CN111172320A - 呼吸道合胞病毒f基因的检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种呼吸道合胞病毒F基因的检测引物、试剂盒及方法，利用数字PCR技术平台检测呼吸道合胞病毒，整个检测流程从采样到报告结果仅需数个小时，极大程度保证了检测的时效性，并且通过数字PCR技术平台大大提升了检测的灵敏度，将检测限降低至单个拷贝病原体。所用样品为肺泡灌洗液、血浆或咽拭子，减轻患者采样时的不适，同时更利于新生儿肺炎患者采样检测。

Description

呼吸道合胞病毒F基因的检测引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒F基因的检测引物、试剂盒及方法。

背景技术

根据世界卫生组织发布的统计数据，在2000年到2016年的17年间，下呼吸道感染始终是最为致命的传染病。仅在2016年一年时间死于下呼吸道感染的人数就高达300万，其中小于15周岁的儿童和大于60周岁以上的老人占据了绝大多数。

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，HRSV)是一种属于副粘病毒科、肺炎病毒属的单负链RNA病毒，也是引起小儿肺炎的最常见的病原体。其致病原因往往是由于新生儿自身免疫功能尚未发育成熟，而来自于母体的抗体并不能完全预防人呼吸道合胞病毒感染。该病呈现季节流行性，常于春、冬季节好发，经由飞沫及密切接触传播，传播范围广。根据相关文献报道，几乎所有2岁以上的儿童，在出生后都经历过1次甚至多次感染。人呼吸道合胞病毒感染后通常有3-7日的潜伏期，随后可有发热、鼻炎、咽炎等呼吸道症状，常发展为急性或致死性的下呼吸道感染，病理表现常为间质性肺炎或毛细支气管炎。

目前为止针对人呼吸道合胞病毒的特异性疫苗仍未问世，因此人呼吸道合胞病毒感染仍然是亟待解决的全球性健康问题，2016年世界卫生组织也在全球流感监测、响应系统的基础上，建立了全球呼吸道合胞病毒监测系统。

目前针对呼吸道合胞病毒感染的诊断，往往是在发热、咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉痛和呼吸困难等临床症状的基础上结合流行病学资料进行经验性诊断，但是这种诊断方法难以将其与其它病原体引起的呼吸道感染进行区分。而呼吸道感染的病原学十分复杂，包含了细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体等，其中仅呼吸道相关病毒就涉及不少于8个科目、200余种病毒。不同的病原体导致的呼吸道感染其预后、治疗往往具有很大差异，而明确病原体类型常需使用病毒分离培养、病毒抗原抗体血清学检测以及病毒核酸的分子生物学检测等方法。

其中病毒分离培养是病原学诊断的金标准，但是其样品采集运输条件苛刻、培养操作难度大、培养周期长、检出率低等缺陷限制了该方法在临床上的广泛应用。

病原体血清学检测，利用抗原抗体结合等原理，通过检测患者血清中抗病原体的抗体，或者病原体本身特异性表面抗原实现病原体的鉴定。目前常用的方法为直接免疫荧光检测与快速抗原检测，但是也存在检出率低、操作复杂等缺点，其中直接免疫荧光检测还需要特殊的免疫荧光显微镜，进一步限制了该方法的推广。

实时荧光定量PCR的方法具有较好的特异性与灵敏度，但是受限于实时荧光定量PCR的检测原理，其检测限仍然难以达到单个拷贝，对于患病早期的检测效果欠佳。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种呼吸道合胞病毒F基因的检测引物、试剂盒及方法，利用数字PCR技术平台检测呼吸道合胞病毒F基因，整个检测流程从采样到报告结果仅需数个小时，极大程度保证了检测的时效性，并且通过数字PCR技术平台大大提升了检测的灵敏度，将检测限降低至单个拷贝病原体。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了呼吸道合胞病毒F基因的检测引物，包括上游引物RSV-F和下游引物RSV-R：

