CN116042918B - 五种病毒联检组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒的联检并进行区分的组合物、方法和用途。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒的检测和区分。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到200拷贝/mL，检测更为准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒的联检并进行区分的组合物、方法和用途。
背景技术
猴痘病毒是一种双链DNA病毒，属于人畜共患病。猴痘病毒与天花病毒同属痘病毒科，感染的症状与天花相似，如发热、咳嗽、淋巴结肿大和全身疼痛，可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液、呼吸道飞沫传播，毒力强的病毒株有可能致死。WHO扩大了对非流行国家的监测，现有信息表明，与有症状的病例发生密切身体接触的人群中正在发生人际传播，现在越来越多的人不再对猴痘病毒具有免疫力。
“番茄流感”或称“番茄热”，是罕见病毒性疾病。“番茄流感”的名字源于患儿身体上出现的像番茄一样的水泡。其症状还包含高烧、恶心、腹泻、脱水、关节肿胀和身体疼痛等。“番茄流感”传染力较强，主要感染人群是5 岁以下免疫力较低的儿童。有研究人员将番茄流感引起的红疹水泡，与猴痘引起的水疱作比较；并将发烧的症状与登革热、儿童基孔肯尼亚热、手足口病等作比较，他们认为番茄流感可能是后三者的后遗症，而不是一种全新的疾病。
一种临床表现可由多个病原体引起，为临床早期诊断带来了困难，不同的病毒其临床治疗方式可能不一样。对于易感染病毒而言，需要尽早发现，尽早治疗，且及时控制传染源，阻断传播途径。区分这些病毒感染，对后续的防控、治疗以及采取针对性的措施提供指导，因此本领域需求一种能够同时检测并区分多种病毒的相关产品。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种五种病毒联检的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测登革热病毒的探针和上下游引物；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测基孔肯雅病毒探针和的上下游引物；
如SEQ ID NO:7～9所示的检测带状疱疹病毒的探针和上下游引物；
如SEQ ID NO:10～12所示的检测肠道病毒的探针和上下游引物；以及
如SEQ ID NO:13～15所示的检测猴痘病毒的探针和上下游引物。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒的检测和区分。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到200拷贝/mL，检测更为准确。
进一步地，所述组合物包括检测内标的上下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。
在一些具体的实施方案中，用于检测内标的上下游引物及探针为如SEQ ID NO:16所示的内标探针、如SEQ ID NO:17所示的内标上游引物，和如SEQ ID NO:18所示的内标下游引物。
进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应6个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，可以包括上述6对引物和探针中的任意5对，可以包括上述6 对引物和探针中的任意4对，可以包括上述6对引物和探针中的任意3对，可以包括上述7对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述6对引物和探针中的任意1对。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
在一个具体的实施方案中，登革热探针的荧光报告基团为ATTO 425；基孔肯雅病毒探针的荧光报告基团为FAM；带状疱疹病毒探针的荧光报告基团为 ROX；肠道病毒的探针的荧光报告基团为CY5；猴痘病毒探针的荧光报告基团为Quasar705。
内标探针的的荧光报告基团为HEX。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μM；所述组合物中探针的用量为0.1～0.2μM。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备五种病毒联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病毒是猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒。
第三方面，本发明提供了一种五种病毒联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒靶基因的片段质粒、片段RNA或片段DNA、假病毒中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、 dUTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UDG)、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及 Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是Neoscript RT逆转录酶或MMLV酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、Mg2+、 Mn2+、Rnasin、dNTP(U)s、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于五种病毒联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是血清、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
