毒感染的检测包括检测血清中特异性的VP1抗体，对感染者的尿液、脑脊液、血液及病变组织进行JC病毒DNA检测，对活组织进行原位杂交及免疫组化检测等。由于JC病毒在人群中感染率很高，抗体检测并不能准确证明样品是否被活动性JC病毒感染。
EB病毒是疱疹病毒科病毒γ亚科中唯一能够引起人类感染的淋巴滤泡病毒，具有嗜B淋巴细胞的特性，能够在B淋巴细胞中建立起隐性感染，刺激细胞的增生与转化。可能与包括传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、Burkits肉瘤、霍金奇病和鼻咽癌等在内的多种疾病有关。其中，80％的鼻咽癌病例发生在中国，在我国南方数省鼻咽癌的发病率和死亡率均占恶性肿瘤的第一位。EB病毒感染细胞后的裂解复制期产生壳抗原(VCA)IgA抗体，其在鼻咽癌中的阳性率达93％，具有极高的特异性。
机会性感染是指一些致病力较弱的病原体，在人体免疫功能正常时不能致病，但当人体免疫功能降低时，它们乘虚而入，侵入人体内，导致各种疾病。上述四种病毒都属于DNA病毒，常会引发机会性感染，而且会出现在同一宿主中共存的现象。为了较好地指导对上述四种病毒的研究，需要开发一种能够检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒产品。PCR的出现，极大的增加了检测手段的敏感性，然而，传统的检测方法或检测产品单次只能检测一种病毒类型。多重PCR(Multiplex PCR，M-PCR)是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段，实现了一次性检测多种病原体的目的。然而，由于多重PCR是在同一PCR反应体系里加入多对引物以扩增多个DNA片段的PCR反应，因此同一反应体系中的多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构，二聚体结构等，引物对和引物量越多，引物之间的相互作用越明显，从而影响PCR扩增效率，进而影响了多重PCR的广泛应用。本发明致力于开发出可靠的诊断试剂，以便在同一反应中以高灵敏度来检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒。
发明内容
为了解决现有技术中无法同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的问题，本发明提供了基于荧光PCR技术的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒核酸的检测引物和探针，以实现快速、有效且准确检测这四种病毒。
本发明另一个目的是提供一种检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的四重荧光PCR试剂盒，是一种一步法四重实时荧光PCR检测试剂盒。
本发明再一个目的是提供上述试剂盒在制备检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂中的应用。
本发明第四个目的是提供上述试剂盒的使用方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，提供一种针对单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的四重荧光PCR检测用引物及探针，探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体序列如下：
单纯疱疹病毒：
单纯疱疹病毒上游引物：5'-TCACCGACCCGGAGAGGGACATCC-3’(SEQ ID NO:1)
单纯疱疹病毒下游引物：5'-GGGCCAGGCGCTTGTTGGTGTA-3'(SEQ ID NO:2)
单纯疱疹病毒探针：5'-CCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGT-3'(SEQ ID NO:3)
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒：
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒上游引物：5'-GTGATGTTCTGAGTACATAGCGGT-3'(SEQ IDNO:4)
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒下游引物：5'-CATCCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'(SEQ IDNO:5)
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒探针：5'-AGACAAATTGCCAGTAGCCCACCAGGAGA-3'(SEQ IDNO:6)
JC病毒：
JC病毒上游引物：5'-ATTACTAAACACAGCTTGACTGAGGAA-3'(SEQ ID NO:7)
JC病毒下游引物：5'-CATTTAATGAGAAGTGGGATGAAGAC-3'(SEQ ID NO:8)
JC病毒探针：5'-GGTAGAGTGTTGGGATCCTGTGTTTTCATCATCA-3'(SEQ ID NO:9)
EB病毒：
EB病毒上游引物：5'-ACCCCTGTTTATCCGATGGAATGAC-3'(SEQ ID NO:10)
EB病毒下游引物：5'-AGGGCATGTGGTGGCGCCAGCGTG-3'(SEQ ID NO:11)
EB病毒探针：5'-GAATGACGGCGCATTTCTCGTGCGTGTACACCG-3'(SEQ ID NO:12)