RSV-F：5′-CTATGACCCATTAGTATTCC-3′，

RSV-R：5′-CATGATATTTGTGGTGGA-3′。

优选地，还包括探针：5′-发光基团-CGAGAAGATTAACCAGAGCCTAGC-淬灭基团-3′。

更优选地，所述发光基团包括：FAM，HEX，VIC，ROX，TAMARA，Cy3或Cy5，所述淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3。

本发明还提供了呼吸道合胞病毒F基因的检测试剂盒，包括上述检测引物。

优选地，所述检测试剂盒还包括：PCR反应液、水、阴性参照物、阳性参照物、定量标准品以及液滴生成液。

更优选地，所述阴性参照物由人类细胞系(K-562)基因组DNA制成，所述阳性参照物由包含呼吸道合胞病毒F基因片段的质粒制成，所述定量标准品由包含呼吸道合胞病毒F基因片段的质粒制成1copies/μL、100copies/μL、10000copies/μL。

更优选地，所述PCR反应液包括PCR反应用缓冲液、0.2-0.3mM三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、0.2-0.3mM三磷酸碱基核苷酸混合液、4-6U耐热DNA聚合酶、4-6U逆转录酶、300-500nM上、下游引物和100-300nM探针。

更优选地，所述PCR反应用缓冲液包含20mM氯化钾、50mM的PH8.0Tris-HCl、1.5mM二价镁离子。

本发明还提供了呼吸道合胞病毒F基因的检测方法，包括：

1)获取待检测的核酸样本；

2)使待检测的核酸样本与PCR反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的PCR反应液滴；

3)对PCR反应液滴进行PCR扩增；

4)对扩增产物进行分析，根据生成液滴总个数、PCR反应体系体积进行校正，获得总的呼吸道合胞病毒拷贝数。

优选地，步骤3)中，扩增引物包括：

RSV-F：5′-CTATGACCCATTAGTATTCC-3′，

RSV-R：5′-CATGATATTTGTGGTGGA-3′；

探针包括：

5′-发光基团-CGAGAAGATTAACCAGAGCCTAGC-淬灭基团-3′，所述发光基团包括：FAM，HEX，VIC，ROX，TAMARA，Cy3或Cy5，所述淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3。

优选地，步骤3)中，PCR扩增条件为：

本发明的有益效果如下：

(一)本发明利用呼吸道合胞病毒F基因，在A型、B型病毒之间高度保守的特点，通过优化设计个基因位点的引物、探针，保证了呼吸道合胞病毒检测的特异性。

(二)利用数字PCR技术平台检测呼吸道合胞病毒，整个检测流程从采样到报告结果仅需数个小时，极大程度保证了检测的时效性；数字PCR技术平台大大提升了检测的灵敏度，将检测限降低至单个拷贝病原体，有效降低了漏检的风险，并且在保证检出率的同时，减少采集所需的样品体积；数字PCR技术为绝对定量技术，其定量结果更加准确。

(三)本发明的检测试剂盒用于临床时，检测样品可采用肺泡灌洗液、血浆或咽拭子，减轻患者采样时的不适，同时更利于新生儿肺炎患者采样，为后续诊断、治疗疗效监测、治疗预后判断提供了有力帮助。

附图说明

图1为本发明实施例中液滴生成装置主视图(a)与侧视图(b)，图中1—PCR反应体系进样孔，2—液滴生成液进样孔，3—反应孔。

图2为本发明实施例中阴性对照液滴荧光强度检测结果。

图3为本发明实施例中1号阳性样品液滴荧光强度检测结果。

图4为本发明实施例中2号阳性样品液滴荧光强度检测结果。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合附图和实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

F基因在A型与B型呼吸道合胞病毒之间具有高度保守性，根据Gene bank数据库中获取的标准参考序列，通过赛默飞引物分析(thermofisher primer analyzer)在线工具对所设计引物之间的相互作用进行分析，确保引物之间的相互作用不会对体系产生影响。

