CN109735660A - 呼吸道合胞病毒通用型快速检测引物组、试剂盒 - Google Patents

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CN109735660A CN201910158408.4A CN201910158408A CN109735660A CN 109735660 A CN109735660 A CN 109735660A CN 201910158408 A CN201910158408 A CN 201910158408A CN 109735660 A CN109735660 A CN 109735660A
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胡振新
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Abstract

本发明涉及一种呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)通用型快速检测引物组、试剂盒，所述呼吸道合胞病毒通用型快速检测引物组包括可以同时检测呼吸道合胞病毒A型和B型F基因序列的上、下游引物和探针；所述引物组包括1条上游引物、2条下游引物和1条探针。本发明可以同时检测RSV A型和B型两种基因型，使本发明具有检测能力上的优势与特点，不仅检测简单易行、生产成本低，而且具有较高的准确度、精密度、特异性以及可重复性，非常适合用于呼吸道合胞病毒的早期快速辅助诊断。

Description

呼吸道合胞病毒通用型快速检测引物组、试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒通用型快速检测引物组、试剂盒。
背景技术
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是一种单链、负股、有包膜的RNA病毒，为副黏病毒科肺炎病毒属成员。因其在组织培养中呈现细胞融合性病变而得名。分A、B两个亚型，对人群普遍易感，主要通过飞沫进行传播，有明显季节流行特征，两种亚型可交替成为流行优势株。RSV发病机制复杂，主要表现为毛细支气管炎和肺炎，主要症状有咳嗽、气急、发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等。RSV是引起全球范围内婴幼儿急性下呼吸道感染最主要的病毒病原体，其致病性仅次于肺炎链球菌和流感嗜血杆菌。RSV在老年人和免疫功能低下的高危人群中也有较高的发病率，并可引起严重的并发症导致住院时间延长和高死亡率。目前，针对RSV感染缺乏特异性病因治疗，以支持和对症治疗为主，支气管扩张剂、激素及抗病毒药物的疗效均不尽人意。此外，RSV感染后产生的保护性免疫不能持久保护机体，重复感染十分常见。所以，RSV感染通常以高住院率、高住院费用和较长的住院时间等形式继续在全球范围内造成严重影响。
目前，针对RSV的检测，主要包括病毒培养法、分子生物学方法和血清学检测法。其中分子生物学方法因其灵敏度高、特异度高等优势，越来越广泛的应用于临床诊断。这些方法包括荧光定量PCR法、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)等，但是运用这些方法，设计RSV的引物还是存在难题。因为RSV分A、B两个基因型，F基因是RSV的特异性基因，但是在A、B两种基因型中，F基因同源率91％，其中8％的突变较均匀的分散在F基因序列中，这对通用型引物设计造成一定的困难。
发明内容
针对以上问题，本发明提供一种呼吸道合胞病毒通用型快速检测引物组、试剂盒，本发明包含了一条上游引物和两条下游引物，一同运用到扩增体系中，引物之间不存在竞争，能有效的检测合胞病毒A型和B型，灵敏度高、特异性强，操作简单、耗时短、生产成本低、不易污染，能够快速而准确地检测呼吸道合胞病毒A型和B型毒株。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：呼吸道合胞病毒快速检测引物组，包含检测F基因保守序列的上、下游引物和探针，即包括可以同时检测呼吸道合胞病毒A型和B型F基因序列的引物和探针；所述引物包括1条上游引物和2条下游引物；所述上游引物是：5’-AGTGAGTTATTATCATTAATCAATG-3’；所述下游引物为2条引物，所述下游引物1是：5’-TTTCCAACAAGGAGTATCTATTACA-3’所述下游引物2是：5’-ATTATAGACATGATAGAATAACTTTG-3’；所述探针是5’-ATCATTAATCAATGATATGCC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1dT/AACAAATGAT-3’C3Spacer。其中：“i6-FAMdT”指6-FAM(6-羧基荧光素)荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”指带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“C3 Spacer”指3’羟基封闭。
