CN113943836B

CN113943836B - 检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物、试剂盒、方法及用途

Info

Publication number: CN113943836B
Application number: CN202111356118.4A
Authority: CN
Inventors: 陈晓亮; 任小梅; 邓中平; 刘佳; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2021-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2041-11-16
Also published as: WO2023087868A1; US20230374615A1; EP4225952A1; CN113943836A

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域；具体地，属于引起呼吸道感染的病原体的检测领域；更具体地，本发明能够同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、鼻病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒和肺炎支原体。使用本发明的组合物，能够同时检测6种引起呼吸道感染的病原体并进行鉴定具体是某种或某几种病原体感染。与此同时，其检出率相比已有的组合物的检出率更高，检测更为准确。

Description

检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物、试剂盒、方法及用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域；具体地，属于引起呼吸道感染的病原体的检测领域；更具体地，本发明能够同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、鼻病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒和肺炎支原体。

背景技术

呼吸系统感染性疾病大多数是临床上的常见病、多发病。该类疾病具有相似的临床症状和流行特征，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病原体种类。呼吸道病原体可以通过空气传播，引起急性呼吸道病的的病原体具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点，可引起广泛的急性上呼吸道和下呼吸道疾病，严重危害人类的健康。常见的呼吸道病原体包括：

流行性感冒病毒(influenza virus)，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。禽流感(avian influenza；AI)是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的某种亚型(也称禽流感病毒)引起的传染性疾病。在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，流行性感冒病毒属(Influenza virus)，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)属副黏病毒科肺炎属的RNA病毒，临床研究表明，呼吸道合胞病毒是引起病毒性肺炎的最常见的病原，多见于三岁以下的婴幼儿，主要症状有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。

腺病毒(Adenoviruses，Adv)属于腺病毒科(Adenoviridae)，根据免疫学、生物学、生物化学特性不同，将其分为A～G 7个亚种，共有52个血清型，不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现，对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染。

人鼻病毒(Human Rhinovirus，HRV)是一种无包膜的单链RNA病毒，属于微小核糖核酸病毒科肠道病毒属。人鼻病毒与肠道病毒(Enterovirus)具有相同的形态结构和基因组结构，都是呈球形，直径为15—30nm；核衣壳呈20面体立体对称，无包膜；基因组是单链、正链RNA长约7500个核苷酸，其中只有一个读码框，长约6500个核苷酸；读码框的开读部位位于5′端611个核苷酸处，终止密码位于聚A尾前42个核苷酸处。人鼻病毒它是一种传染性强、无处不在的病毒，它的传播通常是通过直接接触呼吸液滴/微液滴发生的，它也可通过污染表面进行，包括人与人之间的直接接触。HRV有三个不同的亚组A、B和C组成分别有80、30和56种类型，是人类感染病毒中血清型最多的病毒。HRV的遗传多样性(>150种类型)使得开发有效疫苗非常困难，人感染后可获得一定程度的免疫保护，但由于众多HRV血清型的存在，既往感染不能导致完全免疫，仍可有其他血清型导致再次感染。HRV是导致“普通感冒”的主要原因，主要表现为鼻漏、喉咙痛、咳嗽和不适。HRV还会引起许多其它呼吸道疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、中耳炎、咽峡炎、肺炎和急性毛细支气管炎。并且HRV容易与其它呼吸道病毒合并感染而加重患者病情，多见于与呼吸道合胞病毒、腺病毒等，严重影响患者的生活质量。

肺炎支原体(Mycoplasma Pneumonia,MP)是社区获得性肺炎的常见病原体，感染MP后可引起非典型性肺炎(Atypical pneumonias)，病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。临床症状较轻，大多数患者只有头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状；少数会持续高热不退，剧烈咳嗽，病情进展快，短时间内出现呼吸衰竭，多器官功能性障碍等危重症变现。

而现有技术存在一些检测呼吸道感染病原体的技术，例如中国发明专利CN113186342A，其可以检测18种病原体；CN111074001A，其可以检测9种病原体。但是这些技术仍然面临着由于待检的病原体太复杂，从而检出率和准确性不佳的情况。