作为优选方案，以上所述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒探针上带有的荧光报告基团选自6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)、六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro-6-methylf luorescein，HEX)、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein，T E T)、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、磺酰罗丹明(SuLforhodamine 101，TexasRed)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(6-Carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein，JOE)、花菁3(cyanine3，Cy3)、花菁3.5(cyanine3.5，Cy3.5)、花菁5(cyanine5，Cy5)和花菁5.5(cyanine5.5，Cy5.5)中的至少一种；所述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒探针上带有的荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1(BlackHole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬灭剂2(Black Hole Quencher 2，BHQ2)或黑洞淬灭剂3(Black Hole Quencher 3，BHQ3)中的至少一种。
作为优选方案，以上所述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒探针上带有的荧光报告基团选自6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)、VIC荧光染料、磺酰罗丹明(SuLforhodamine 101，Texas Red)或花菁5；所述荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1，BHQ1)或黑洞淬灭剂2(Black Hole Quencher2，BHQ2)。
最优选的,单纯疱疹病毒探针的荧光报告基团为6-羧基荧光素，荧光淬灭基团为BHQ1；卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的荧光报告基团为VIC荧光染料，荧光淬灭基团为BHQ1；JC病毒探针的荧光报告基团为磺酰罗丹明，荧光淬灭基团为BHQ2；EB病毒探针的荧光报告基团为花菁5，荧光淬灭基团为BHQ2。
第二方面，本发明提供一种单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，包括以上任一所述的四种病毒的检测用引物及探针，所述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒探针上分别带有不同的荧光报告基团。
作为优选，上述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，在使用时按以下比例配制引物、探针混合液：单纯疱疹病毒扩增引物对与单纯疱疹病毒检测探针的摩尔比为3:1；卡波氏肉瘤相关疱疹病毒扩增引物对与卡波氏肉瘤相关疱疹病毒检测探针的摩尔比为2:1；JC病毒扩增引物对与JC病毒检测探针的摩尔比为2:1；EB病毒扩增引物对与EB病毒检测探针的摩尔比为3:1；单纯疱疹病毒检测探针、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒检测探针、JC病毒检测探针、EB病毒检测探针的摩尔比为3:2:2:3。
作为优选，上述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，还包括阳性对照品和阴性对照品，其中阴性对照品为不含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的生理盐水溶液，需要说明的是，阴性对照也可以为不含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒基因的生理盐水溶液；阳性对照品包括含有由如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示序列扩增获得的单纯疱疹病毒靶序列的质粒(命名为单纯疱疹病毒阳性对照品)、含有由如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示序列扩增获得的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒靶序列的质粒(命名为卡波氏肉瘤相关疱疹病毒阳性对照品)、含有由如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示序列扩增获得的JC病毒靶序列的质粒(命名为JC病毒阳性对照品)和含有由如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示序列扩增获得的EB病毒靶序列的质粒(命名为EB病毒阳性对照品)。
具体地，阳性对照品的制备过程如下：分别提取单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的DNA作为模板，分别用相应的引物将相应的靶序列进行扩增；将扩增产物连入载体中，分别获得含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒或EB病毒靶序列的质粒，所述载体为pUC57-Kan载体。
在其中一个实施例中，阴性对照为不含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的生理盐水溶液。需要说明的是，阴性对照也可以为不含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒基因的生理盐水溶液。
作为优选，上述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，还包括DNA提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶中的至少一种，所述PCR反应液包括220mM～280mM的Tris-base、质量百分含量为0.2％～0.3％的TritonX-100和20mmol/L～30mmol/L的MgCl2；所述酶为Taq酶。
更为优选，上述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，PCR反应液包括250mM的Tris-base、质量百分含量为0.25％的TritonX-100和25mmol/L的MgCl2。