进一步的，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-FAM、缺失及BHQ1修饰处于序列的第22-24位；或者，所述探针的6-FAM、缺失或BHQ1标记处于正向或反向互补序列的第18-29位。
本发明还提供呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：
(1)裂解液；
(2)复溶液；
(3)含引物探针的EMA反应管；所述引物包含上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-AGTGAGTTATTATCATTAATCAATG-3’；所述下游引物为2条引物，所述下游引物1是：5’-TTTCCAACAAGGAGTATCTATTACA-3’；所述下游引物2是：5’-ATTATAGACATGATAGAATAACTTTG-3’；所述探针是5’-ATCATTAATCAATGATATGCC/i6-FAMdT//idSp//iBHQldT/AACAAATGAT-3’C3Spacer；
(3)阳性对照品；
(4)阴性对照品。
进一步的，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-FAM、缺失及BHQ1修饰处于序列的第22-24位；或者，所述探针的6-FAM、缺失或BHQ1标记处于正向或反向互补序列的第18-29位。
优选的，所述裂解液含有终浓度为2-5％的NP-40(v/v)、20-50mg/mL的chelex-100、10-20mM的pH8.0的Tris-Ac及DEPC处理水。
优选的，所述复溶液含有终浓度为20-30mM的MgAc2、90-100mM的Tris-Ac(pH8.0)、55-60mM的KAc、10-15％的PEG20000(W/V)及DEPC处理水。
优选的，所述含引物探针的EMA反应管的成分如下：每个反应管中含有终浓度为4.5-7.5ng/μl的M-MLV逆转录酶、1.5-2ng/μl的Rnase抑制剂，24-27ng/μl的单链DNA结合蛋白、62-125pg/μl的ATP再生蛋白、6-7.5ng/μl的DNA解旋酶、2-3ng/μl的DNA聚合酶、90-120pg/μl的DNA限制性内切酶、300-400pg/μl的辅助蛋白、200-300nM的上游引物、200-300nM的下游引物1、200-300nM的下游引物2、30-40nM的探针、20-30mM的磷酸肌酸钠、2-3mM的ATP、100-150μM的dNTP、50-60mM的Tris-Ac(pH8.0)、35-50μg/μl的海藻糖、100-120mM的KAc、7.5-10ng/μl的甘露醇、1-5％的PEG20000(W/V)。
优选的，所述阴性对照品为DEPC处理水空白对照。
优选的，所述阳性对照品是含有目的序列的伪病毒，浓度是1μg/mL。
本发明还提供所述的呼吸道合胞病毒快速检测引物组在制备呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种呼吸道合胞病毒的检测方法，所述检测方法采用所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，所述检测方法包括以下步骤：
(1)使用所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，将样本拭子放到500μl裂解液中并剪断，涡旋振荡30秒，5000rpm离心1分钟，取100μl上清液转移到新的1.5mL离心管中，金属浴90℃加热裂解10分钟，随后冷却到室温，取上清进行检测；
(2)取10μl阳性对照品、阴性对照品按步骤(1)操作；
(3)使用所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，取10μl复溶液及10μ1样本裂解所得上清，加入到含引物探针的EMA反应管中，充分混匀，另设置阳性及阴性对照；
(4)将复溶的EMA反应管放入Click i核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(5)结果质控：阳性对照品Ct值＜20，荧光曲线为典型“S”型，阴性质控品无Ct值，以上条件均满足，本次实验有效，否则无效，需要排查原因并重新测试；
(6)结果判断：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，且Ct值＜30，则判断为阳性结果；反之，扫描荧光曲线为水平直线，无Ct值，则为阴性结果。
本发明使用EMA技术，通过M-MLV逆转录酶以及EMA多个酶促反应，可在37-45℃相对较低的恒温条件下，10-30分钟内使目的RNA逆转录成cDNA并扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检样本RNA的快速检定。