UDG以及逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA 预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的的五种病毒联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
UDG以及逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA 预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染五种病毒并罹患手足口病和猴痘等的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有上述病原体。
附图说明
图1为本发明组合物检测结果图；
图2和3为本发明对比例组合物检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
表1
| 名称 | 检测靶点 | 序列及标记方式(5'-3') |
| SEQ ID NO:1 | DENV-P | TACATGTGGCTGGGAGCACG |
| SEQ ID NO:2 | DENV-F | TTAGGAGAGTTTGGAAAGGC |
| SEQ ID NO:3 | DENV-R | ATTCTCTCTRCTAAACCAGTGATCTT |
| SEQ ID NO:4 | CHIKV-P | CATCTGCATCAGCTAAGCTCCG |
| SEQ ID NO:5 | CHIKV-F | ACGCTGAAAACACGCAGTT |
| SEQ ID NO:6 | CHIKV-R | TACAGTGATGTTATTTCCTTGGTAAAG |
| SEQ ID NO:7 | VZV-P | CTCGAACACCCATCTCTTCTCAAGA |
| SEQ ID NO:8 | VZV-F | TGTGCATTTAGGCAACGAT |
| SEQ ID NO:9 | VZV-R | TGCTATCGGCTAAACTCCA |
| SEQ ID NO:10 | EV-P | AGCGGAACCGACTACTTTGGGT |
| SEQ ID NO:11 | EV-F | GCTAATCCYAACTGCGGAGC |
| SEQ ID NO:12 | EV-R | GTAACAATCTYTCAATTGTCACCAT |
| SEQ ID NO:13 | MPV-P | TCCGTCAATGTCTACACAGGCATAAAA |
| SEQ ID NO:14 | MPV-F | AACCCTGTCACCGTTATTA |
| SEQ ID NO:15 | MPV-R | GATTTTCCATCTGCCTTAT |
| SEQ ID NO:16 | IC-P | TTCTGCCACTCGTGCCTCCTGTAA |
| SEQ ID NO:17 | IC-F | CTGGGCCATTATTATTTCCAACC |
| SEQ ID NO:18 | IC-R | TGCTGAGCTAGAGCTGGTG |
其中，SEQ ID NO：1登革热病毒探针的荧光报告基团为ATTO 425；SEQ ID NO：4基孔肯雅病毒探针的荧光报告基团为FAM；SEQ ID NO：7带状疱疹病毒的荧光报告基团为ROX；SEQ ID NO：10肠道病毒的荧光报告基团为CY5， SEQ ID NO：13猴痘病毒的荧光报告基团为Quasar705，SEQ ID NO：16内标的荧光报告基团为HEX。
实施例2、五种病毒联检的方法
本发明检测样本为血清、血液。使用圣湘生物科技股份有限公司的样本释放试剂(货号：S1014)或核酸提取或纯化试剂(货号：S10025)按说明书提取血清样本中的病原体核酸。
核酸提取或纯化试剂(货号：S10025)磁珠法提取病毒核酸，在样本处理室进行如下操作：
2.1根据待测样本数量取1.5mL离心管若干，每管加入300μL样品；
2.2加入500μL提取溶液1和50μL蛋白酶K-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s，60℃加热10min。
2.3室温静置1min，低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后缓慢吸弃废液(*注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠)；
2.4加入200μL洗涤液1和600μL洗涤液2，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃。
2.6将离心管至于离心机中低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将管底液体完全吸尽。
2.7加入30～100μL洗脱液S(推荐使用80μL洗脱)，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置3min；低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5mL离心管中。
2.8吸取上述处理好的样本、阳性对照及阴性对照各10μL分别加入对应的 0.2mLPCR反应管中，每管加入40μL PCR混合液，盖上管盖。
实时荧光PCR反应体系按照如下表2进行配置：
表2
PCR扩增程序如下表3进行设置：
表3
如果该样本ATTO 425，FAM，ROX，CY5，Quasar705通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤40，则判为阳性；如果该样本ATTO 425，FAM，ROX，CY5， Quasar705通道无扩增曲线(NoCt)或Ct值＞40，且HEX(VIC)内标通道为阳性(Ct值≤40)，则判为阴性。具体如下表4所示。
