CN115948617A - 检测血源性传播病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及戊型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、艾滋病毒的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病毒上的靶点，对不同病毒进行检测，从而在单管反应体系中同时实现戊型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、艾滋病毒的检测和区分。特别地，检测血液制品中是否存在这些病毒，确保血液制品的安全性。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，检测更为准确。

Description

检测血源性传播病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及戊型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、艾滋病毒的检测。

背景技术

戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)在分类学上属于戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属，HEV是单股正链RNA病毒，呈球形、直径27～34nm无囊膜，核衣壳呈二十面体立体对称。HEV的潜伏期从发生暴露后的2周到10周不等，平均5-6周。感染者从发病前几天到发病后3-4周排出病毒。在高流行区，有感染症状的病例最常发生在15－40岁的年轻成人中间。戊型肝炎是当今发展中国家的主要肝炎之一，严重危害人类健康，近年来发病率呈迅速上升趋势。我国制定的《传染病防治法》已将戊型肝炎列为主要肝炎之一。近年来发病的绝对数和发病率均呈连续、快速增长态势。

登革病毒(Dengue Virus)属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。登革热在全球呈急剧上升势态，全球有近40％人口处于登革热发生的风险区，是全球主要的公共卫生问题之一。按照原国家卫生计生委发布的《登革热诊断标准》(WS 216-2018)，登革病毒的检测方法包括病毒核酸检测、病毒分离、血清抗体检测3种，而在血液筛查方面，DENV病毒核酸检测可以增加用血安全。

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一种蚊媒病毒，属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，寨卡病毒病是由寨卡病毒引起的自限性急性传染病，主要通过蚊虫(埃及伊蚊)传播，可通过输血传播，目前已有可能经输血传播的病例报告。大多数寨卡病毒感染者不会出现症状，临床特征表现为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，极少引起死亡，此外，寨卡病毒感染可能在成人中引起严重的神经系统疾病，而孕期感染可能导致严重的出生缺陷。

人类免疫缺陷病毒(Human Immune deficiency Virus，HIV)感染是由两种逆转录病毒HIV-1或HIV-2所导致的，而艾滋病是由HIV感染的获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmune Deficiency Syndrome AIDS)的简称。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原。HIV-1通过输血、注射或性接触等途径传播。

上述血流感染病毒戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)，登革病毒(DengueVirus，DENV)，寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)，人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)导致人体免疫功能降低甚至死亡。血液和血液制品因其在急救治疗和防治疾病中具有良好的效力，在临床上应用广泛，且在出入境特殊物品的占比较大，因此需确保血液及血液制品的安全，最大限度地降低经血传播疾病的危险，特别是经血液传播的某些病毒，不仅感染率高且危害非常严重，一直是世界各国关注的重大问题。虽然一些高致病性病毒可能具有低流行率或在季节或在地理上的限制因素，与血液安全性相关性不强。然而，血液制品在输血传播过程中的感染则可能影响高度脆弱的人群，如新生儿、老年人或免疫功能低下者，从而造成致命的后果。世界卫生组织(WHO)已正式将血液安全列为全球重点卫生工作之一。而HEV、DENV、ZIKV、HIV-1这四种病毒均存在通过血液传播的风险。且有HIV合并其他病毒感染的报道，其临床症状轻微。

因此本领域迫切需要一种简便、快速、客观的检测上述病毒的产品，从而实现明确病原、及早诊断、避免假阳性的结果而导致过多的血液感染，确保血液安全。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测血源性传播病毒的组合物，包括：

如SEQ ID NO:1～3所示的检测HEV的上下游引物及探针；

如SEQ ID NO:4～6所示的检测DENV的上下游引物及探针；

如SEQ ID NO:7～9所示的检测ZIKV的上下游引物及探针；以及

如SEQ ID NO:10～12所示的检测HIV-1的上下游引物及探针。

本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病毒上的靶点，对不同病毒进行检测，从而在单管反应体系中同时实现戊型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、艾滋病毒的检测和区分，降低检测劳动强度和成本。特别地，检测血液制品中是否存在这些病毒，确保血液制品的安全性。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，检测更为准确。