本发明的引物序列是这样得到的：通过国内外文献及Genebank数据库比对筛选呼吸道合胞病毒基因序列，最终确定F基因为目的基因，从Genebank下载呼吸道合胞病毒F基因序列(A型序列号NC_001803.1、B型序列号KY296697.1)，该基因序列在合胞病毒两种基因型中特异，但是存在突变。首先针对A型基因设计引物以及通用型的探针，通过扩增含有A型F基因序列的质粒，筛选出最佳的几对A型引物。由于引物上都会存在B型突变碱基，将这些突变碱基改成B型碱基，从而形成B型引物。尝试在使用A型引物扩增时增加一条上游或者下游B型引物，增强检测的包容性，能检测RSVA型和B型，同时灵敏度不受影响。
从而得到本发明所含引物对及探针：
上游引物：5’-AGTGAGTTATTATCATTAATCAATG-3’；
下游引物1∶5’-TTTCCAACAAGGAGTATCTATTACA-3’；
下游引物2：5’-ATTATAGACATGATAGAATAACTTTG-3’；
探针是5’-ATCATTAATCAATGATATGCC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1dT/AACAAATGAT-3’C3 Spacer。
本发明的EMA(Enzymes Mediated Amplification，多酶介导的核酸扩增技术，即常温核酸扩增技术)体系(包括复溶液、含引物探针的EMA反应管)通过比较引物浓度、探针浓度、离子浓度等确定最终反应体系。
本发明的有益效果包括：
1、本发明中有1条上游引物和2条下游引物，2条下游引物处于F基因的不同位置，这样的组合可以检测呼吸道合胞病毒的A、B两种基因型，且不存在竞争作用，使得整个体系具有较强适应性，即便样本中靶序列存在3-5个突变，也可以正常扩增，从而增加了本发明的灵敏度。
2、本发明中探针序列较长，FAM及BHQ1标记在序列的内部且距离两个碱基，这样的设计增加了扩增体系的适应性，同时降低了背景荧光。若样本中靶序列存在突变，也可以保证荧光探针与靶序列的退火及荧光信号的产生及释放，从而有助于增加本发明的灵敏度和特异性。
3、本试剂盒中EMA反应管中的试剂经过冻干处理，可2-8℃保存和运输，降低了保存及冷链运输的设备要求，同时延长了有效期。
4、本发明中试剂盒含有裂解液，可以快速提取样本中呼吸道合胞病毒的核酸，无需额外提取试剂盒，降低成本并提高效率。
5、本发明中核酸扩增条件为37℃到45℃，对温度要求低，对机器要求低，同时减少气溶胶，降低污染的风险。
6、本发明的核酸扩增时间短，可在30分钟内报告结果。
本发明以呼吸道合胞病毒的F基因的保守序列为目的基因，筛选最佳引物及探针，并配合以通用的EMA酶，可在37℃到45℃较低的恒温条件下，30分钟内完成对RSV病毒RNA的检测。本发明体系中含有1条上游引物和2条下游引物，一同运用到扩增体系中，得益于EMA技术多个酶的酶促作用，引物之间不存在竞争，能有效的检测RSVA型和B型两种基因型，形成通用检测试剂盒，使本发明具有检测能力上的优势与特点，不仅检测简单易行、生产降低了成本，而且具有较高的准确度、精密度、特异性以及可重复性。
附图说明
图1和图2是实施例1 RSV A型引物的筛选的结果
图3到图8是实施例2 RSV B型引物的筛选的结果
图9是实施例4交叉反应的检测结果
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，所选配方为试剂盒的优选配方，但并不用来限制本发明的范围。
本发明提供的呼吸道合胞病毒快速检测引物组，包含可以同时检测呼吸道合胞病毒A型和B型F基因序列的上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-AGTGAGTTATTATCATTAATCAATG-3’；所述下游引物为2条下游引物；所述下游引物1是：5’-TTTCCAACAAGGAGTATCTATTACA-3’；所述下游引物2是：5’-ATTATAGACATGATAGAATAACTTTG-3’；所述探针是5’-ATCATTAATCAATGATATGCC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1dT/AACAAATGAT-3’C3Spacer。
进一步的，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-FAM、缺失及BHQ1修饰处于序列的第22-24位；或者，所述探针的6-FAM、缺失或BHQ1标记处于正向或反向互补序列的第18-29位。
本发明还提供呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：
(1)裂解液；
(2)复溶液；
(3)含引物探针的EMA反应管；所述引物探针包含上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-AGTGAGTTATTATCATTAATCAATG-3’；所述下游引物1是：5’-TTTCCAACAAGGAGTATCTATTACA-3’；所述下游引物2是：5’-ATTATAGACATGATAGAATAACTTTG-3’；所述探针是5’-ATCATTAATCAATGATATGCC/i6-FAMdT//idSp//iBHQldT/AACAAATGAT-3’C3Spacer；
(4)阳性对照品；