第三方面，提供上述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒在制备检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂中的应用。
第四方面，提供一种单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的联合检测方法，此检测方法是非诊断非治疗目的，该方法使用上述任一单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
(1)提取待检样品的DNA；
(2)以待测样品DNA为模板，加入上述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒中的各组分进行多重荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析，如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为对应病毒为阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，Ct值≤38，则对应的病毒判定为阳性。
作为优选，上述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的联合检测方法中多重荧光PCR扩增反应的反应体系(25μL总体系，以下均同)包括：5mM的dNTPs、5μL的PCR反应液、0.3μmol的单纯疱疹病毒扩增引物对、0.3μmol的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒扩增引物对、0.3μmol的JC病毒扩增引物对、0.3μmol的EB病毒扩增引物对，0.1μmol的单纯疱疹病毒探针、0.1μmol的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒探针、0.1μmol的JC病毒探针、0.1μmol的EB病毒探针、1μL的酶及0.5μL～5μL的待测样本DNA。
作为优选，上述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的联合检测方法中多重荧光PCR扩增反应的反应条件为：93℃～95℃预变性2min～10min；93℃～95℃变性10s～30s，55℃～60℃退火、延伸、信号采集30s～60s，循环40次～45次。
上述多重荧光PCR扩增反应在多重荧光定量PCR仪中进行。进一步地，多重荧光定量PCR仪为ABI系列多重荧光定量PCR仪、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2)多重荧光定量PCR仪、S tratagene MX系列多重荧光定量PCR仪、R oche Lightcycler多重荧光定量PCR仪、Ccpheid smartcycler多重荧光定量PCR仪、Corbett Rortor-Gene多重荧光定量PCR仪、杭州博日系列多重荧光定量PCR仪。需要说明的是，多重荧光定量PCR仪不限于上述指出的PCR仪，其他多重荧光定量PCR仪也能够用于本发明中。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明针对单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒设计的检测引物对相互配合，能够避免各引物之间的相互干扰，通过多重荧光定量PCR实现在一管标本同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒，节省检测时间，只需操作一次，减少了污染产生的机会。
2、利用本发明试剂盒的检测方法灵敏度高，四种病毒的检测灵敏度均达到10copies/mL。同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他病毒发生交叉反应，例如腺病毒、麻疹病毒、A2型柯萨奇病毒。
3、本发明试剂盒的扩增重复性非常好，计算获得精密度均≤2％。
附图说明
图1为实施例2中同一浓度的阳性待测品四个通道的扩增曲线图；
图2为实施例2中不同浓度阳性待测品的单纯疱疹病毒的FAM通道的扩增曲线图；
图3为实施例2中不同浓度阳性待测品的卡波西肉瘤病毒的VIC通道的扩增曲线图；
图4为实施例2中不同浓度阳性待测品的JC病毒的TEXAS RED通道的扩增曲线图；
图5为实施例2中不同浓度阳性待测品的EB病毒的CY5通道的扩增曲线图；
图6为实施例3中实验组的阳性待测样品的扩增曲线图；
图7为实施例3中对照组1的阳性待测样品的扩增曲线图；
图8为实施例3中对照组2的阳性待测样品的扩增曲线图；
图9为实施例4中精密度待测品重复性检测的扩增曲线图；
图10为实施例4中精密度待测品的单纯疱疹病毒重复性检测的FAM通道的扩增曲线图；
图11为实施例4中精密度待测品的卡波西肉瘤病毒重复性检测的VIC通道的扩增曲线图；
图12为实施例4中精密度待测品的JC病毒重复性检测的TEXAS RED通道的扩增曲线图；
图13为实施例4中精密度待测品的EB病毒重复性检测的CY5通道的扩增曲线图；
图14为实施例5中阳性待测品的扩增曲线图；
图15为实施例5中阴性待测品的扩增曲线图；
图16为实施例5中待测样品的扩增曲线图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例结合附图对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
【实施例1】提供一种在同一反应中检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂盒。
试剂盒包括PCR反应液、同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的核酸组合物、热启动Taq酶、阳性对照和阴性对照。其中，PCR反应液包括250mM的Tris-base、质量百分含量为0.25％的TritonX-100、25mmol/L的MgCl2。
其中核酸组合物包括：