进一步地，所述组合物包括检测内标的上下游引物及探针。

在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。

进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

在一些具体的实施方案中，HEV探针的荧光报告基团为FAM；DENV探针的荧光报告基团为HEX(或VIC)；ZIKV探针的荧光报告基团为ROX；HIV-1探针的荧光报告基团为CY5。

进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。

在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。

进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。

在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。

进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μM；所述组合物中探针的用量为0.1～0.2μM。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备血源性传播病毒联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病毒是戊型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、艾滋病毒。

第三方面，本发明提供了一种血源性传播病毒联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H₂O、生理盐水、内标基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是戊型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、艾滋病毒的片段质粒、片段RNA或片段DNA、假病毒中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UDG)、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是Neoscript RT逆转录酶或MMLV酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、Mg²⁺、Mn²⁺、Rnasin、dNTP(U)s、引物、探针和PCR缓冲液。

常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl₂、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。

第四方面，提供了一种用于血源性传播病毒联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样本可以是血清、血液等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

预变性和酶激活，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的的血源性传播病毒联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

预变性和酶激活，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病毒并罹患这些疾病等的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中(例如血液)检测是否有上述病毒。

附图说明

图1为本发明组合物的检测结果图；

图2～5为本发明组合物灵敏度检测结果图(分别为戊型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、艾滋病毒)；

图6为本发明组合物特异性检测结果图；

图7～10为本发明对比例组合物(1～4)检测结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

表1

其中，HEV-P探针的荧光报告基团为FAM；DENV-P探针的荧光报告基团为HEX；ZIKV-P探针的荧光报告基团为ROX；HIV-P探针的荧光报告基团为CY5。

实施例2、检测血源性传播病毒的方法

荧光PCR扩增反应液：含有PCR buffer(S09)、Mg²⁺、dNTPs、Rnasin、0.1％DEPC水、引物、探针等。本实施例中反应体系如表2所示：

表2

PCR扩增

在SLAN-96P全自动医用PCR分析系统上，按照一定的温度、时间设置程序进行PCR扩增。本发明的优选方案为表3所示。

表3

检验结果的解释

反应结束后自动保存结果，对检测靶标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。

质量控制:

阴性对照：FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道均无Ct值或Ct＞40；

阳性对照：FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道均Ct≤35；

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

阳性判断值

通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为40

检验结果的解释

表4各通道检测项目

PCR检测通道	检测项目
		FAM	HEV
HEX	DENV
		ROX	ZIKV
CY5	HIV-1

根据上述的检测结果，判断结果如下：

表5结果判读

实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果

将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对HEV/DENV/ZIKV/HIV-1病毒样本进行验证，结果表明该组合物能够对HEV/DENV/ZIKV/HIV-1病毒进行联检并区分，检测结果如图1所示。

实施例4、本发明组合物的灵敏度

使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如图2～5所示，表明对低至500拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为500拷贝/mL。

实施例5、本发明组合物的特异性

为了测试本发明实施例1中的组合物的空白特异性，以阴性对照为样本，按照上述操作步骤进行检测。结果如图6显示，各靶标通道均无非特异扩增，试剂盒的空白特异性好。

对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针

由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病毒联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。

因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系1～4，同样用于检测上述病毒，具体检测结果如图7～10所示，结果表明，此检测体系只出现部分扩增曲线，且扩增效率显著降低，且存在其他靶标无扩增曲线，因此，整体检测效果差。

Claims (10)

1.一种检测血源性传播病毒的组合物，包括：

如SEQ ID NO:1～3所示的检测HEV的上下游引物及探针；

如SEQ ID NO:4～6所示的检测DENV的上下游引物及探针；

如SEQ ID NO:7～9所示的检测ZIKV的上下游引物及探针；以及

如SEQ ID NO:10～12所示的检测HIV-1的上下游引物及探针。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，HEV探针的荧光报告基团为FAM；DENV探针的荧光报告基团为HEX；ZIKV探针的荧光报告基团为ROX；HIV-1探针的荧光报告基团为CY5。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上下游引物及探针。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备血源性传播病毒联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病毒是戊型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、艾滋病毒。

7.一种血源性传播病毒联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

10.一种以非诊断目的检测并区分血源性传播病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

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