表4、检测结果解读
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒的假病毒样本进行验证，结果表明能够对猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒进行检测和区分，检测结果如图1所示。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
将上述5种病原体质粒分别使用血清阴性样本梯度稀释至 2.00E+04copies/ml、2.00E+03copies/ml、2.00E+02copies/ml、1.00E+02copies/ml 作为待测样本，每个梯度重复测试20次，使用实施例2进行检测，以95％检出水平作为本试剂盒最低检测限，结果如表5-9所示，表明对低至200拷贝/mL 的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为200拷贝/ml。
表5、登革热病毒检测限确定检测结果表
表6、基孔肯雅病毒检测限确定检测结果表
表7、带状疱疹病毒检测限确定检测结果表
表8、肠道病毒检测限确定检测结果表
表9、猴痘病毒检测限确定检测结果表
/>
实施例5、本发明组合物的特异性
交叉反应以核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体样本作为待测样本，样本信息如下表10所示：
表10、交叉特异性样本信息
/>
SLAN-96S仪器上检测，通过检测阴阳性符合率，考查试剂盒的特异性。试验结果如下表11所示：
表11、交叉样本检测结果表
| 病原体名称 | 检测结果 |
| 副流感病毒 | 阴性 |
| 腮腺炎病毒 | 阴性 |
| 风疹病毒 | 阴性 |
| 诺如病毒 | 阴性 |
| 黄热病毒 | 阴性 |
| 人疱疹6型 | 阴性 |
| 单纯疱疹病毒1型 | 阴性 |
| 单纯疱疹病毒2型 | 阴性 |
| 巨细胞病毒 | 阴性 |
结论：交叉反应样本检测结果均为阴性，表明本试剂盒具有很好的特异性实施例6、本发明组合物的抗干扰性和稳定性
为考察样本中可能存在的内源/外源性物质对检测结果的影响，将已定值的本试剂组合待检的五种病原体定量参考品稀释至最低检测限，分成若干份，每份中分别加入下表中所列的可能存在抑制物/干扰物质，通过用样本稀释干扰物的方法调节干扰物质终浓度如表12所示，以仅添加阴性稀释基质(不含干扰物) 的待测样品为参照。
表12、干扰物质信息
在SLAN-96S仪器上检测，每个样本重复检测3次，通过与对照样本的比较，考查试剂盒的抗干扰能力。试验结果如表13所示。
表13、干扰物质信息检测结果表
/>
结论：由上述结果可以看出，含各种上述干扰物质的样本经三批试剂重复 3次检测均为阳性，且Ct值与对照无明显区别，因此可以说明在本试剂盒的实验条件下，样本中可能存在的上述干扰物质对试剂盒的检测结果无明显干扰。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系，同样用于检测猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒。具体检测结果如图2和3所示，结果表明，此检测体系只出现部分扩增曲线，且扩增效率显著降低，且存在其他靶标无扩增曲线，如图2所示。而且NTC非特异性实验表明，存在部分靶点非特异性起线，如图3所示，因此，整体检测效果差。
Claims (10)
1.一种五种病毒联检的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测登革热病毒的探针和上下游引物；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测基孔肯雅病毒的探针和上下游引物；
如SEQ ID NO:7～9所示的检测带状疱疹病毒的探针和上下游引物；
如SEQ ID NO:10～12所示的检测肠道病毒的探针和上下游引物；以及
如SEQ ID NO:13～15所示的检测猴痘病毒的探针和上下游引物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括用于检测内标的上下游引物及探针，所述检测内标的上下游引物及探针为如SEQ ID NO:16所示的内标探针、如SEQ ID NO:17所示的内标上游引物，和如SEQ ID NO:18所示的内标下游引物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述登革热病毒探针的荧光报告基团为ATTO 425；所述基孔肯雅病毒探针的荧光报告基团为FAM；所述带状疱疹病毒探针的荧光报告基团为ROX；所述肠道病毒的探针的荧光报告基团为CY5；所述猴痘病毒探针的荧光报告基团为Quasar705。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述内标探针的荧光报告基团为HEX。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
7.权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备五种病毒联检的试剂盒中的用途，其中，所述五种病毒为猴痘病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒。
8.一种五种病毒联检的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～6中任一项所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种用于以非诊断目的的五种病毒联检的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～6中任一项所述的组合物或如权利要求8或9所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
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