序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的单纯疱疹病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示的JC病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示的EB病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.3所示的单纯疱疹病毒探针，单纯疱疹病毒探针的两端分别连接有FAM和BHQ1；序列如SEQ ID No.6所示的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒探针，卡波氏肉瘤相关疱疹病毒探针的两端分别连接有VIC和BHQ1，序列如SEQ ID No.9所示的JC病毒探针，JC病毒探针的两端分别连接有TEXAS和BHQ2；序列如SEQ ID No.12所示的EB病毒探针，EB病毒探针的两端分别连接有CY5和BHQ2。
阳性对照品包括含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒靶序列的质粒。
单纯疱疹病毒靶序列质粒的构建方法:采用PCR法对单纯疱疹病毒的核酸样本进行扩增，PCR引物序列如SEQ ID NO：1-2所示。将扩增的片段纯化后，将扩增产物连入pUC57-Kan载体中，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增，然后提取质粒获得单纯疱疹病毒阳性对照品。
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒靶序列质粒的构建方法:采用PCR法对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的核酸样本进行扩增，PCR引物序列如SEQ ID NO：4-5所示。将扩增的片段纯化后，将扩增产物连入pUC57-Kan载体中，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增提取质粒，获得卡波氏肉瘤相关疱疹病毒阳性对照品。
JC病毒靶序列质粒的构建方法:采用PCR法对JC病毒的核酸样本进行扩增，PCR引物序列如SEQ ID NO：7-8所示。将扩增的片段纯化后，将扩增产物连入pUC57-Kan载体中，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增提取质粒，获得JC病毒阳性对照品。
EB病毒靶序列质粒的构建方法:采用PCR法对EB病毒的核酸样本进行扩增，PCR引物序列如SEQ ID NO：10-11所示。将扩增的片段纯化后，将扩增产物连入pUC57-Kan载体中，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增并提取质粒，获得EB病毒阳性对照品。
阴性对照为不含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的生理盐水溶液。
【实施例2】测定实施例1的试剂盒在同一反应中检测四种病毒的灵敏度
(1)将实施例1的试剂盒中单纯疱疹病毒阳性对照品、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒阳性对照品、JC病毒阳性对照品、EB病毒阳性对照品混合并配成混合液，得到阳性待测品(每种病毒阳性对照品的浓度均为106copies/mL)。
(2)对阳性待测品进行10倍梯度稀释(即10copies/mL～105copies/mL)，采用实施例1的试剂盒对各梯度下的阳性待测品进行多重荧光定量PCR检测，多重荧光定量PCR反应的体系如表1所示。多重荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火、延伸、信号采集40s，循环40次。
(3)结果分析：通过荧光扩增曲线图和Ct值的大小来判断检测结果的阴阳性，确定样品中是否含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒、EB病毒。具体地，当扩增曲线图Ct值≤38，并扩增曲线呈现明显指数增长(即S型)时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值>38或无Ct值，结果表现为阴性。检测结果如图1～5所示。其中，图1为实施例2中不同浓度的阳性待测品的扩增曲线图。图2为实施例2中不同浓度阳性待测品的单纯疱疹病毒的FAM通道的扩增曲线图，图2中箭头(2-1)、箭头(2-2)、箭头(2-3)、箭头(2-4)、箭头(2-5)所指的曲线分别对应浓度为105copies/m L、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL、10copies/mL下的扩增曲线。图3为实施例2中不同浓度阳性待测品的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的VIC通道的扩增曲线图，图3中箭头(3-1)、箭头(3-2)、箭头(3-3)、箭头(3-4)、箭头(3-5)所指的曲线分别对应浓度为105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL、10copies/mL下的扩增曲线。图4为实施例2中不同浓度阳性待测品的JC病毒的TEXASRED通道的扩增曲线图，图4中箭头(4-1)、箭头(4-2)、箭头(4-3)、箭头(4-4)、箭头(4-5)所指的曲线分别对应浓度为105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL、10copies/mL下的扩增曲线。图5为实施例2中不同浓度阳性待测品的EB病毒的CY5通道的扩增曲线图，图5中箭头(5-1)、箭头(5-2)、箭头(5-3)、箭头(5-4)、箭头(5-5)所指的曲线分别对应浓度为105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL、10copies/mL下的扩增曲线。
表1多重荧光定量PCR反应的体系
试剂 浓度 体积(μL/份)
dNTPs 2.5mM/μL 2
PCR反应液 -- 5
单纯疱疹病毒扩增引物对的上游引物 50pmoL/μL 0.3
单纯疱疹病毒扩增引物对的下游引物 50pmoL/μL 0.3
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒扩增引物对的上游引物 50pmoL/μL 0.3
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒扩增引物对的下游引物 50pmoL/μL 0.3