(5)阴性对照品。
优选的，所述裂解液含有终浓度为2-5％的NP-40(v/v)、20-50mg/mL的chelex-100、10-20mM的pH8.0的Tris-Ac及DEPC处理水。
优选的，所述复溶液含有终浓度为20-30mM的MgAc2、90-100mM的Tris-Ac(pH8.0)、55-60mM的KAc、10-15％的PEG20000(W/V)及DEPC处理水。
优选的，所述含引物探针的EMA反应管的成分如下：每个反应管中含有终浓度为4.5-7.5ng/μl的M-MLV逆转录酶、1.5-2ng/μl的Rnase抑制剂，24-27ng/μl的单链DNA结合蛋白、62-125pg/μl的ATP再生蛋白、6-7.5ng/μl的DNA解旋酶、2-3ng/μl的DNA聚合酶、90-120pg/μl的DNA限制性内切酶、300-400pg/μl的辅助蛋白、200-300nM的上游引物、200-300nM的下游引物1、200-300nM的下游引物2、30-40nM的探针、20-30mM的磷酸肌酸钠、2-3mM的ATP、100-150μM的dNTP、50-60mM的Tris-Ac(pH8.0)、35-50μg/μl的海藻糖、100-120mM的KAc、7.5-10ng/μl的甘露醇、1-5％的PEG20000(W/V)。
优选的，所述阴性对照品为DEPC处理水空白对照。
优选的，所述阳性对照品是含有目的序列的伪病毒，浓度是1μg/mL。
所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-FAM、缺失及BHQ1修饰处于序列的第22-24位；或者，所述探针的6-FAM、缺失或BHQ1标记处于正向或反向互补序列的第18-29位。
本发明还提供一种呼吸道合胞病毒的检测方法，所述检测方法采用所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；所述检测方法包括以下步骤：
(1)使用所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，将样本拭子放到500μl裂解液中并剪断，涡旋振荡30秒，5000rpm离心1分钟，取100μl上清液转移到新的1.5mL离心管中，金属浴90℃加热裂解10分钟，随后冷却到室温，取上清进行检测；
(2)取10μl阳性对照品、阴性对照品按步骤(1)操作；
(3)使用所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl样本裂解所得上清，加入到含引物探针的EMA反应管中，充分混匀，另设置阳性及阴性对照；
(4)将复溶的EMA反应管放入Click i核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(5)结果质控：阳性对照品Ct值＜20，荧光曲线为典型“S”型，阴性质控品无Ct值，以上条件均满足，本次实验有效，否则无效，需要排查原因并重新测试；
(6)结果判断：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，且Ct值＜30，则判断为阳性结果；反之，扫描荧光曲线为水平直线，无Ct值，则为阴性结果。
实施例1、RSV A型引物的筛选
从Genebank下载呼吸道合胞病毒F基因序列(A型序列号NC_001803.1、B型序列号KY296697.1)，该基因序列在合胞病毒两种基因型中特异，但是存在突变。首先针对A型基因设计引物以及通用型的探针(表1)，通过扩增含有A型F基因序列的质粒(1×104copies/μl)，筛选出最佳的几对A型引物。筛选标准：阳性扩增曲线是典型“S”曲线、Ct值最小、阴性扩增曲线是水平直线。
表1 A型引物及通用型探针序列
不同引物对的筛选最终结果见图1、图2：根据曲线“S型”形状，荧光值高，扩增Ct值较小等条件综合考虑，AF3、AF4、AR1、AR3、AR4五个引物扩增效果较好，选择最佳引物对AF3-AR4做为A型基因主要引物对，其他引物作为备选，继续进行后续筛选。根据AF4、AR1、AR3三个引物在B型基因上的相应位置，截取相同位置序列，形成B型引物。引物列表见表2。
表2 B型引物序列
实施例2、RSV B型引物的筛选
使用实施例1筛选出A型引物AF3-AR4作为体系的主要扩增引物，向体系中分别加入相同浓度的引物BF4、BR1、BR3，扩增含目的基因的质粒，浓度是1×104copies/μl，重复两个复孔，检测扩增效果。(1)扩增A型基因质粒，检测添加引物对A型基因的扩增是否有影响；(2)扩增B型基因质粒，检测引物是否可以正常扩增B型基因。实验中均设置未加B型引物的体系作为对照。实验结果见图3到图8。其中，图3是A型基因质粒添加BF4引物的结果，图4是A型基因质粒添加BR1引物的结果，图5是A型基因质粒添加BR3引物的结果，图6是B型基因质粒添加BF4引物的结果，图7是B型基因质粒添加BR1引物的结果，图8是B型基因质粒添加BR3引物的结果。扩增A型和B型基因时，BF4、BR3的添加使得体系扩增效率下降，荧光值降低。而BR1对扩增效率没有影响，所以选择BR1添加到体系中。
实施例3、RSV临床样本的快速检测
