CN109517927A - 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用。包括咽拭子和血液样本RNA快速提取试剂、PCR扩增试剂和对照试剂；PCR扩增试剂包括PCR反应缓冲液1、酶系3、infA/infB引物探针混合液；咽拭子和血液样本RNA快速提取试剂由0.1％～1.0％(W/V)NLS，300mM～800mM DTT，1×TE Buffer配制而成；PCR反应缓冲液1包括5*RT‑PCR反应Buffer(50mM tris‑HCL，75mM Kcl，3mM Mgcl2,10mM DTT)，dNTPs，Mgcl2；所述的酶系3包括Hs Hi Taq DNA聚合酶、Super‑M‑MLV反转录酶、RNA酶抑制剂；所述的infA/infB引物探针混合液包括甲型流感病毒检测引物探针、乙型流感病毒检测引物探针。

Description

一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用。
背景技术
流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，病毒颗粒呈球状，直径为80nm-120nm，为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。流感病毒按照核蛋白和基质蛋白的不同可分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。
甲型流感病毒为常见流感病毒，甲型流感病毒最容易发生变异，甲型流感病毒的亚型则被人们称为“禽流感”，禽流是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，病毒基因变异后能够感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，人员和车辆往来是传播本病的重要因素。
甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的；乙型和丙型流感仅在人之间转播，以局部暴发和散发流行为特征。
流感病毒主要传播途径是带有流感病毒的飞沫，经呼吸道进入体内。病毒传入人群后，传染性强并可迅速蔓延，传播速度和广度与人口密度有关。流感病毒感染导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。因此，做到甲型和乙型流感病毒的早诊断、早发现、早治疗十分关键。
流感病毒的检测方法主要有病毒的分离培养，免疫学诊断和分子生物学诊断。病毒的分离培养和免疫学诊断是流感的实验室诊断的常规方法，分子生物学诊断中出现了许多快速特异的方法，三种方法具有以下特点：
1)病毒分离培养对技术要求较高，费用较昂贵，耗时长，且各实验室分离阳性率各不相同，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要，目前仅用于实验研究。
2)血清学方法不能高通量处理样本，不能准确反映当前是否感染或携带病毒。血清学的诊断还存在滞后性，该方法费时、费力，无法满足快速、早期诊断的要求。
3)病毒核酸检测：由于以上两种方法费时、费力，为了提高检测速度，可直接从临床标本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物)中检测病毒的核酸。该方法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对流感病毒感染作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中的实时定量RT-PCR检测平台已成为最简捷和可靠的流感病毒检测方法。
综上所述，因此，建立一种快速检测流感病毒的方法对保护卫境安全具有重要的应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用，其快速、灵敏的检测流感病毒核酸，用于对临床可疑患者的病原学快速筛查诊断。
为了达到上述目的，本发明提供了一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒，为甲型、乙型流感病毒快速分型荧光PCR检测试剂盒，包括咽拭子和血液样本RNA快速提取试剂、 PCR扩增试剂和对照试剂；所述的PCR扩增试剂包括PCR反应缓冲液1、酶系3、infA/infB 引物探针混合液；所述的对照试剂包括阴性对照品和阳性对照品；
所述的咽拭子和血液样本RNA快速提取试剂由0.1％～1.0％(W/V)NLS，300mM～800mM DTT，1×TE Buffer配制而成；
所述的PCR反应缓冲液1包括5*RT-PCR反应Buffer(50mM tris-HCL，75mM Kcl，3mMMgcl2,10mM DTT)，dNTPs，Mgcl2；
所述的酶系3包括Hs Hi Taq DNA聚合酶、Super-M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂；
所述的infA/infB引物探针混合液包括甲型流感病毒检测引物探针、乙型流感病毒检测引物探针、人内源基因β-actin检测引物探针。
进一步的，所述的infA/infB引物探针混合液包括甲型流感病毒检测引物探针、乙型流感病毒检测引物探针、人内源基因β-actin检测引物探针按照下列比例：
甲型流感病毒
infA上游引物：TCTAACCGAGGTCGAAACGTA SEQ ID NO.1
infA下游引物：ACTTTCCAGTCTCTGCGCG SEQ ID NO.2
infA探针：5’-荧光报告基团-TCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-荧光淬灭基团-3’
SEQ ID NO.3
乙型流感病毒
优选的，所述的咽拭子和血液样本RNA快速提取试剂由0.4％(W/V)NLS、400mMDTT、1 ×TE Buffer配制而成。
进一步的，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY5荧光报告基团，所述的淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA荧光淬灭基团。
进一步的，所述的甲型流感病毒引物探针比例为：SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2：SEQID NO.3为400nM：400nM：200nM；所述的乙型流感病毒引物探针比例为：SEQ ID NO.4：SEQID NO.5：SEQ ID NO.6为600nM：600nM：300nM；所述的β-actin引物探针比例为：SEQ IDNO.7：SEQ ID NO.8：SEQ ID NO.9为300nM：300nM：100nM。
所述阳性对照品为含有SEQ ID NO.10所示infA目的扩增片段的质粒，和/或含有SEQ ID NO.11所示infB目的扩增片段的质粒或经基因工程改建而成的质粒菌；
所述infA扩增目的片段序列为：
TTGAAAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCCATCAGG CCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCTGGGAAAAACACA GATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATT
SEQ ID NO.10
所述infB扩增目的片段序列为：
AGGCTTGTTGCTAAACTTGTTGCTACTGATGATCTTACAGTGGAGGATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTCAATTCACTCTTCGAGCGTCTTAATGAAGGACATTCAAAGCCAATTC
SEQ ID NO.11。
本发明另一目的是提供一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒的应用；
总反应体系为25ul；
所述的待测品为样本RNA提取液、阳性对照品和(或)阴性对照品。
本发明的有益效果是：
(1)流感筛选便捷，采用双重PCR扩增体系，一管检测甲型流感病毒和乙型流感病毒，缩短检测时间；
(2)准确性好，采用内参基因监控的检测体系，保证检测结果的可靠性；
(3)精密度高，试剂盒对中值和低值精密度标准品重复检测10次，中值cv<1％，低值cv<2％；
(4)检测时间短，试剂盒自带咽拭子和血液样本RNA提取液，核酸提取仅需5min，扩增仅需70min，整个检测时间仅需75min，非常适宜于流感疫情筛查与监控。
利用本发明对咽拭子样本和血液进行快速分型检测，将检测时间(含提取和扩增)由常规4h缩短至2h以内，对于卫境安全防护具有重要应用价值。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测灵敏度结果；
图2为本发明试剂盒检测精密度结果；
图3为基于本发明试剂盒甲型流感病毒H3N2、H1N1、乙型流感病毒Yamagata临床样本检测结果；
图4为本发明试剂盒检测特异性结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1
一、核酸提取(在样本处理区进行)
1.1取50μl拭子或血清样本，加入5μl FastLyse L4，震荡混匀。将混匀后的样本置于95℃加热2min；将加热后的样本于5 000rpm离心2min，上清可直接作为模板用于RT-qPCR扩增。
1.2阳性对照与阴性对照与待测样本同步进行处理。
二、PCR试剂配制(在试剂准备区进行)
2.1按下列组成配制PCR反应液(n为反应管数)。
PCR反应缓冲液1为16μl×n，infA/infB为2μl×n，酶系3为2μl×n。(使用前确保PCR 反应缓冲液、引物探针混合液充分溶解，酶系在使用前需离心以确保所有酶集中在底部)
2.2将PCR反应液按20μl/管分装至PCR反应管中，将装有PCR反应液的反应管移至样本处理区。
三、加样(在样本处理区进行)
用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有 PCR反应液的PCR反应管中。盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区。
四、PCR扩增检测(在扩增检测区进行)
4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。
4.2循环参数设定：(ABI 7500，SLAN96P)：
五、检测结果解释
5.1阴性结果判定：如果样本FAM通道扩增曲线不呈S型、Ct值为UNDET，内参HEX通道扩增曲线呈S型且结果Ct值<35，则结果为阴性；若内参HEX通道扩增曲线不呈S型或结果Ct值≥35，则应对样本进行复检。
5.2阳性结果判定：如果样本FAM通道扩增曲线呈S型且Ct值≤38，则结果为阳性。
5.3实验灰度区：如果样本FAM通道扩增曲线呈S型且结果38<Ct<40，则结果位于实验灰度区，应对样本进行复检，复检结果若扩增曲线呈S型，则判定结果为阳性，若扩增曲线不呈S型，则判定结果为阴性。
实施例2
以企业自制的中、低两个浓度(1×104PFU/ml、1×103PFU/ml)的甲型和乙型流感病毒企业参考品作为待检样本，用质检合格的甲型/乙型流感分型测试剂盒进行检测，每种8次重复检测。在ABI7500仪器进行检测。计算检测结果Ct值变异系数。甲流的中值精密度批内Ct 值变异系数cv≤2％，低值精密度批内Ct值变异系数cv≤1％；乙流的中值精密度批内Ct值变异系数cv≤1％，低值精密度批内Ct值变异系数cv≤2％，精密度结果好。
实施例3
采用质检合格的甲型和乙型流感病毒核酸分型检测试剂盒对H3N2、H1N1、乙型流感病毒Yamagata阳性样本进行检测，3例样本编号分别为1-3，为保证试剂盒检测结果可信，设置阴性寄阳性对照。
试剂盒检测结果为
实施例4
选择与流感病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他病原体，如与副流感病毒I型、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒为待检样本，用质检合格的20130401、20130402、20130403三批甲型/乙型流感病毒核酸分型检测试剂盒进行检测，操作严格按照试剂盒说明书进行，在ABI7500实时荧光定量PCR仪器上进行检测，检测结果均为阴性，表明试剂盒特异性好。
序列表
<110> 连云港出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心
<120> 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctaaccgag gtcgaaacgt a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actttccagt ctctgcgcg 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccatcaggc cccctcaaag ccga 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggaggatg aagaagatgg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaattggct ttggatgtcc t 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcggatcct caaytcactc ttcgag 26
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccagcagtt tggccc 16
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccttaatgt cacgcacgat 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accaccacgg ccgagcgg 18
<210> 10
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgaaagatg agccttctaa ccgaggtcga aacgtatgtt ctctctatcg ttccatcagg 60
ccccctcaaa gccgagatcg cgcagagact tgaagatgtc tttgctggga aaaacacaga 120
tcttgaggct ctcatggaat ggctaaagac aagaccaatt ct 162
<210> 11
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggcttgttg ctaaacttgt tgctactgat gatcttacag tggaggatga agaagatggc 60
catcggatcc tcaattcact cttcgagcgt cttaatgaag gacattcaaa gccaattc 118

Claims (7)

1.一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒，用于甲型流感病毒和乙型流感病毒样本RNA快速分型检测，其特征在于，包括咽拭子和血液样本RNA快速提取试剂、PCR扩增试剂和对照试剂；所述的PCR扩增试剂包括PCR反应缓冲液1、酶系3、infA/infB引物探针混合液；所述的对照试剂包括阴性对照品和阳性对照品；
所述的咽拭子和血液样本RNA快速提取试剂由0.1％～1.0％(W/V)NLS，300mM～800mMDTT，1×TE Buffer配制而成；
所述的PCR反应缓冲液1包括5*RT-PCR反应Buffer(50mM tris-HCL，75mM Kcl，3mMMgcl2,10mM DTT)，dNTPs，Mgcl2；
所述的酶系3包括Hs Hi Taq DNA聚合酶、Super-M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂；
所述的infA/infB引物探针混合液包括甲型流感病毒检测引物探针、乙型流感病毒检测引物探针、人内源基因β-actin检测引物探针。
2.根据权利要求1所述的一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述的甲型流感病毒检测引物探针、乙型流感病毒检测引物探针、人内源基因β-actin检测引物探针按照下列比例：
甲型流感病毒
infA上游引物：TCTAACCGAGGTCGAAACGTA SEQ ID NO.1
infA下游引物：ACTTTCCAGTCTCTGCGCG SEQ ID NO.2
infA探针：5’-荧光报告基团-TCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-荧光淬灭基团-3’
SEQ ID NO.3
乙型流感病毒
infB上游引物：GTGGAGGATGAAGAAGATGGC SEQ ID NO.4
infB下游引物：CGAATTGGCTTTGGATGTCCT SEQ ID NO.5
infB探针：5’-荧光报告基团-ATCGGATCCTCAAYTCACTCTTCGAG荧光淬灭基团-3’
SEQ ID NO.6
β-actin上游引物：CCCAGCAGTTTGGCCC SEQ ID NO.7
β-actin下游引物：TCCTTAATGTCACGCACGAT SEQ ID NO.8
β-actin探针：5’-荧光报告基团-ACCACCACGGCCGAGCGG荧光淬灭基团-3’
SEQ ID NO.9。
3.根据权利要求1或2所述的一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述的咽拭子和血液样本RNA快速提取试剂由0.4％(W/V)NLS、400mM DTT、1×TEBuffer配制而成。
4.根据权利要求2所述的一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY5荧光报告基团，所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA荧光淬灭基团。
5.根据权利要求2所述的一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述的甲型流感病毒引物探针比例为：SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2：SEQ ID NO.3为400nM：400nM：200nM；所述的乙型流感病毒引物探针比例为：SEQ ID NO.4：SEQ ID NO.5：SEQ IDNO.6为600nM：600nM：300nM；所述的β-actin引物探针比例为：SEQ ID NO.7：SEQ ID NO.8：SEQ ID NO.9为300nM：300nM：100nM。
6.根据权利要求2所述的一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有SEQ ID NO.10所示infA目的扩增片段的质粒，和/或含有SEQ IDNO.11所示infB目的扩增片段的质粒或经基因工程改建而成的质粒菌；
所述infA扩增目的片段序列为：
TTGAAAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCTGGGAAAAACACAGATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATT
SEQ ID NO.10
所述infB扩增目的片段序列为：
AGGCTTGTTGCTAAACTTGTTGCTACTGATGATCTTACAGTGGAGGATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTCAATTCACTCTTCGAGCGTCTTAATGAAGGACATTCAAAGCCAATTC
SEQ ID NO.11。
7.一种权利要求1～6中任一项所述的甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒的应用，其特征在于，
所述的待测品为样本RNA提取液、阳性对照品和(或)阴性对照品。
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