CN112921126A - 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 - Google Patents
一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112921126A CN112921126A CN202110443249.XA CN202110443249A CN112921126A CN 112921126 A CN112921126 A CN 112921126A CN 202110443249 A CN202110443249 A CN 202110443249A CN 112921126 A CN112921126 A CN 112921126A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- type
- qpcr
- hrsv
- gene
- respiratory syncytial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 title claims abstract description 73
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 title claims 18
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 title claims 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 23
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 claims description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000047279 human B2M Human genes 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于区分人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，HRSV)A型和B型的多重反转录实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)试剂盒、专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管三色荧光多重RT‑qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分人呼吸道合胞病毒A/B型。本发明的HRSV分型(A/B型)检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP‑UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种用于人呼吸道合胞病毒分型(A/B型)检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，HRSV)是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原体之一，在一些地区，2岁以下儿童至少发生过一次HRSV感染。近年来，大量研究发现HRSV也可以引起成年人、老年人以及免疫力低下患者感染。随着HRSV的流行，多种基因型相继出现，并呈现交替流行以及共流行的趋势，根据抗原不同，大致可以分为A型和B型两大亚型，不同亚型的主要结构蛋白存在明显差异，也导致不同亚型造成的疾病程度有所差异，因此如果能够较好地区分HRSV型别则能够对病毒的溯源和治疗以及疫苗的研发提供较好的指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种用于区分HRSVA/B型的多重反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒、其专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管多重RT-qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分HRSV型别。本发明的HRSV分型(A/B型)检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明所提供的一种用于HRSV分型(A/B型)检测的多重RT-qPCR试剂盒包含RT-qPCR反应液(包含引物探针组合物)、RT-qPCR酶液、阳性对照以及阴性对照。其中RT-qPCR反应液包括反应所需的dNTPs、dUTP、Mg2+、缓冲液(表1)和引物探针组合物(表2和表3)。
表1 RT-qPCR反应液试剂组成(50人份)
其中引物探针组合物包含用于检测HRSV A型G基因、HRSV B型G基因以及人类RNA内参B2M基因的引物和探针，引物和探针序列信息如表2所示，引物和探针组成如表3所示。由上述正反向引物和探针序列的衍生序列也属于本发明内容，所述衍生序列是指在SEQ IDNO：1～9的基础上，在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基得到的序列。
HRSV基因组全长约为15.2kb，共包含10个基因，分别为NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L，其中G蛋白和F蛋白是HRSV重要的膜表面糖蛋白。G蛋白主要包含胞浆区(aa1-aa37)、跨膜区(aa38-aa67)以及胞外区(aa68-aa298)，胞外区域有2个黏蛋白区和1个中心保守区。本发明依据G蛋白黏蛋白区的第二高可变区核苷酸序列对HRSV进行A/B分型。
人β-2微球蛋白(Beta-2-microglobulin，B2M)是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，是细胞表面人白细胞抗原的β链部分，广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、初乳以及唾液中，且蛋白表达和细胞膜释放量相当恒定，非常适合作为呼吸道常见病毒检测中监控样本提取和PCR扩增的内参基因。
表2 RT-qPCR反应液中所包含的引物和探针序列信息
其中，HRSV A型G基因扩增产物长度为151bp；HRSV B型G基因扩增产物长度为91bp；人类RNA内参B2M基因扩增产物长度为147bp。
表3用于人呼吸道合胞病毒分型检测的引物和探针组成(50人份)
其中RT-qPCR酶液中包含逆转录酶、热启动DNA聚合酶和UNG酶，其组分配比详见表4。
表4 RT-qPCR酶液各组分配比(50人份)
HRSV分型(A/B型)多重RT-qPCR检测试剂盒中阳性对照为包含HRSV A型G基因、HRSV B型G基因和人类RNA内参B2M基因序列的重组质粒，阴性对照为RNase-free H2O。
进一步地，所述试剂盒的检测方法为通过对疑似患者呼吸道样本进行RNA提取，配制扩增反应体系后进行多重RT-qPCR扩增，并对得到的扩增曲线进行分析，最终做出阴阳性判断。具体使用方法包括以下步骤：
