CN116790815A - 检测偏肺病毒的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子检测领域，具体涉及检测偏肺病毒的试剂盒。本发明研制的人偏肺病毒快速分型检测的试剂盒，应用于临床上可进行超快速检测分型。该快速分型检测试剂盒及应用对临床准确诊断人偏肺病毒和流行病学调查具有重要意义。本发明的试剂盒可用于分别检测人偏肺病毒A、B两种亚型，其所用引物的特异性强，各引物对之间没有交叉反应，与其它呼吸道感染病原体也没有交叉反应。试剂盒灵敏度较高，最低检测限可达到50copies/mL。检测速度快，加上核酸逆转录过程出结果不高于1h。适用于临床实验室定性或定量检测，极大的提升检测效率，节省了检测时间。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域，具体涉及检测偏肺病毒的试剂盒。
背景技术
人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)是2001年发现的一种与人类呼吸道感染之间存在病原学关系的新型副粘液病毒。由非节段的、单股负链RNA构成，在电镜下病毒颗粒呈现多形性，可分为A、B两个基因亚型。感染HMPV的临床表现很难与其他呼吸道病毒感染相区别，主要表现为流涕、发热、咳嗽、咳痰，亦可有气促、喘息等症状，年长者甚至有肌痛、头痛、乏力等全身症状。也有少数呈亚临床感染。HMPV感染主要发生在冬春季，各年龄阶段的人群都可受到感染，尤其是儿童、老年人和免疫缺陷患者。世界各国报道其感染率不尽相同，感染症状可从轻微的上呼吸道病变到严重的细支气管炎和肺炎。
目前检测HMPV病毒感染的主要方法包括病毒分离、血清学诊断、RT-PCR、酶联免疫扩增杂交分析等。HMPV的病毒分离比较困难，该病毒生长缓慢且有选择性，轻微致细胞病变作用以及缺乏特异性的诊断试剂，使得病毒的细胞培养很困难。基于特定核酸片段扩增的PCR技术在病原体的快速、高灵敏度检测方面逐渐成为一项不可替代的手段，发挥着非常重要的作用，目前已经有很多针对单个病原体检测的PCR试剂广泛应用到医学实践中。
但目前仍缺乏能够快速、准确、同时检测分型检测人偏肺病毒亚型的试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了检测偏肺病毒的试剂盒。
本发明提供了检测偏肺病毒的试剂盒。本发明研制的人偏肺病毒快速分型检测的试剂盒，应用于临床上可进行超快速检测分型。该快速分型检测试剂盒及应用对临床准确诊断人偏肺病毒和流行病学调查具有重要意义。本发明的试剂盒可用于分别检测人偏肺病毒A、B两种亚型，其所用引物的特异性强，各引物对之间没有交叉反应，与其它呼吸道感染病原体也没有交叉反应。试剂盒灵敏度较高，最低检测限可达到50copies/mL。检测速度快，加上核酸逆转录过程出结果不高于1h。适用于临床实验室定性或定量检测，极大的提升检测效率，节省了检测时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测偏肺病毒的引物探针组合，包括：
(Ⅰ)、引物具有如SEQ ID No.1～2、4～5、7～8、10～11、13～14任意所示的核苷酸序列；和
(Ⅱ)、探针具有如SEQ ID No.3、6、9、12、15任意所示的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少95％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物探针组合，包括：
用于检测偏肺A型病毒的引物探针的组合：
(Ⅰ)、所述引物具有如SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、所述引物具有如SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、所述引物具有如SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
用于检测偏肺B型病毒的引物探针的组合：
(Ⅳ)、所述引物具有如SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；或
(Ⅴ)、所述引物具有如SEQ ID No.13～14所示的核苷酸序列；和
所述引物具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物探针组合包括：
用于检测偏肺A型病毒的引物探针的组合：
所述引物具有如SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
用于检测偏肺B型病毒的引物探针的组合：
所述引物具有如SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述探针的5'端标记荧光报告基因，3'端标记淬灭基团；
所述荧光报告基因包括ROX、FAM、HEX或CY5中的一种或两种；
所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2和/或MGB。
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光报告基因包括ROX、FAM、HEX或CY5中的互不相同的两种。