本发明设计的用于检测F基因的引物、探针序列如下：

表1.本申请设计的引物及探针序列列表

本发明的检测试剂盒还包含PCR反应液，其中包含PCR反应用缓冲液(包含20mM氯化钾、50mM的PH8.0 Tris-HCl、1.5mM二价镁离子)、0.2-0.3mM三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、0.2-0.3mM三磷酸碱基核苷酸(dNUPs)、4-6U耐热DNA聚合酶、4-6U逆转录酶、300-500nM引物、100-300nM探针。

在一些更为具体的实施例中，所述试剂盒具体包括：PCR反应液、水、利用人类细胞系(K-562)基因组DNA制成阴性参照物、利用包含呼吸道合胞病毒F基因片段的质粒制成阳性参照物、利用包含呼吸道合胞病毒F基因片段的质粒制成1copies/μL、100copies/μL、10000copies/μL定量标准品以及液滴生成液。

本申请中，采用液滴生成装置使待检测的核酸样本与PCR反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的液滴。本方法中采用的液滴生成液，其主要成分为矿物油等油相物质，可选择市售产品，在此不做限定。

本发明呼吸道合胞病毒F基因的检测方法，主要包括：

1.取5-10μL提取好的呼吸道合胞病毒RNA，与20-45μL PCR反应液混匀后，加入液滴生成装置的PCR反应体系进样孔中。

2.取25-50μL液滴生成液，加入液滴生成装置的液滴生成液进样孔中。

3.加样完毕后，将液滴生成装置置于离心机适配器中，以2000-4000rpm离心2-4分钟，使得核酸样品与PCR反应液在离心力的作用下流入流道中，并在流道中被液滴生成液包裹，形成仅包含单个核酸或者不包含核酸的百万数量级液滴。

4.将反应孔中生成的液滴转移到PCR管中，放入聚合酶链式反应扩增仪(PCR扩增仪)中，按下列表2的条件进行扩增：

表2.本发明PCR扩增条件

5.将扩增产物使用8通道液滴阅读系统进行分析，首先根据未加入模板的空白对照确定背景荧光强度，设定超过背景荧光强度的液滴为阳性液滴，测量每个反应液滴的荧光强度，并计数阳性液滴个数。

6.根据生成液滴总个数、PCR反应体系体积进行校正，计算呼吸道合胞病毒拷贝数。

实施例1

1.本实施例所用样品包括提取自患者(已签署知情同意书)肺泡灌洗液的呼吸道合胞病毒阳性核酸溶液2例，以及阴性核酸溶液1例，分别编号为1号样品、2号样品和3号样品。

2.PCR反应体系制备

本实施例采用的液滴生成装置具体为PC材料制成，长30mm，宽25mm，厚度2mm，其中PCR反应体系进样孔1容积为50μL，液滴生成液进样孔2容积为50μL，反应孔3容积为100μL。其结构如图1所示，也可以采用市售的其他液滴生成产品，在此不做限定。

(1)将PCR反应液预先从冰箱中取出解冻，待PCR反应液完全融化后涡旋混匀并瞬时离心；

(2)取20μL PCR反应液置于PCR管中，向其中加入5μL核酸样品，用枪头混匀；

表3. 20μL PCR反应液组成体系

(3)吸取25μL混合液体加入PCR反应体系进样孔1中，吸取25μL液滴生成液，加入液滴生成液进样孔2中；

(4)加样完毕后，将液滴生成装置置于离心机适配器中，在安装处理装置时需保持中心对称；

(5)以2000rpm离心4分钟，使得核酸样品与PCR反应液在离心力的作用下流入流道中，并在流道中被液滴生成液包裹，形成仅包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；

(6)将反应孔3中生成的液滴转移到PCR管中。

3.PCR扩增

扩增在聚合酶链式反应扩增仪T100(伯乐生物科技有限公司)中进行，反应程序如下表所示：

表4.实施例1中PCR反应程序

4.结果分析

将扩增产物使用8通道液滴阅读系统Drop-reader-D01(苏州昊通生物科技有限公司)进行分析：

(1)首先分析FAM荧光通道下阴性对照(3号样品)中各个液滴的荧光强度，以此确定每个荧光通道的背景荧光强度，如图2所示。

(2)再通过设定超过背景荧光强度的液滴为阳性液滴，测量FAM荧光通道下每个反应液滴的荧光强度，并计数阳性液滴个数。

(3)每个样品的检测结果以每个液滴检测时的次序为横坐标，以该液滴的荧光强度为纵坐标，绘制每个液滴荧光强度的散点图，如图3和图4所示。

(4)通过阴性对照确定的背景荧光值确定荧光强度阈值线，荧光强度超过阈值线的液滴即为阳性液滴。根据生成液滴总个数、PCR反应体系体积进行校正，即可获得总的呼吸道合胞病毒拷贝数。

由于本次实验中均加入5μL核酸样品，所以每个样品检测的呼吸道合胞病毒拷贝数，就代表了每5μL核酸样品中包含的呼吸道合胞病毒拷贝数。

由图3可以得出1号核酸样品中呼吸道合胞病毒拷贝数为248copies/μL，由图4可以得出2号核酸样品中呼吸道合胞病毒拷贝数为2467copies/μL。

Claims (10)

1.呼吸道合胞病毒F基因的检测引物，包括上游引物RSV-F和下游引物RSV-R：

RSV-F：5′-CTATGACCCATTAGTATTCC-3′，

RSV-R：5′-CATGATATTTGTGGTGGA-3′。

2.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒F基因的检测引物，其特征在于，还包括探针：5′-发光基团-CGAGAAGATTAACCAGAGCCTAGC-淬灭基团-3′，所述发光基团包括：FAM，HEX，VIC，ROX，TAMARA，Cy3或Cy5，所述淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3。

3.呼吸道合胞病毒F基因的检测试剂盒，包括权利要求1或2所述的检测引物。

4.根据权利要求3所述的呼吸道合胞病毒F基因的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：PCR反应液、水、阴性参照物、阳性参照物、定量标准品以及液滴生成液。

5.根据权利要求4所述的呼吸道合胞病毒F基因的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性参照物由人类细胞系K-562基因组DNA制成，所述阳性参照物由包含呼吸道合胞病毒F基因片段的质粒制成，所述定量标准品由包含呼吸道合胞病毒F基因片段的质粒制成1copies/μL、100copies/μL、10000copies/μL。

6.根据权利要求4所述的呼吸道合胞病毒F基因的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括PCR反应用缓冲液、0.2-0.3mM三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、0.2-0.3mM三磷酸碱基核苷酸混合液、4-6U耐热DNA聚合酶、4-6U逆转录酶、300-500nM上、下游引物和100-300nM探针。

7.根据权利要求6所述的呼吸道合胞病毒F基因的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应用缓冲液包含20mM氯化钾、50mM的PH8.0 Tris-HCl、1.5mM二价镁离子。

8.呼吸道合胞病毒F基因的检测方法，包括：

1)获取待检测的核酸样本；

2)使待检测的核酸样本与PCR反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的PCR反应液滴；

3)对PCR反应液滴进行PCR扩增；

4)对扩增产物进行分析，根据生成液滴总个数、PCR反应体系体积进行校正，获得总的呼吸道合胞病毒拷贝数。

9.根据权利要求8所述的呼吸道合胞病毒F基因的检测方法，其特征在于，步骤3)中，扩增引物包括：

RSV-F：5′-CTATGACCCATTAGTATTCC-3′，

RSV-R：5′-CATGATATTTGTGGTGGA-3′；

探针包括：

5′-发光基团-CGAGAAGATTAACCAGAGCCTAGC-淬灭基团-3′，所述发光基团包括：FAM，HEX，VIC，ROX，TAMARA，Cy3或Cy5，所述淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3。

10.根据权利要求8所述的呼吸道合胞病毒F基因的检测方法，其特征在于，步骤3)中，PCR扩增条件为：

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