采用本发明所提供的检测试剂盒，进行36个临床样本的快速检测。此次临床样本来源于上海某医院，均是定标过的阳性样本，核酸浓度见表3。检测过程如下：
(1)使用本发明提供的检测试剂盒，将10μl阳性对照品或阴性对照品放到500μl裂解液，涡旋振荡30秒，5000rpm离心1分钟，取100μl上清液转移到新的1.5mL离心管中，金属浴90℃加热裂解10分钟，随后冷却到室温，取上清进行检测；
(2)取10μl复溶液及10μl样本核酸加入到含引物探针的EMA反应管中，充分混匀，另设置阳性及阴性对照；
(3)将复溶的EMA反应管放入Click i核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(5)结果质控：阳性对照品Ct值＜20，荧光曲线为典型“S”型，阴性质控品无Ct值，以上条件均满足，本次实验有效，否则无效，需要排查原因并重新测试；
(6)结果判断：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，且Ct值＜30，则判断为阳性结果；反之，扫描荧光曲线为水平直线，无Ct值，则为阴性结果。
扩增结果如表3，RSV阳性样本36例检出率100％，与临床诊断结果一致，准确度100％。
表3 RSV临床样本的快速检测结果
实施例4：交叉反应的检测：
选用部分人类感染常见病原体的核酸提取物，包括肺炎衣原体、流感病毒H1N1、腺病毒3型、腺病毒7型、结核分枝杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌，以及呼吸道合胞病毒A型质粒和B型质粒，浓度是1×104copies/μl，进行交叉反应的检测，结果显示除呼吸道合胞病毒阳性样本为阳性结果外，其它样本结果均为阴性，证明本发明与本实施例中其他病原体核酸无交叉反应o(如图9)
表5交叉反应样本列表
可见，本发明的呼吸道合胞病毒快速检测引物组和试剂盒，具有很高的灵敏度、准确度和特异性。
本发明以呼吸道合胞病毒的F基因为目的基因，筛选了一条上游引物和两条下游引物，并配合以通用的EMA酶，可在37℃到45℃较低的恒温条件下，30分钟内完成对RSV病毒RNA的检测。
本试剂盒可以检测RSV A型和B型两种基因型，使本发明具有检测能力上的优势与特点，不仅检测简单易行、生产成本低，而且具有较高的准确度、精密度、特异性以及可重复性，非常适合用于呼吸道合胞病毒的早期快速辅助诊断。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州点晶生物科技有限公司
<120> 呼吸道合胞病毒通用型快速检测引物组、试剂盒
<130> 0
<141> 2019-03-01
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> respiratory syncytial virus
<400> 1
agtgagttat tatcattaat caatg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> respiratory syncytial virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<400> 2
tttccaacaa ggagtatcta ttaca 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> respiratory syncytial virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<400> 3
attatagaca tgatagaata actttg 26
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> respiratory syncytial virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<400> 4
atcattaatc aatgatatgc caacaaatga t 31

Claims (10)

1.呼吸道合胞病毒快速检测引物组，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒快速检测引物组包括可以同时检测呼吸道合胞病毒A型和B型F基因序列的上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-AGTGAGTTATTATCATTAATCAATG-3’；所述下游引物为2条引物，所述下游引物1是：5’-TTTCCAACAAGGAGTATCTATTACA-3’；所述下游引物2是：5’-ATTATAGACATGATAGAATAACTTTG-3’；所述探针是5’-ATCATTAATCAATGATATGCC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1dT/AACAAATGAT-3’C3 Spacer。