因此，本领域需要一种检测试剂盒，其能够快速并准确地检测最常见的呼吸道感染病原体，并且检出率、准确性、灵敏度高。

发明内容

有鉴于此，需要针对不同的毒株的检测进行具体设定，从而提高检出率和准确性。举例来说，对于鼻病毒的核酸检测，由于人鼻病毒和肠道病毒均属于肠道病毒属，很多检测试剂或检测方法均对人鼻病毒和肠道病毒不进行区分或者进行区分但特异性不好。其它试剂对鼻病毒不能进行准确检测的原因，是由于其设计引物探针时，只考虑到了肠道病毒属5’未端非翻译区域的保守性，从而不能很好的区分鼻病毒和肠道病毒。发明人针对不同突变类型的鼻病毒基因序列进行设计，同时设计了2个既能覆盖鼻病毒不同突变类型的，又能对肠道病毒无非特异性结合的探针，采用这2个序列完全不同、荧光标记相同的探针，准确有效的对鼻病毒进行检测。

举例来说，对于呼吸道腺病毒的检测，由于腺病毒有52个血清型，能造成人体呼吸道感染的有3型、7型、11型、14型、16型、21型、34型、35型、50型和55型等，且由2个或多个腺病毒株重组可产生新型的腺病毒，为保证检测结果的准确性，针对腺病毒不同基因型设计了2条上游引物和2条相同荧光标记的探针。

第一方面，本发明提供了一种能够检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物，所述组合物包括：

第一核酸组合物：

如SEQ ID NO:1所示的甲型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:2所示的甲型流感病毒下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的甲型流感病毒探针；

如SEQ ID NO:4所示的乙型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:5所示的乙型流感病毒下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的乙型流感病毒探针；

如SEQ ID NO:7所示的鼻病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的鼻病毒下游引物，如SEQ ID NO:9所示的鼻病毒探针，和如SEQ ID NO:10所示的鼻病毒探针；和

第二核酸组合物：

如SEQ ID NO:11所示的呼吸道腺病毒上游引物、如SEQ ID NO:12所示的呼吸道腺病毒上游引物、如SEQ ID NO:13所示的呼吸道腺病毒下游引物、如SEQ ID NO:14所示的呼吸道腺病毒探针，和如SEQ ID NO:15所示的呼吸道腺病毒探针；

如SEQ ID NO:16所示的呼吸道合胞病毒上游引物、如SEQ ID NO:17所示的呼吸道合胞病毒下游引物，和如SEQ ID NO:18所示的呼吸道合胞病毒探针；

如SEQ ID NO:19所示的肺炎支原体上游引物、如SEQ ID NO:20所示的肺炎支原体下游引物，和如SEQ ID NO:21所示的肺炎支原体探针；

其中，第一组内的荧光基团彼此互不相同且互不干扰，并且第二组内的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:22所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:23所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:24所示的内标探针。

在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。

在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:3所示的甲型流感病毒探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的乙型流感病毒探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:9和10所示的人鼻病毒探针的荧光报告基团为CY5。

在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:14和15所示的呼吸道腺病毒探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:18所示的呼吸道合胞病毒探针的荧光报告基团为HEX；如SEQID NO:21所示的肺炎支原体探针的荧光报告基团为CY5。

在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:24所示的内标探针的荧光报告基团为ROX。

内标检测人管家基因GAPDH基因序列的引物和探针。GAPDH基因序列序列(SEQ IDNO:25)为：

GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTCTGCCCCCTCTGCTGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCATGAGAAGTATGACAACAGCC

进一步地，所述组合物中检测引物的用量为0.2～0.4pM；所述组合物中检测探针的用量为0.1～0.3pM；所述组合物中内标引物的用量为0.2pM；所述组合物中内标探针的用量为0.1pM。

在本发明中，术语“检测引物”和“检测探针”是指用于扩增并检测病原体的引物和探针。

在本发明中，术语“内标引物”和“内标探针”是指用于扩增并检测内标的引物和探针。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的两个核酸组合物分别存在于单独包装中。

进一步地，本发明的组合物的每一核酸组合物中的各成分以混合的形式存在。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的试剂盒中的用途。

所述引起呼吸道感染的病原体包括：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、人鼻病毒、呼吸道合胞病毒和肺炎支原体。

第三方面，本发明提供了一种检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂和PCR扩增体系。

进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl₂、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20～200μl。

进一步地，所述组合物中检测引物的用量为25～500nM；所述组合物中检测探针的用量为20～500nM；所述组合物中内标引物的用量为12.5～250nM；所述组合物中内标探针的用量为10～250nM；所述dNTP的用量为0.2～0.3mM。

进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/μL～15U/μL，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为5U/μL～15U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。