JC病毒扩增引物对的上游引物 50pmoL/μL 0.3
JC病毒扩增引物对的下游引物 50pmoL/μL 0.3
EB病毒扩增引物对的上游引物 50pmoL/μL 0.3
EB病毒扩增引物对的下游引物 50pmoL/μL 0.3
单纯疱疹病毒检测探针 50pmoL/μL 0.2
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒检测探针 20pmoL/μL 0.2
EB病毒检测探针 20pmoL/μL 0.2
JC病毒检测探针 20pmoL/μL 0.2
酶液 -- 1
待测样品DNA -- 4
ddH2O -- 致总体积25
其中，反应体系中热启动Taq酶。ddH2O即为双蒸水。反应体系中的所有试剂放在同一反应管中进行多重荧光定量PCR检测。从图1可以看出，实施例1的试剂盒能够同时一次性检测一份待测样品中的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒，节省检测时间。
从图2～5可以看出，单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒在10copies/mL～105copies/mL范围内的扩增曲线均呈良好的线性关系，四种病毒的检测灵敏度均达到10copies/mL，灵敏度较高。
【实施例3】实施例1的试剂盒与已知商品化的试剂盒的特异性比较
(1)将实施例1的试剂盒中单纯疱疹病毒阳性对照品、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒阳性对照品、JC病毒阳性对照品、EB病毒阳性对照品(每种病毒阳性对照品的浓度均为106copies/mL)混合并配成混合液，得到阳性待测品；不含上述四种病毒阳性对照品的生理盐水为阴性待测品。
(2)实验分为实验组、对照组1和对照组2，实验组的试剂盒为实施例1的试剂盒。对照组1的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同，对照组2的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同(对照组1和对照组2的试剂盒成分均为已知商品化的试剂盒的成分，即：dNTPs、PCR反应液、四种病毒的扩增引物和探针、酶、阳性对照品、阴性标准品，其中单纯疱疹病毒阳性对照品、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒阳性对照品、JC病毒阳性对照品、EB病毒阳性对照品的DNA区域包含对照组1或2的试剂盒扩增引物针对的片段)。
(3)采用实验组的试剂盒、对照组1的试剂盒和对照组2的试剂盒对阳性待测品和阴性待测品均进行多重荧光PCR检测，反应体系、反应条件和结果分析与实施例2相同。检测结果如图6～8所示。其中，图6为实施例3中实验组的阳性待测样品的扩增曲线图，图7为实施例3中对照组1的阳性待测样品的扩增曲线图，图7中箭头(7-1)所指曲线为单纯疱疹病毒的扩增曲线，图7中箭头(7-2)所指曲线为单纯疱疹病毒的扩增曲线，图7中箭头(7-3)所指曲线为JC病毒的扩增曲线，图7中箭头(7-4)所指曲线为EB病毒的扩增曲线。图8为实施例3中对照组2的阳性待测样品的扩增曲线图，图8中箭头(8-1)所指曲线为单纯疱疹病毒的扩增曲线，图8中箭头(8-2)所指曲线为卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的扩增曲线，图8中箭头(8-3)所指曲线EB病毒的扩增曲线。
从图6可以看出，实验组得到四条S型扩增曲线，同时阴性待测品无扩增曲线，说明实验组的试剂盒能够同时检测出阳性待测样品中的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒，同时不会出现非特异性扩增曲线。
从图7可以看出，对照组1得到四条S型扩增曲线，说明对照组能够同时检测出待测样品中的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒，但是却存在假阳性扩增曲线，说明对照组1的四对条引物和四条探针进行病毒检测时容易出现假阳性。
从图8可以看出，对照组2得到三条S型扩增曲线，未能够扩增JC病毒阳性对照品，说明对照组1的四对条引物和四条探针之间存在相互干扰，导致未能同时检测上述四种病毒。
【实施例4】实施例1的试剂盒精密度的测定
将实施例1的试剂盒中单纯疱疹病毒阳性对照品、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒阳性对照品、JC病毒阳性对照品、EB病毒阳性对照品混合并配成混合液，得到阳性待测品。将阳性待测品进行10倍梯度稀释(浓度梯度为105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL、10copies/mL)，得到精密度待测品，用实施例1所用的试剂盒进行多重荧光定量PCR扩增，扩增精密度待测品10个复孔，检测结果如图9～13所示。图9为实施例4中精密度待测品重复性检测的扩增曲线图。图10为实施例4中精密度待测品的单纯疱疹病毒重复性检测的FAM通道的扩增曲线图。图11为实施例4中精密度待测品的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒重复性检测的VIC通道的扩增曲线图。图12为实施例4中精密度待测品的JC病毒重复性检测的TEXAS RED通道的扩增曲线图。图13为实施例4中精密度待测品的EB病毒重复性检测的CY5通道的扩增曲线图。
从图9～13可以看出，上述实施方式的试剂盒各通道的精密度都非常好，导出CT值数据，计算获得精密度均≤2％，该试剂盒的扩增重复性非常好。
【实施例5】实施例1的试剂盒对临床样本的检测
(1)将实施例1的试剂盒中单纯疱疹病毒(HSV)阳性对照品、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)阳性对照品、JC病毒阳性对照品、EB病毒阳性对照品混合并配成混合液，得到阳性待测品，阳性待测品的浓度为105copies/mL。阴性对照为不含单纯疱疹病毒基因、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒基因、JC病毒基因及EB病毒基因的生理盐水。