在本发明的一些具体实施方案中，SEQ ID No.3、6、9所示核苷酸序列的探针的5'端标记荧光报告基团为ROX，3’端标记淬灭基团为BHQ2；
SEQ ID No.12、15所示核苷酸序列的探针的5'端标记荧光报告基团为FAM，3’端标记淬灭基团为MGB。
本发明还提供了试剂盒，包括所述引物探针组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒，还包括检测内标的引物探针的组合：
所述引物具有如SEQ ID No.16～17所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测内标的探针的5’端标记荧光报告基团与所述检测偏肺病毒的探针的5'端标记荧光报告基因互不相同且互不干扰。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒，SEQ ID No.18所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光报告基团为ROX、FAM、HEX和/或CY5，3’端标记淬灭基团为BHQ1和/或BHQ2。
在本发明的一些具体实施方案中，SEQ ID No.18所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光报告基团为HEX，3’端标记淬灭基团为BHQ1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒，还包括5×Buffer、dNTPs、5U/μL混合酶、样品RNA和/或dd H2O；
所述5×Buffer包括Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、醋酸锰；
所述混合酶包括反转录酶和DNA聚合酶。
在本发明的一些具体实施方案中，所述Tricine的浓度为0.5mol/L；所述KOAc的浓度为5mol/L；所述Tween20的浓度为0.5mmol/L；所述DMSO的浓度为8mmol/L；
所述dNTPs的浓度为125-375μmol/L。
在本发明的一些具体实施方案中，所述dNTPs的浓度为230μmol/L。
在上述研究的基础上，本发明还提供了同时分型检测偏肺病毒的方法，基于如下任意项对样品进行RT-PCR检测：
(Ⅰ)、所述引物探针组合；和/或
(Ⅱ)、所述试剂盒。
本发明还提供了非诊断目的的同时分型检测偏肺病毒的方法，基于如下任意项对样品进行RT-PCR检测：
(Ⅰ)、所述引物探针组合；和/或
(Ⅱ)、所述试剂盒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法，包括以下步骤：
步骤1：取待测样品；
步骤2：采用所述引物探针组合或所述试剂盒进行RT-PCR扩增，获得Ct值；
步骤3：根据所述Ct值及扩增曲线判断样品是否存在偏肺病毒；
所述判断标准包括：
ROX通道所述Ct值≤38且有明显S型扩增曲线，判为偏肺A型阳性；
FAM通道所述Ct值≤38且有明显S型扩增曲线，判为偏肺B型阳性；
ROX和FAM通道所述Ct值为无Ct或所述Ct值＞38且无扩增曲线，判为偏肺病毒阴性。
所述引物的浓度为125-500nmol/L；所述探针的浓度为70-250nmol/L。
优选地，所述引物的浓度为355nmol/L；所述探针的浓度为165nmol/L；
在本发明的一些具体实施方案中，所述RT-PCR的反应程序包括：
本发明提供的试剂盒可用于分别检测人偏肺病毒A、B两种亚型，其所用引物的特异性强，各引物对之间没有交叉反应，与其它呼吸道感染病原体也没有交叉反应。试剂盒灵敏度较高，最低检测限可达到50copies/mL。检测速度快，加上核酸逆转录过程出结果能控制在1h以内。适用于临床实验室定性或定量检测，极大的提升检测效率，节省了检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例5中偏肺A型病毒荧光定量PCR扩增曲线；
图2示实施例5中偏肺B型病毒荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
本发明公开了检测偏肺病毒的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明具体公开了一种超快速分型检测人偏肺病毒亚型的方法。本发明的试剂盒可用于分别检测人偏肺病毒A、B两种亚型，其所用引物的特异性强，各引物对之间没有交叉反应，与其它呼吸道感染病原体也没有交叉反应。试剂盒灵敏度较高，最低检测限可达到50copies/mL。检测速度快，加上核酸逆转录过程出结果能控制在1h以内。适用于临床实验室定性或定量检测，极大的提升检测效率，节省了检测时间。
1、人偏肺病毒A型F基因保守序列(SEQ ID No.19)：