(1)采用核酸自动提取仪对样本总核酸进行提取；
(2)取提取得到的核酸，按照表5配制多重RT-qPCR反应体系；
表5多重RT-qPCR反应体系
| RT-qPCR反应体系 | 加样量(μL) |
| RT-qPCR反应液 | 14 |
| RT-qPCR酶液 | 1 |
| 待检测的核酸样本/阴阳对照品 | 5 |
| 总体积 | 20 |
(3)根据表6设定反应程序进行多重RT-qPCR反应；
表6多重RT-qPCR反应程序
(4)根据多重RT-qPCR扩增曲线进行阴阳性判断，阴性结果判断条件：VIC通道的Ct值≤35，且其他荧光信号通道的Ct值≥35或显示为Undetermined/No Ct；阳性结果判定条件：若FAM通道Ct值≤35，且扩增曲线呈典型S型，VIC通道Ct值≤35，且扩增曲线呈典型S型，ROX通道Ct值≥35或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为HRSV A型；若ROX通道Ct值≤35，且扩增曲线呈典型S型，VIC通道Ct值≤35，且扩增曲线呈典型S型，FAM通道Ct值≥35或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为HRSV B型；取样失败结果判断条件：VIC通道Ct值＞35，表示取样失败，需重新采集样本进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明目的在于提供一种用于区分HRSV A/B型的多重RT-qPCR试剂盒、其专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管多重RT-qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分HRSV型别。本发明的HRSV分型(A/B型)检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。
附图说明
图1为HRSV A型G基因RT-qPCR灵敏度检测结果。
图2为HRSV B型G基因RT-qPCR灵敏度检测结果。
图3为人类RNA内参B2M基因RT-qPCR灵敏度检测结果。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1及效果实施例所述HRSV多重RT-qPCR分型(A/B型)检测试剂盒包含RT-qPCR反应液(包含引物探针组合物)、RT-qPCR酶液、阳性对照以及阴性对照。其中的RT-qPCR反应液试剂组成如表1所示，RT-qPCR反应液中所包含的引物和探针序列信息如表2所示，用于HRSV分型检测的引物和探针组成如表3所示，RT-qPCR酶液各组分配比如表4所示，阳性对照为包含HRSV A型G基因、HRSV B型G基因和人类RNA内参B2M基因序列的重组质粒，阴性对照为RNase-free H2O。
实施例1
分别用HRSV多重RT-qPCR分型(A/B型脸测试剂盒检测HRSVA型阳性患者呼吸道样本(样本编号S1-S4)、HRSV B型阳性患者呼吸道样本(样本编号S5-S8)以及HRSV感染阴性患者呼吸道样本(样本编号S9-S12)中HRSV RNA的存在并分型(阳性患者为经高通量测序验证后确诊)：
1.核酸提取：使用核酸提取试剂在全自动核酸提取仪上同时对样本S1～S12进行核酸自动提取，将完成提取的核酸样本置于-20℃保存；
2.根据表5配制反应体系，根据表6进行RT-qPCR，获得荧光扩增曲线；
3.根据判断标准判断样本中所含的HRSV型别。
S1～S 12样本在各个荧光通道中的Ct值如表7所示。
检测结果表明本发明试剂盒能够准确判定HRSV阳性患者中的HRSV型别。
表7 S1～S12样本在各个荧光通道中的Ct值
效果实施例
HRSV多重RT-qPCR分型(A/B型)检测试剂盒标准曲线建立和灵敏度试验：
分别将测定浓度和纯度后的包含HRSV A型G基因、HRSV B型G基因以及人类RNA内参B2M基因阳性质粒分别做10倍梯度稀释，得到从1×102～1×106copies/μL共5个稀释度的阳性质粒作为标准模版。根据表5配制反应体系，根据表6进行RT-qPCR，获得荧光扩增曲线，绘制标准曲线并确定最低检出限。
HRSV A型G基因、HRSV B型G基因以及人类RNA内参B2M基因在浓度1×102～1×106copies/μL范围内扩增曲线呈现典型的S型曲线，各曲线间距均匀，具有良好的相关性，其线性方程分别为：HRSVA型G基因：y＝-3.350logx+33.830(R2＝0.999)；HRSV B型G基因：y＝-3.580logx+33.780(R2＝0.998)；人类RNA内参B2M基因：y＝-3.070logx+36.610(R2＝0.998)。其最低检出限分别为：HRSV A型G基因：4.6copies/μL；HRSV B型G基因：4.2copies/μL；人类RNA内参B2M基因：1.2copies/μL。通过对三个荧光通道的灵敏度比较来看，三个荧光通道的扩增效率相近，引物间相互干扰少，试剂盒性能稳定。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波海尔施基因科技有限公司
<120> 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
<130> 2021-04-16
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
atcatcgtgc ttatacaagt taaatctt 28
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
tatgattgca gttgttagtg tgac 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
attgcagcya tcatattcat agcct 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 4
gaagtgttca acttygttcc ct 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 5
tctttggttt rttgcttggt attgt 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 6
atttgcagag ttgattgttg ccacat 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 7
gatgagtatg cctgccgtgt 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 8
atgcggcatc ttcaaacct 19
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 9
atgatgctgc ttacatgtct cgatcc 26
Claims (10)
1.一种人呼吸道合胞病毒分型检测引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括分别用于检测HRSV A型G基因、HRSV B型G基因以及人类RNA内参B2M基因的引物和相应探针；