进一步地，试剂盒中含有阳性对照和阴性对照，且阴阳性对照与待测标本需同步处理。阳性对照中由含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、人鼻病毒和呼吸道合胞病毒特定核酸序列、人工合成的慢病毒颗粒与含有腺病毒和肺炎支原体特定核酸序列、人工合成的质粒混合而成，模拟实际临床标本；阴性对照由含有GAPDH管家基因目的片段(SEQ ID NO:25)，人工合成的慢病毒颗粒组成，完全模拟正常人的咽拭子标本。

第四方面，提供了一种用于检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的方法，所述方法包括以下步骤：

1)释放待测样本的核酸；

2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

预变性和酶激活，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；逆转录，温度为60℃，时间25～35分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10～20秒，退火，温度为60℃，时间为20～40秒，40～50次循环。

在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的方法，所述方法包括以下步骤：

1)释放待测样本的核酸；

3)获得并分析结果。

使用本发明的组合物，能够同时检测6种引起呼吸道感染的病原体，简便、快速、客观的对呼吸道病原体进行检测，从而实现明确病原、及早诊断、合理指导临床用药，减少医疗资源的浪费，降低患者和社会的心理负担。与此同时，其检出率比已有的呼吸道病原体检测组合物的检出率更高，检测更为准确。

本发明的组合物，结合荧光探针法，能够使用两个管在一次试验中同时，其成本低，通量高。使得单次试验一管能给出4个靶点的信息，并且操作简便，结果读取过程通过CT值即可以判定。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。

附图说明

图1为本发明组合物检测结果图；

图2～7为本发明组合物灵敏度；

图8～9为本发明组合物特异性；

图10A为本发明组合物效果，10B为如果以SARS-CoV-2代替本发明中的呼吸道合胞病毒时的效果；

图11A为本发明组合物效果，11B为如果以偏肺病毒代替本发明中的鼻病毒时的效果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

本发明所使用的引物及探针如下表1所示(SEQ ID NO:1～24仅对应碱基序列，此处标记方式仅为具体实例)：

表1

实施例2、检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的方法

本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。磁珠法提取病毒核酸，在样本处理室进行如下操作：

2.1取适量1.5mL灭菌离心管，分别标记阴性对照、阳性对照及待测样本，每管加入300μL RNA提取溶液1；

2.2每管加入200μL待测样本或阴性对照、阳性对照；盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；

2.3每管加入100μL RNA提取溶液2-mix(充分混匀后吸取)，震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟；

2.4瞬时离心后将离心管置于分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；

2.5每管加入600μL RNA提取溶液3和200μL RNA提取溶液4，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

2.6约3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃。

2.7每管加入50μL TE buffer(pH8.0)进行洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液作为待测样本转移至0.2mL PCR反应管中，盖上管盖，转移到扩增检测区。

实时荧光PCR反应体系按照如下进行配置：

PCR反应体系A：

PCR反应体系B：

酶混合液由Neoscript RT逆转录酶和H-Taq酶组成。将H-Taq酶(15U/μL)和Neoscript RT酶(18U/μL)按照一定比例混合而成(每人份为1μL H-Taq酶与0.5μLNeoscript RT酶混合)。

PCR扩增程序如下进行设置：

结果分析：

1)目的检测信号为FAM、HEX(或VIC)及CY5，内参检测信号为ROX；

2)Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。

如果该样本FAM、HEX及CY5通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤40，则判为阳性；如果该样本FAM、HEX及CY5通道无扩增曲线(No Ct)或Ct值＞40，且ROX内标通道为阳性(Ct值≤40)，则判为阴性。具体如下：

实施例3、本发明组合物的检出率

使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法进行检测，另外设计一系列对照(其它双探针方案：探针1：CY5-CTAACCTTAACCCCGCAGC-BHQ2；探针2：CY5-AATCCTAACCATGGAGCAAG-BHQ2)同样进行检测。检测结果如表2和表3所示。

表2、不同鼻病毒检测方案Ct值结果统计表

注：Ct值越大，检测效果越差，No Ct表示阴性。

从上表的检测结果可以看出，采用本专利方案进行检测，不会检出肠道病毒(Coxsackievirus EV71、Coxsackievirus A6)；同时，对于鼻病毒阳性样本，采用本专利方案进行检测，其Ct值均较小，表明其检测效果优于其它双探针方案和单探针方案。

表3、不同腺病毒检测方案Ct值结果统计表

注：Ct值越大，检测效果越差，No Ct表示阴性。

从上表的检测结果可以看出，采用本发明组合物进行检测，22例阳性样本均能检出；当无引物SEQ ID NO:12时，2例阳性样本未检出；当无探针SEQ ID NO:15时，6例阳性样本未检出；当无SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15时，13例阳性样本未检出。