(2)待提取样品共12例，分别为3例单纯疱疹I型病毒样本，1例卡波氏肉瘤相关疱疹病毒样本，3例JC病毒样本，4例EB病毒样本，1例A2型柯萨奇病毒样本，2例腺病毒3型样本和1例麻疹病毒样本，所有样本均来自于疾控中心。采用病毒RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)分别提取各待提取样品中的RNA，得到相应的待测样品。
(3)采用实施例1的试剂盒对阳性待测品、阴性对照待测品及步骤(2)的各待测样品进行多重荧光定量PCR检测，反应体系、反应条件和结果分析与实施例2相同。测定结果如图14～16所示。图14为实施例5中阳性待测品的扩增曲线图，箭头所指曲线为单纯疱疹病毒的扩增曲线，箭头所指曲线为卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的扩增曲线，箭头所指曲线为JC病毒的扩增曲线，箭头所指曲线为EB病毒的扩增曲线。图15为实施例5中阴性对照待测品的扩增曲线图。图16为实施例5中待测样品的扩增曲线图。
从图14～15可以看出，实施例1的试剂盒能够检测出阳性待测品中的四种病毒，阴性待测品不检出，说明实施例1的试剂盒具有较高的特异性。
从图16可以看出，通过实施例1的试剂盒对待测样品进行检测，能够检出有3例单纯疱疹病毒样本、2例卡波氏肉瘤相关疱疹病毒样本、1例JC病毒样本和2例EB病毒样本；A2型柯萨奇病毒、腺病毒和麻疹病毒未检出，检测样本准确率达100％。综上所述，上述实施方式的同时检测四种病毒的试剂盒能够对一管标本同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒四个项目，检测时间短，检测的灵敏度高、准确度高、特异性好、重复性好，对临床应用具有较高的指导意义。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 珞可为科技（武汉）有限公司
<120> 同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂盒及方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaccgaccc ggagagggac atcc 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggccaggcg cttgttggtg ta 22
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgccgaact gagcagacac ccgcgcgcgt 30
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgatgttct gagtacatag cggt 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catccgagga cgaaatggaa gtg 23
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agacaaattg ccagtagccc accaggaga 29
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attactaaac acagcttgac tgaggaa 27
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catttaatga gaagtgggat gaagac 26
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtagagtgt tgggatcctg tgttttcatc atca 34
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acccctgttt atccgatgga atgac 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agggcatgtg gtggcgccag cgtg 24
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaatgacggc gcatttctcg tgcgtgtaca ccg 33

Claims (10)

1.一种针对单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的四重荧光PCR检测用引物及探针，其特征在于，探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体序列如下：
单纯疱疹病毒：
单纯疱疹病毒上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，
单纯疱疹病毒下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，
单纯疱疹病毒探针：核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒：
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒探针：核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，
JC病毒：
JC病毒上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，
JC病毒下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，
JC病毒探针：核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，
EB病毒：
EB病毒上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，
EB病毒下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，