ATCTTTGGCGTTATAGACACGCCTTGCTGGATAGTAAAAGCAGCCCCTTCTTGTTCCGAAAAAAAGGGAAACTATGCTTGCCTCTTAAGAGAAG ACCAAGGATGGTATTGTCAGAATACAGGGTCAACTGTTTACTACCCAAATGAGAAAGACTGTGAAACAAGAGGAGACCATGTCTTTTGCGACACAGCAGCAGGAATTAATGTTGCTGAGCAATCAAAGGAGTGCAACATCAACATATCCACCACAAATTACCCATGCAAAGTCAGCACAGGAAGGCATCCTATCAGTATGGTTGCACTGTCCCCTCTCGGGGCTCTGGTTGCCTGTTACAAAGGAGTAAGTTGTTCCATTGGCAGCAATAGAGTAGGGATCATCAAGCAGCTGAACAAAGGTTGCTCTTATATAACCAATCAAGATGCAGACACAGTGATAATAGACAACACTGTATATCAG
引物探针组合，其包括：
偏肺A型的正向引物，其核酸序列(SEQ ID No.4)：CAGCAGCAGGAATYAATGTTG；
偏肺A型的反向引物，其核酸序列(SEQ ID No.5)：GGATGYCTTCCTGTGCTGAC；
偏肺A型的探针，其核酸序列(SEQ ID No.6)：
ROX-5’-TGCTGAGCAATCAAAGGAGTGCAACATC-3’-BHQ2；
人偏肺病毒B型F基因保守序列(SEQ ID No.20)：
GTTGCACTATCACCTCTCGGTGCTTTGGTGGCTTGCTATAAAGGGGTAAGCTGCTCAATTGGCAGCAATCGGGTTGGAATCATCAAACAATTACCTAAAGGCTGCTCATATATAACTAACCAGGATGCAGACACTGTGACAATTGACAATACCGTGTATCAACTAAGCAAAGTTGAAGGTGAACAGCATGTAATAAAAGGGAGACCAGTTTCAAGCAGTTTTGATCCAATCAGGTTTCCTGAGGATCAGTTCAATGTTGCGCTTGATCAAGTCTTCGAAAGCATTGAGAACAGTCAGGCACTGGTGGAACAGTCAAACAAAATTCTAAACAGTGCAGAAAAAGGAAACACTGGCTTCATTATTGTAATAATTTTGGTTGCTGTTCTTGGTTTAACCATGATTTCAGTGAGCATCATCATCATAATCAAGAAAACAAAGAAGCCCGCAGGAGCACCTCCAGAGCTGAA
偏肺B型的正向引物，其核酸序列(SEQ ID No.10):
CTGTGACAATTGACAATACCGTGT；
偏肺B型的反向引物，其核酸序列(SEQ ID No.11):
GCGCAACATTGAACTGATCCTC；
偏肺B型的探针，其核酸序列(SEQ ID No.12):
5'FAM-AGACCAGTTTCAAGCAGT-3'MGB；
内标的序列(SEQ ID No.21)
CAGATACCGTCGTAGTTCCGACCATAAACGATGCCGACTGGCGATGCGGCGGCGTTATTCCCATGACCCGCCGGGCAGCTTCCGGGAAACCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAACCTCACCCGGCCCGGACACGGACAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTCGATTCCGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGA；
内标的正向引物，其核酸序列(SEQ ID No.16):
CCGTCGTAGTTCCGACCATA；
内标的反向引物，其核酸序列:
TCAGCTTTGCAACCATACTCC(SEQ ID No.17)；
内标的探针，其核酸序列(SEQ ID No.18)：
HEX-5’-ATGCCGACTGGCGATGCGGC-3’-BHQ1。
扩增的程序包括：
本发明提供的检测偏肺病毒的试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
通过对NCBI数据库中已有的人偏肺病毒核酸序列利用DNAman软件进行序列比对分析，选用人偏肺病毒F基因为扩增靶位点，因F基因亚型内具有高度保守且存在亚型间特异性强的特点。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，对偏肺病毒进行分型检测和鉴别，且能够实现同一样品中同时检测2种亚型。在引物设计过程中，应遵循以下原则，(1)应该避免引物5端前3-5个碱基为连续的G，而5端宜为C(或者为嘧啶)，引物3端最后3个碱基宜为G和C。(2)尽量避免引物中出现特殊序列，如重复出现的长串的某一碱基。(3)GC含量适中，不能过高(>70％)或过低(<30％)。(4)引物内或引物间的配对应尽量避免，防止引物二聚体的产生。(5)尽量避免引物二级结构的形成、防止引物间互作、避免形成发夹结构。同时，要实现各引物对之间均既要求没有交叉反应，又要充分保证引物扩增的特异性，设计合成了多对引物，进行充分验证，筛选扩增效果最佳的引物。
表1引物、探针序列
实施例2
用于RT-PCR快速同时分型检测人偏肺病毒的2种亚型的检测方法，其中ROX通道为偏肺A型产物扩增结果，FAM通道为偏肺B型产物扩增结果。具体包括以下步骤：
(1)利用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取及纯化试剂进行核酸的提取纯化，准备检测样本的RNA；
(2)对步骤(1)中RNA样品进行一步法RT-PCR扩增：反应体系采用30μL。在30μL反应体系中，其中包括：偏肺病毒A型的引物、偏肺病毒B型的引物、18S内标的引物,各引物的浓度可采用355nmol/L，用量为0.06μL，偏肺病毒A型的探针、偏肺病毒B型的探针、18S内标的探针,各探针的浓度可采用165nmol/L，用量为0.03μL，5×Buffer(Tricine的浓度为0.5mol/L、KOAc的浓度为5mol/L、Tween20的浓度为0.5mmol/L、DMSO的浓度为8mmol/L、醋酸锰的浓度为25mmol/L)12μL、230μmol/L的dNTPs 0.45μL、5U/μL混合酶(反转录酶和DNA聚合酶)0.4μL、样品RNA 15μL、dd H2O 1.7μL。上述均加入到0.2mL反应管中，并充分均匀。
之后放入PCR仪中，进行如下反应：50℃反转录2min；95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火15s(采光)，45个循环数；其中还设有阴性对照(无菌水)和阳性对照(人工合成的浓度1×104copies/mL的装甲RNA)。
(3)反应结束后，仪器自动保存结果，利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析，然后记录样本Ct值和定值结果。
根据报告的Ct值及扩增曲线判断样品是否存在人偏肺病毒，其中ROX通道有明显S型扩增曲线且CT值≤38，判为偏肺A型阳性；FAM通道有明显S型扩增曲线且CT值≤38，判为偏肺B型阳性；ROX和FAM通道无扩增曲线(CT值为无Ct)或CT值＞38，判为人偏肺病毒阴性。出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。
实施例3
对实施例1中偏肺A型3组引物探针进行筛选，采用实施例2中的反应体系，用ddH2O补全30μL反应体系。通过实施例2的方法对相同偏肺A型样本进行核酸检测，每个组合3个复孔，其中检测Ct值越小，表明引物探针扩增效率越好。偏肺A型组合检测Ct值如表2：
表2
结果分析：偏肺A型引物组合2，Ct值最小，表明偏肺A型引物组合2扩增效率较优。
对实施例1中偏肺B型2组引物探针进行筛选，dd H2O补全30μL反应体系。通过实施例2的方法对相同偏肺B型样本进行核酸检测，每个组合3个复孔，偏肺B型组合检测Ct值如表3：
表3
结果分析：偏肺B型引物组合1，Ct值最小，表明偏肺B型引物组合1扩增效率较优。
最终引物组合，如表4：
表4
实施例4
本发明试剂盒由实施例1的方法和实施例3的方法所得的最终引物组合(表4)完成配制。
采用实施例2的方法和实施例3的方法所得的最终引物组合，对采集的临床样本进行验证。对偏肺A型和偏肺B型各10临床阳性样本核酸及20例阴性样本进行验证，为保证试剂盒检测结果可信，要求偏肺A型样本ROX通道出值，FAM通道无Ct，偏肺B型样本FAM通道出值，ROX通道无Ct，阴性样本ROX和FAM通道均无Ct。检测结果表明，本发明试剂盒能正常检出偏肺A型和B型阳性样本，阴性样本无Ct，各样本的结果与临床确认结果一致，临床样本阴阳性符合率100％，表明本发明试剂盒分型准确，特异性强。试剂盒检测结果如表5：
表5偏肺试剂盒准确及特异性实验
实施例5
为确定本发明试剂盒的最低检测限，采用数字PCR方法对偏肺A型和偏肺B型的临床样本进行定值，HMPV A型临床样本的浓度分别为1.28×107copies/mL；HMPV B型临床样本的浓度分别为2.48×107copies/mL。将HMPV A型和偏肺B型的阳性样本进行系列稀释，每个稀释度样本的浓度如表6，通过采用实施例2的方法和实施例3的方法所得的和最终引物组合(表4)进行核酸检测，每个浓度2个复孔。
偏肺A型病毒荧光定量PCR扩增曲线及结果如表6，图1：
表6
结果分析：偏肺A型在50copies/mL能够正常出值，表明最低检测限达到50copies/mL。
偏肺B型病毒荧光定量PCR扩增曲线及结果如表7，图2：
表7
结果分析：偏肺B型在50copies/mL能够正常出值，表明最低检测限达到50copies/mL。
实施例6
本发明试剂盒检测靶标之外的交叉物质为临床样本中可能出现的其他呼吸道感染病原体。交叉病原体样本提取：将管中含有麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、EB病毒、百日咳杆菌、杰氏棒杆菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、甲型H1N1流感病毒(新型甲型H1N1流感病毒(2009)、季节性H1N1流感病毒)、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感Victoria、乙型流感Yamagata、唾液链球菌、表皮葡萄球菌、博卡病毒、乳酸杆菌、水痘-带状疱疹病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺孢子菌、呼吸道合胞病毒A、B型、人副流感病毒1、2、3、4型、鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、肠道病毒A、B、C、D组、冠状病毒(229E、OC43、NL63、HKU1)样本用移液器混匀,利用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取及纯化试剂进行核酸的提取纯化，采用实施例2的方法进行扩增，检测结果无Ct，表明本发明试剂盒与上述病原体不存在交叉反应。表8结果显示上述交叉病原体FAM和ROX通道均未出值(无Ct)，表明该试剂盒具有高特异性，与上述病原体无交叉。
表8交叉反应实验
实施例7
选取偏肺A型和B型低值样本各一例，分别将干扰物质粘蛋白、1％血液、氯化钠、地塞米松、盐酸组胺、H1N1甲型流感病毒毒株、薄荷脑、奥司他韦、莫匹罗星、妥布霉素、苯福林、羟甲唑、倍氯美松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、苯佐卡因、扎那米韦、利巴韦林、帕拉米韦，以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到偏肺A型和B型低值样本中，HMPV A型制备的系列干扰样本编号依次为S1-GR1-22，HMPV B型制备的系列干扰样本编号依次为S2-GR1-22。采用实施例2和3的方法和引物组合处理样本S1-GR1-22、S2-GR1-22及偏肺A型和B型对照。检测结果要求为偏肺阳性，与对照检测的结果进行偏差计算(实验组-对照组)，要求阳性样本的偏差不超过±1.5个Ct，可认为该物质无干扰。表9结果显示干扰反应实验偏差均不超过±1.5个Ct，因此本发明试剂盒与上述干扰物质之间无干扰。
表9干扰反应实验
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测偏肺病毒的引物探针组合，其特征在于，包括：
(Ⅰ)、引物具有如SEQ ID No.1～2、4～5、7～8、10～11、13～14任意所示的核苷酸序列；和
(Ⅱ)、探针具有如SEQ ID No.3、6、9、12、15任意所示的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少95％序列同源性的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，包括：
用于检测偏肺A型病毒的引物探针的组合：
(Ⅰ)、所述引物具有如SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、所述引物具有如SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、所述引物具有如SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
用于检测偏肺B型病毒的引物探针的组合：
(Ⅳ)、所述引物具有如SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；或
(Ⅴ)、所述引物具有如SEQ ID No.13～14所示的核苷酸序列；和
所述引物具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5'端标记荧光报告基因，3'端标记淬灭基团；
所述荧光报告基因包括ROX、FAM、HEX或CY5中的一种或两种；
所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2和/或MGB。
4.如权利要求1至3任一项所述的引物探针组合在制备分型检测偏肺病毒的试剂盒中的应用。
5.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的引物探针组合。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测内标的引物探针的组合：
所述引物具有如SEQ ID No.16～17所示的核苷酸序列；和
所述探针具有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID No.18所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光报告基团为ROX、FAM、HEX和/或CY5，3’端标记淬灭基团为BHQ1和/或BHQ2。
8.如权利要求5至7任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括5×Buffer、dNTPs、5U/μL混合酶、样品RNA和/或ddH2O；
所述5×Buffer包括Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、醋酸锰；
所述混合酶包括反转录酶和DNA聚合酶。
9.如权利要求5至8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述Tricine的浓度为0.5mol/L；所述KOAc的浓度为5mol/L；所述Tween20的浓度为0.5mmol/L；所述DMSO的浓度为8mmol/L；
所述dNTPs的浓度为125-375μmol/L。
10.同时分型检测偏肺病毒的方法，其特征在于，基于如下任意项对样品进行RT-PCR检测：
(Ⅰ)、如权利要求1至3任一项所述的引物探针组合；和/或
(Ⅱ)、如权利要求5至9任一项所述的试剂盒。
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