实施例4、本发明组合物的灵敏度

使用本发明的组合物对六种病原体进行检测，其检测结果如图1所示。表明本发明的组合物能够对六种病原体进行检测。

除此之外，用不同浓度的样本进行实验，检测本发明组合物的灵敏度使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对各个靶标灵敏度阳性样本进行检测梯度稀释，以稀释到检测限的样本作为待测样本检测，每个通道检测20次。分析灵敏度试验结果表明，本试剂盒对甲型流感病毒、乙型流感病毒、人鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒及肺炎支原体检测限分别为：2.0TCID50/mL、2.0TCID50/mL、500.0拷贝/mL、500.0拷贝/mL、500.0拷贝/mL、500.0拷贝/mL，如图2-7所示。

实施例5、本发明组合物的特异性

将本发明的组合物用于检测其余的常见呼吸道病原体，实验发现本发明组合物对常见呼吸道病原体(麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、Ⅰ型人副流感病毒、偏肺病毒、肠道病毒71型、冠状病毒229E、巨细胞病毒、柯萨奇病毒A型、百日咳杆菌、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、唾液链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌、人副流感2型、3型病毒、EB病毒、隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、白念珠菌、嗜肺军团菌、博卡病毒、单纯疱疹病毒1型、水痘带状疱疹病毒、白喉棒状杆菌、保加利亚乳酸杆菌、卡他莫拉菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、肺孢子菌、肺炎克雷伯菌等)无交叉反应，实验结果如图8-9所示(图8为PCR反应体系A的结果，图9为PCR反应体系B的结果)。

实施例6、多种病原体联检，引物探针之间的相互干扰

由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。

本发明中，发明人以SARS-CoV-2代替本发明中的呼吸道合胞病毒，或者以偏肺病毒代替本发明中的鼻病毒，但经过试验，发现SARS-CoV-2和偏肺病毒的加入会严重影响到本发明所述方法的检测灵敏度(实验结果如图10-11所示)。

序列表

<110> 圣湘生物科技股份有限公司

<120> 检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物、试剂盒、方法及用途

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctcatggaa tggctaaaga caa 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agggcatttt ggacaaagc 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccgtgccc agtgagcgag ga 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcactcttcg agcgttttaa tgaag 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taatcggtgc tcttgaccaa at 22

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agccaattcg agcagctgaa actgcg 26

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcccctgaat gcggctaa 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaaacacgga cacccaaagt agt 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taatgagcaa ttgcgggatg ggacc 25

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctagtgcata caatccagtg tgtrgctag 29

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggatccacct caaaagtcat 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgggcggagt tggcgtaga 19

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gttaagagta ttacccagaa aaagtt 26

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acatgaagtt gctggagaag gggat 25

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cccatggaca taaagttact ggagaagg 28

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agaacaagat ggggcaaata tg 22

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tatgttgatg cttgcaagtt cttttat 27

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgtgaacaag cttcacgaag gctccaca 28

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccgtttctcc accgggtt 18

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gttttaggcg cggttatatc atc 23

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccctggattg ggaatgggta caggtatg 28

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggggagccaa aagggtcat 19

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ggctgttgtc atacttctca tggtt 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atctctgccc cctctgctga tgccc 25

<210> 25

<211> 90

<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

ggggagccaa aagggtcatc atctctgccc cctctgctga tgcccccatg ttcgtcatgg 60

gtgtgaacca tgagaagtat gacaacagcc 90

Claims

1.一种能够检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物，所述组合物包括：

第一核酸组合物：

如SEQ ID NO:7所示的鼻病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的鼻病毒下游引物，如SEQID NO:9所示的鼻病毒探针，和如SEQ ID NO:10所示的鼻病毒探针；和

第二核酸组合物：

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:22所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:23所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:24所示的内标探针。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，如SEQ ID NO:3所示的甲型流感病毒探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的乙型流感病毒探针的荧光报告基团为HEX；如SEQID NO:9和10所示的人鼻病毒探针的荧光报告基团为CY5。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中，如SEQ ID NO:14和15所示的呼吸道腺病毒探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:18所示的呼吸道合胞病毒探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:21所示的肺炎支原体探针的荧光报告基团为CY5。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物的两个核酸组合物分别存在于单独包装中。

7.如权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备检测引起呼吸道感染的病原体的试剂盒中的用途。

8.一种检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～6中任一项所述的组合物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂和PCR扩增体系。

10.一种组合物用于制备检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：

1)释放待测样本的核酸；

2)使用如权利要求1～6中任一项所述的组合物或权利要求8或9所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。