2.如权利要求1所述的呼吸道合胞病毒快速检测引物组，其特征在于，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-FAM、缺失及BHQ1修饰处于序列的第22-24位；或者，所述探针的6-FAM、缺失或BHQ1标记处于正向或反向互补序列的第18-29位。
3.呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下内容：
(1)裂解液；
(2)复溶液；
(3)含引物探针的EMA反应管；所述EMA反应管包含上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-AGTGAGTTATTATCATTAATCAATG-3’；所述下游引物为2条引物，所述下游引物1是：5’-TTTCCAACAAGGAGTATCTATTACA-3’所述下游引物2是：5’-ATTATAGACATGATAGAATAACTTTG-3’；所述探针是5’-ATCATTAATCAATGATATGCC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1dT/AACAAATGAT-3’C3Spacer；
(4)阳性对照品；
(5)阴性对照品。
4.如权利要求3所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有终浓度为1-10％的NP-40、1-100mg/mL的chelex-100、1-20mM的pH8.0的Tris-Ac及DEPC处理水。
5.如权利要求3所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，其特征在于，所述复溶液含有终浓度为10-50mM的MgAc2、80-100mM的Tris-Ac、55-70mM的KAc、5-15％的PEG20000及DEPC处理水。
6.如权利要求3所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，其特征在于，所述含引物探针的EMA反应管的成分如下：每个反应管中含有终浓度为0.75-7.5ng/μl M-MLV逆转录酶、0.25-2.5ng/μl RNase抑制剂、6-60ng/μl的单链DNA结合蛋白、16-160pg/μl的ATP再生蛋白、1-10ng/μl的DNA解旋酶、1-5ng/μl的DNA聚合酶、5-150pg/μl的DNA限制性内切酶、200-500pg/μl的辅助蛋白、200-500nM的上游引物、200-500nM的下游引物1、200-500nM的下游引物2、1-50nM的探针、1-50mM的磷酸肌酸钠、1-10mM的ATP、50-150μM的dNTP、50-100mM的Tris-Ac、5-50μg/μl的海藻糖、100-500mM的KAc、1-10ng/μl的甘露醇、1-10％的PEG20000。
7.如权利要求3所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为DEPC处理水空白对照。
8.如权利要求3所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品是含有目的序列的伪病毒，浓度是1μg/mL。
9.权利要求1和2所述的呼吸道合胞病毒快速检测引物组在制备呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒中的应用。
10.一种呼吸道合胞病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用权利要求3所述的呼吸道合胞病毒通用型快速检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，所述检测方法包括以下步骤：
(1)使用权利要求3所述的检测试剂盒，将样本拭子放到500μl裂解液中并剪断，涡旋振荡30秒，5000rpm离心1分钟，取100μl上清液转移到新的1.5mL离心管中，金属浴90℃加热裂解10分钟，随后冷却到室温，取上清进行检测；
(2)取10μl阳性对照品、阴性对照品按步骤(1)操作；
(3)使用权利要求3所述的检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl样本裂解所得上清，加入到含引物探针的EMA反应管中，充分混匀，另设置阳性及阴性对照；
(4)将复溶的EMA反应管放入Click i核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(5)结果质控：阳性对照品Ct值＜20，荧光曲线为典型“S”型，阴性质控品无Ct值，以上条件均满足，本次实验有效，否则无效，需要排查原因并重新测试；
(6)结果判断：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，且Ct值＜30，则判断为阳性结果；反之，扫描荧光曲线为水平直线，无Ct值，则为阴性结果。
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