所述用于检测HRSV A型G基因的正向引物序列为5’-ATCATCGTGCTTATACAAGTTAAATCTT-3’，如SEQ ID NO：1所示，其反向引物为5’-TATGATTGCAGTTGTTAGTGTGAC-3’，如SEQ ID NO：2所示，其探针序列为5’-ATTGCAGCYATCATATTCATAGCCT-3’，如SEQ ID NO：3所示；
所述用于检测HRSV B型G基因的正向引物序列为5’-GAAGTGTTCAACTTYGTTCCCT-3’，如SEQ ID NO：4所示，其反向引物为5’-TCTTTGGTTTRTTGCTTGGTATTGT-3’，如SEQ ID NO：5所示，其探针序列为5’-ATTTGCAGAGTTGATTGTTGCCACAT-3’，如SEQ ID NO：6所示；
所述用于检测人类RNA内参B2M基因的正向引物序列为5’-GATGAGTATGCCTGCCGTGT-3’，如SEQ ID NO：7所示，其反向引物为5’-ATGCGGCATCTTCAAACCT-3’，如SEQ ID NO：8所示，其探针序列为5’-ATGATGCTGCTTACATGTCTCGATCC-3’，如SEQ ID NO：9所示。
2.如权利要求1所述的一种人呼吸道合胞病毒分型检测引物探针组合物，其特征在于，所述用于检测HRSV A型G基因的探针5’端添加荧光报告基团FAM，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；所述用于检测HRSV B型G基因的探针5’端添加荧光报告基团ROX，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；所述用于检测人类RNA内参B2M基因的探针5’端添加荧光报告基团VIC，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
3.一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于，包括RT-qPCR反应液、RT-qPCR酶液、阳性对照和阴性对照；所述RT-qPCR反应液包括如权利要求1或2所述的引物探针组合物。
4.如权利要求3所述的一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR反应液包括反应所需的dNTPs、dUTP、Mg2+和缓冲液。
5.如权利要求3所述的一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR酶液包括UNG酶、逆转录酶和热启动DNA聚合酶。
6.如权利要求3所述的一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为包括HRSV A型G基因、HRSV B型G基因和人类RNA内参B2M基因序列的重组质粒；所述阴性对照为RNase-free H2O。
7.一种用于非疾病诊断目的的人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，通过对疑似患者呼吸道样本进行RNA提取、应用权利要求3～6任意一项所述的多重RT-qPCR试剂盒配制扩增体系后进行多重RT-qPCR扩增，并根据扩增曲线进行结果分析，最终做出阴阳性判断。
8.如权利要求7所述的一种用于非疾病诊断目的的人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，所述扩增反应体系包括14μL RT-qPCR反应液、1μLRT-qPCR酶液、5μL待检测的核酸样品或阴性/阳性对照。
9.如权利要求7所述的一种用于非疾病诊断目的的人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，扩增程序为：25℃2min；50℃30min；95℃2min；95℃15s，60℃1min，循环40次，并在60℃时收集荧光信号。
10.如权利要求7所述的一种用于非疾病诊断目的的人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，阴性结果判断条件：VIC通道的Ct值≤35，且其他荧光信号通道的Ct值≥35或显示为Undetermined/No Ct；阳性结果判定条件：若FAM通道Ct值≤35，且扩增曲线呈典型S型，VIC通道Ct值≤35，且扩增曲线呈典型S型，ROX通道Ct值≥35或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为HRSV A型；若ROX通道Ct值≤35，且扩增曲线呈典型S型，VIC通道Ct值≤35，且扩增曲线呈典型S型，FAM通道Ct值≥35或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为HRSV B型；取样失败结果判断条件：VIC通道Ct值＞35，表示取样失败，需重新采集样本进行检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110443249.XA CN112921126A (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110443249.XA CN112921126A (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112921126A true CN112921126A (zh) | 2021-06-08 |
Family
ID=76174663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110443249.XA Pending CN112921126A (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112921126A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277187B (zh) * | 2021-11-06 | 2023-07-07 | 江汉大学 | 一种呼吸道合胞病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
| CN116676428A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-09-01 | 广东省林业科学研究院 | 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型和b型的荧光定量pcr引物及方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108384898A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-08-10 | 南京岚煜生物科技有限公司 | 用于检测呼吸道合胞病毒a、b型的试剂盒及其使用方法 |
| CN108411039A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-08-17 | 南京岚煜生物科技有限公司 | 基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒a、b型的试剂盒及其使用方法 |