EB病毒探针：核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的针对单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的四重荧光PCR检测用引物及探针，其特征在于，所述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒探针上带有的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的至少一种；所述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒探针上带有的荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的针对单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的四重荧光PCR检测用引物及探针，其特征在于，所述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒探针上带有的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、VIC荧光染料、磺酰罗丹明或花菁5；所述荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1或黑洞淬灭剂2；
作为优选,单纯疱疹病毒探针的荧光报告基团为6-羧基荧光素，荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂1；卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的荧光报告基团为VIC荧光染料，荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂1；JC病毒探针的荧光报告基团为磺酰罗丹明，荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂2；EB病毒探针的荧光报告基团为花菁5，荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂2。
4.一种单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的四种病毒的检测用引物及探针，所述单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒探针上分别带有不同的荧光报告基团。
5.根据权利要求4所述的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在使用时按以下比例配制引物、探针混合液：单纯疱疹病毒扩增引物对与单纯疱疹病毒检测探针的摩尔比为3:1；卡波氏肉瘤相关疱疹病毒扩增引物对与卡波氏肉瘤相关疱疹病毒检测探针的摩尔比为2:1；JC病毒扩增引物对与JC病毒检测探针的摩尔比为2:1；EB病毒扩增引物对与EB病毒检测探针的摩尔比为3:1；单纯疱疹病毒检测探针、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒检测探针、JC病毒检测探针、EB病毒检测探针的摩尔比为3:2:2:3。
6.根据权利要求4所述的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，其中阴性对照品为不含有单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的生理盐水溶液；阳性对照品包括含有由如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示序列扩增获得的单纯疱疹病毒靶序列的质粒、含有由如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示序列扩增获得的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒靶序列的质粒、含有由如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示序列扩增获得的JC病毒靶序列的质粒和含有由如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示序列扩增获得的EB病毒靶序列的质粒。
7.根据权利要求4所述的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶中的至少一种，所述PCR反应液包括220mM～280mM的Tris-base、质量百分含量为0.2％～0.3％的TritonX-100和20mmol/L～30mmol/L的MgCl2；所述酶为Taq酶。
8.根据权利要求4所述的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR反应液包括250mM的Tris-base、质量百分含量为0.25％的TritonX-100和25mmol/L的MgCl2。
9.权利要求4-8任一项所述的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒在制备检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂中的应用。
10.一种单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的联合检测方法，其特征在于，所述检测方法是非诊断非治疗目的，包括以下步骤：
(1)提取待检样品的DNA；
(2)以待测样品DNA为模板，加入权利要求4-8任一项所述的单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒联合检测试剂盒中的各组分进行多重荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析，如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为对应病毒为阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，Ct值≤38，则对应的病毒判定为阳性；
上述在同一反应中检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的联合检测方法中多重荧光PCR扩增反应的反应条件为：93℃～95℃预变性2min～10min；93℃～95℃变性10s～30s，55℃～60℃退火、延伸、信号采集30s～60s，循环40次～45次。
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