-
2021
- 2021-04-23 CN CN202110443249.XA patent/CN112921126A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108384898A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-08-10 | 南京岚煜生物科技有限公司 | 用于检测呼吸道合胞病毒a、b型的试剂盒及其使用方法 |
| CN108411039A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-08-17 | 南京岚煜生物科技有限公司 | 基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒a、b型的试剂盒及其使用方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JOCHEN GOTTSCHALK等: "Discrimination of Respiratory Syncytial Virus Subgroups A and B by Reverse Transcription-PCR", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,》 * |
| 刘文宽等: "呼吸道合胞病毒A与B亚型多重荧光PCR检测方法的建立及应用", 《临床检验杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277187B (zh) * | 2021-11-06 | 2023-07-07 | 江汉大学 | 一种呼吸道合胞病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
| CN116676428A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-09-01 | 广东省林业科学研究院 | 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型和b型的荧光定量pcr引物及方法 |
| CN116676428B (zh) * | 2023-07-27 | 2023-11-14 | 广东省林业科学研究院 | 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型的荧光定量pcr引物及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114369688B (zh) | 检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN113881812B (zh) | 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN111518960A (zh) | 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 | |
| CN113981152B (zh) | 检测SARS-CoV-2变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN112921126A (zh) | 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 | |
| CN111206121A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒orflab和S基因的试剂盒 | |
| CN113652505A (zh) | 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 | |
| CN117721249A (zh) | 犬呼吸道病毒三重实时荧光rt-pcr引物探针组合 | |
| CN111471800B (zh) | 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物 | |
| CN113388701A (zh) | 引物探针组合物及其在制备副流感病毒分型检测试剂盒中的应用 | |
| CN112176109A (zh) | 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法 | |
| CN112111609A (zh) | 一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒 | |
| CN112226539A (zh) | 一种诺如病毒核酸检测试剂盒 | |
| CN116219071B (zh) | 一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒 | |
| CN110923306A (zh) | 基于数字pcr无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN116479189A (zh) | 一种合胞病毒b亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒 | |
| CN111690772A (zh) | 一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用 | |
| CN113817870B (zh) | 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 | |
| CN114891928A (zh) | 一种麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的引物探针组合物和检测试剂盒 | |
| CN113278738A (zh) | 用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物及实时荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN110714097A (zh) | 一种同时检测a、b、c三组轮状病毒的方法 | |
| CN110951857A (zh) | 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒 | |
| CN111172320A (zh) | 呼吸道合胞病毒f基因的检测引物、试剂盒及方法 | |
| CN114752704B (zh) | 应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒及方法 | |
| CN114262758B (zh) | 检测新型冠状病毒突变株的试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210608 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |