CN105441595B - 一种用于检测hbv-b/c的数字pcr绝对定量分型检测试剂盒 - Google Patents

一种用于检测hbv-b/c的数字pcr绝对定量分型检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测HBV‑B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法；所述试剂盒包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV‑B病毒基因阳性质控、HBV‑C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；方法包括如下步骤：1）受检样品处理；2）质控品的处理；3）配制数字PCR反应混合液；4）生成微反应液滴，并进行数字PCR反应扩增；5）读取荧光信号，分析HBV型别并计算各自拷贝数。本发明采用数字PCR技术和双色荧光探针，同时检测HBV的两个亚型，且不依赖于外来标准物及标准曲线，操作简便，可直接对HBV精准绝对定量。

Description

一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子诊断生物学技术领域，具体涉及一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
乙型肝炎病毒是导致人类急性和慢性乙型肝炎的病原体，它能引起肝脏细胞的严重损伤，并且持久稳固的HBV感染与肝硬化及肝癌的发生密切相关，对人类的健康危害极大。据估计，全世界感染过HBV的人数大约有20亿，并且超过3.5亿的感染者具有持久稳固和慢性感染；每年因HBV感染导致的相关疾病死亡人数可达60万-100万。HBV在世界各地的流行感染率差别极大，在亚洲东部地区HBV的感染流行率最高，而在北美和欧洲的西北部地区流行率很低。中国HBV感染人数超过7亿，其中约1.2亿携带者，3000万慢性感染者，每年新增HBV感染人数约50万，是世界上HBV感染率最高的国家之一。
不同HBV基因型可以导致不同的临床表现及预后。有研究表明基因B型感染者较C型感染者较少发生肝损害，且基因B型感染者较C型不易发展至肝硬化、炎症程度较轻；基因C型感染者其肝脏炎症坏死评分高于基因B型感染者，基因C型感染者容易发展为肝硬化和肝癌。在中国主要流行HBV-B/C型。因此，HBV基因分型检测可以在乙肝炎患者的临床类型、预后判断及治疗方法的选择等方面发挥重要的作用。
乙型肝炎病毒表面抗原的血清学检测在HBV感染的诊断中起着重要作用。目前采用免疫学方法检测HBV血清学标志物广泛用于急、慢型感染的诊断、疗效观察和预后判断。然而，由于HBV亚型和变异株的存在以及病毒的免疫逃逸，即使在HBV携带者血液中，检测不到HBsAg且抗HBsAg抗体阳性，仍然不能确定该携带者体内的HBV已经完全清除，也不能排除其他将来发生与HBV感染相关的严重肝脏疾病并发症的可能。HBV的血清学诊断是间接诊断，不能直接反映病原体的存在，故用这些血清学标志物检测疾病的发展有一定的限制。分子诊断技术的引入为直接和真实地反映患者体内病毒复制水平，以及判断患者病情、疗效和预后提供了可能。
目前HBV基因分型的分子诊断主要包括核酸杂交法、基因芯片和荧光PCR法等。其中核酸杂交包括斑点杂交、液相杂交、支链DNA技术等方法，但是由于杂交步骤较为繁琐，在大样本研究中耗时较长，易导致交叉杂交反应，而存在着一定的不足；基因芯片由于其成本较高，制作工艺复杂，而且信号检测需要专门的仪器设备，限制了其在临床上的应用。目前认为实时荧光定量PCR技术是检测HBV DNA以及分型的最好方法，该技术目前被公认为第二代定量PCR技术，但其定量需要参考标品、标准曲线和内标校正，对有限的标本材料以及低拷贝数HBV的准确定量仍存在一定的应用限制。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法，用于克服现有检测技术中步骤繁杂、耗时较长、易导致交叉杂交反应、需要进行定量矫正、准确度不高等不足之处，且具有准确度高、灵敏度高、精确度高、重现性好的特点。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；
所述数字PCR反应缓冲液A中包括有HBV-B型的引物及探针和HBV-C型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B中包括有内标的引物及探针；所述HBV-B型、HBV-C型和内标的引物及探针如下所示：
HBV-B型和HBV-C型通用上游引物：
ctagactcgtggtggacttctc；
HBV-B型和HBV-C型通用下游引物：
atgaggcatagcagcaggat；
HBV-B型探针：tcgcagtcccaaatctccagtcactc；
HBV-C型探针：tcgcagtccccaacctccaatca；
内标上游引物：ctgccgttactgccctgtg；
内标下游引物：ttggtctccttaaacctgtcttg；
内标探针：accaccaacttcatccacgttcacc；
所述HBV-B型探针5’端荧光报告基因为FAM，HBV-C型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针3’端淬灭基团均为BHQ；
所述HBV-B病毒基因阳性质控为HBV-B的标准质粒溶液；所述HBV-C病毒基因阳性质控为HBV-C的标准质粒溶液；
所述阴性质控为灭菌生理盐水；
所述内标溶液为β-globin的标准质粒溶液。
一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测方法，采用上述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
（1）受检样品处理：将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100~105℃恒温处理10~16分钟，再于12,000~14,000rpm/min离心5~10分钟，取上清液，获得PCR扩增样品DNA模板；
（2）质控品的处理：分别取所述试剂盒中的HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控，按照与步骤（1）相同的方法处理，分别得到HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的DNA模板；
（3）配制数字PCR反应混合液：向步骤（1）和步骤（2）处理后得到的样品DNA模板、HBV-B病毒基因阳性质控DNA模板、HBV-C病毒基因阳性质控DNA模板和阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别采用数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制；
（4）将步骤（3）制备的样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10,000~20,000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；
（5）读取荧光信号：步骤（4）PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM和/或VIC通道中进行HBV-B和/或HBV-C的分型检测，通过Quanta soft软件进行定量分析，计算出HBV-B型和/或HBV-C型的拷贝数。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明通过创造性的试验研究设计出扩增HBV-B型和C型的引物及双色荧光探针，使这些引物能够很好地与模板DNA上目标片段结合，而不会与模板DNA上目标片段以外的区域结合，具有良好的PCR扩增特异性，进而将这些引物和探针加入数字PCR反应缓冲液中，可以使样品的特异性PCR反应产物可以分别在FAM和VIC通道中进行HBV-B和HBV-C的分型检测，准确定量出HBV两种亚型的拷贝数，检测效果更高、检测数据结果更加精确。
2、本发明用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测方法，基于数字PCR平台对HBV-B/C含量进行绝对定量检测，检测方法中主要依靠数字PCR技术和双色荧光探针，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值（CT）进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线和看家基因来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，直接数出DNA分子的个数，大大简化操作步骤，使该方法检测时间仅需要3小时，有效节约了准备时间和检测时间，且结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点，检测灵敏度及精确性都达到精准定量的要求，提高了检测的灵敏度和精确性。
3、本发明检测方法在HBV含量极低的组织样品检测中，通过微滴化处理可以大大减少背景和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝，而不会受到背景DNA或杂质的干扰，克服了现有实时荧光定量PCR技术无法精确对低丰度基因进行定量的不足之处。
4、本发明试剂盒可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广条件，具有良好的市场前景。
附图说明
图1为FAM通道检测HBV-B/C引物及探针特异性；
图2为VIC通道检测HBV-B/C引物及探针特异性；
图3为VIC通道检测HBV-C/B引物及探针特异性；
图4为FAM通道检测HBV-C/B引物及探针特异性；
图5为阴性样品的荧光检测结果；
图6为HBV-B感染样品的荧光检测结果；
图7为HBV-C感染样品的荧光检测结果。
具体实施方式
为更好地理解本发明的内容，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应该理解，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
一、一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；
所述DNA提取液包括50 mM pH 8.3的Tris-HCl，0.5 M NaCl，5 mM EDTA，质量浓度为2.5%的CTAB和2 mM的DTT；
所述数字PCR反应缓冲液A包括HBV-B型的引物及探针和HBV-C型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B包括内标的引物及探针；所述HBV-B型、HBV-C型和内标的引物及探针如下所示：
HBV-B型和HBV-C型通用上游引物：
CTAGACTCGTGGTGGACTTCTC；
HBV-B型和HBV-C型通用下游引物：
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT；
HBV-B型探针：TCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTC；
HBV-C型探针：TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCA；
内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG；
内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG；
内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC；
所述HBV-B型探针5’端荧光报告基因为FAM，HBV-C型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针3’端淬灭基团均为BHQ；
所述HBV-B病毒基因阳性质控为HBV-B的标准质粒溶液，该标准质粒溶液的浓度可以是100 copies/μL；所述HBV-C病毒基因阳性质控为HBV-C的标准质粒溶液，该标准质粒溶液的浓度可以是100 copies/μL；
所述阴性质控为灭菌生理盐水；
所述内标溶液为β-globin的标准质粒溶液，该标准质粒溶液的浓度可以是100copies/uL。
上述数字PCR反应缓冲液A可以包括：4 mM MgCl2、50 mM pH 8.3的Tris-HCl、300mM dNTP、900 nM所述 HBV-B型和HBV-C型通用上游引物、900 nM 所述HBV-B型和HBV-C型通用下游引物、250 nM所述 HBV-B探针和250 nM所述 HBV- C探针；
所述数字PCR反应缓冲液B可以包括：4 mM MgCl2、50 mM pH 8.3的Tris-HCl、300mM dNTP、900 nM所述内标上游引物、900 nM所述内标下游引物和250 nM 所述内标探针。
上述数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B中还可以均含有热启动Taq酶和UDG酶，其中Taq酶和UNG酶的浓度均为1U/μL。
二、一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型的检测方法，采用上述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
（1）受检样品处理：将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100~105℃恒温处理10~16分钟，再于12,000~14,000rpm/min离心5~10分钟，取上清液，获得PCR扩增样品DNA模板；
（2）质控品的处理：分别取所述试剂盒中的HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控，按照与步骤（1）相同的方法处理，分别得到HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的DNA模板；
（3）配制数字PCR反应混合液：向步骤（1）和步骤（2）处理后得到的样品DNA模板、HBV-B病毒基因阳性质控DNA模板、HBV-C病毒基因阳性质控DNA模板和阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别采用数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制；
（4）将步骤（3）制备的样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10,000~20,000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；
（5）读取荧光信号：步骤（4）PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM和VIC通道中进行HBV-B和HBV-C的分型检测，通过Quanta soft软件进行定量分析，计算出HBV-B型和/或HBV-C型的拷贝数。
上述检测方法中，步骤（1）所述灭菌水、DNA提取液和内标溶液的体积比可以为100:100:1。
步骤（3）中所述数字PCR反应缓冲液、灭菌水和DNA模板的体积比可以为2:1:1。
步骤（4）中的数字PCR扩增反应条件可以为：95℃变性5分钟；95℃变性10秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃变性10分钟，4℃停止反应。
三、HBV-B/C引物探针设计和特异性检测：
1、HBV-B/C病毒通用引物和探针设计
为了能够利用数字PCR的方法检测样品中的HBV-B/C病毒，根据NCBI公布的HBV-B/C基因序列，设计可以扩增HBV-B型和C型的通用引物、探针。
2、引物特异性验证
为验证所设计的引物和探针的特异性，设计单重数字PCR反应，用上述检测试剂盒和方法进行检测，具体包括如下步骤：
1）取HBV-B、C型病毒阳性临床样品（样品来自西南医院）进行，按照以下步骤提取核酸DNA；
2）向样品收集管中加入2 mL无菌生理盐水，将样品完全侵入液体中，充分震荡混匀，将全部液体转移至相应样品编码的离心管中；
3）将相应样品溶液的离心管于10,000 rpm/min离心3分钟，弃上清；
4）向步骤3）弃上清后的离心管中重新加入1 mL无菌生理盐水，充分震荡洗涤，于10,000rpm/min离心3分钟，弃上清；
5）向步骤5）离心弃上清后的离心管中加入500 µL灭菌水，充分震荡混匀；
6）取200 µL步骤5）震荡均匀后的溶液，加入500 µL DNA提取液（50 mM Tris-HCl（pH8.3），0.5 M NaCl，5 mM EDTA，1.5%的CTAB，2 mM的DTT）和5 µL的内标溶液（100copies/ul的β-globin的标准质粒），剧烈震荡混匀15秒；
7）将上述混合并震荡均匀的溶液，于100℃恒温处理10分钟，再于12,000 rpm离心5分钟，取上清液，分别得到PCR扩增DNA模板，备用。
8）配制数字PCR反应混合液，在各反应管中加入HBV-B、C型的引物和探针；配制好的数字PCR反应混合液中含有10 µL相应数字PCR反应缓冲液（内含Taq酶、dNTP、相应引物探针组合）、5 µL步骤7）提取的相应DNA模板和5µL灭菌水；
9）将上述步骤8）配制好的数字PCR反应混合液放置于微滴生成器中，制作油包水微反应液滴；再放置于PCR仪中，进行数字PCR扩增，扩增程序为：95℃变性5分钟；95℃变性10秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃变性10分钟，4℃停止反应。
10）步骤9）扩增结束后，放置PCR微反应液滴信号读取仪中进行信号收集，在FAM和VIC通道分别检测FAM和VIC荧光信号，验证引物特异性。以HBV-B型DNA为模板，同时用HBV-B、HBV-C的通用引物和探针进行检测，只有FAM通道检测到信号详见图1，而VIC通道未检测到信号详见图2；以HBV-C型DNA为模板，同时用HBV-B、HBV-C的通用引物和探针进行检测，只有VIC通道检测到信号详见图3，而FAM通道未检测到信号详见图4。由上述可以看出，本发明引物特异性良好。
四、利用上述试剂盒，对没有被HBV-B/C型感染的阴性样品、感染HBV-B型样品及感染HBV-C型样品进行绝对定量分型检测，检测操作如下：
1、样本处理与DNA提取（在样本制备区）
1）向样品收集管中加入2 mL无菌生理盐水，使样品完全侵入液体中，充分震荡混匀，将全部液体转移至相应样品编码的离心管中；
2）将相应样品溶液的离心管于10,000 rpm/min离心3分钟，弃上清；
3）向步骤2）弃上清后的离心管中重新加入1 mL无菌生理盐水，充分震荡洗涤，于10,000rpm/min离心3分钟，弃上清；
4）向步骤3）离心弃上清后的离心管中加入500 µL灭菌水，充分震荡混匀；
5）取200 µL步骤4）震荡均匀后的溶液，加入500 µL DNA提取液（50 mM Tris-HCl（pH8.3），0.5 M NaCl，5 mM EDTA，1.5%的CTAB，2 mM的DTT）和5 µL的内标溶液（100copies/ul的β-globin特异扩增区的标准质粒），剧烈震荡混匀15秒；
6）将上述混合并震荡均匀的溶液，于100℃恒温处理10分钟，再于12,000 rpm离心5分钟，取上清液，得到PCR扩增DNA模板，备用。
2、质控品处理（样本制备区）
分别取所述试剂盒中的HBV-B/C阳性质控（100 copies/ul HBV-B/C特异扩增区的标准质粒混合液）、阴性质控离心管（灭菌生理盐水），按照上述“1、样品处理与DNA提取”相同的步骤进行操作，分别得到相应的DNA模板。
3、数字PCR试剂准备（试剂准备区）
取PCR反应管，依次按照以下配比分别配制阳性质控、阴性质控、样品的数字PCR反应混合液，具体配比如下表1所示；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别由数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制。
表1 数字PCR反应混合液的配比
组分 体积（µL）
相应数字PCR反应缓冲液（内含Taq酶、dNTP、相应引物探针组合） 10
相应的DNA模板 5
灭菌水 5
总体积 20
采用上述配比配制完相应的数字PCR反应混合液后，盖紧PCR反应管管盖，于8,000rpm/min离心数秒后转移至扩增区。
4、微反应液滴生成（扩增和产物分析区）
将步骤3配制好的相应数字PCR反应混合液置于液滴生成器内，按照仪器使用说明进行操作，实现对反应体系的分液处理，将制备好的相应PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10,000 ~20,000个。
5、数字PCR扩增
将步骤4装有相应PCR微反应液滴的96孔PCR板放入PCR仪，按照下面条件进行PCR扩增反应；进行数字PCR扩增反应条件为：95℃变性5分钟；95℃变性10秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃变性10分钟，4℃停止反应。
6、信号读取
PCR扩增反应后，将PCR反应板放置PCR微反应液滴信号读取仪中进行信号收集，分别在FAM和VIC通道检测FAM和VIC荧光信号。FAM通道检测HBV-B，VIC通道检测HBV-C，根据荧光微滴数量，通过Quanta soft软件对各自通道样品进行定量。
阳性对照在FAM通道和VIC通道中检测到，即FAM通道检测到HBV-B阳性质粒，VIC通道检测到HBV-C阳性质粒，根据荧光微滴数，通过配套软件Quanta soft计算，可以计算出HBV-B/C的拷贝数。阴性对照为生理盐水，在FAM和VIC通道都无检测反应，阴性对照反应微滴数应为0，计算出来的拷贝数为0。
本实施例中，各种样品共32份。无任何HBV-B/C感染的阴性样品，通过FAM通道和VIC通道检测，都无信号，阴性样品定量结果为0 copies/ul，图5为一阴性样品分析结果。仅被HBV-B型感染的样品，在FAM通道中被检测到，VIC通道中无反应，通过软件对FAM通道微滴数计算，HBV-B的拷贝数为50 ~ 1205 copies/ul，图6为一仅HBV-B感染样品分析结果。仅被HBV-C型感染的样品，在FAM通道中检测不到信号，而在VIC通道中能够检测到，软件计算拷贝数为210 ~ 1600 copies/ul，图7为一仅HBV-C型感染的分析结果。
本发明提供的方法和试剂盒可以在具有数字PCR的实验室完成，检测时间仅需要3小时，结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点；本发明试剂盒可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广条件。
在说明书中，本发明已参照特定的实施例做了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离发明的精神和范围。因此，说明书被认为是说明性的而非限制性的。
<110> 唐小龙；
<120> 一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法；
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-B型和HBV-C型通用上游引物
<400> 1
ctagactcgt ggtggacttc tc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-B型和HBV-C型通用下游引物
<400> 2
atgaggcata gcagcaggat 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-B型探针
<400> 3
tcgcagtccc aaatctccag tcactc 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-C型探针
<400> 4
tcgcagtccc caacctccaa tca 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内标上游引物
<400> 5
ctgccgttac tgccctgtg 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内标下游引物
<400> 6
ttggtctcct taaacctgtc ttg 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内标探针
<400> 7
accaccaact tcatccacgt tcacc 25

Claims (9)

1.一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；
所述数字PCR反应缓冲液A中包括有HBV-B型的引物及探针和HBV-C型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B中包括有内标的引物及探针；所述HBV-B型、HBV-C型和内标的引物及探针如下所示：
HBV-B型和HBV-C型通用上游引物：
ctagactcgtggtggacttctc；
HBV-B型和HBV-C型通用下游引物：
atgaggcatagcagcaggat；
HBV-B型探针：tcgcagtcccaaatctccagtcactc；
HBV-C型探针：tcgcagtccccaacctccaatca；
内标上游引物：ctgccgttactgccctgtg；
内标下游引物：ttggtctccttaaacctgtcttg；
内标探针：accaccaacttcatccacgttcacc；
所述HBV-B型探针5’端荧光报告基因为FAM，HBV-C型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针3’端淬灭基团均为BHQ；
所述HBV-B病毒基因阳性质控为HBV-B的标准质粒溶液；所述HBV-C病毒基因阳性质控为HBV-C的标准质粒溶液；
所述阴性质控为灭菌生理盐水；
所述内标溶液为β-globin的标准质粒溶液；
所述试剂盒具体使用方法包括如下步骤：
（1）受检样品处理：将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100 ~ 105℃恒温处理10 ~ 16分钟，再于12,000 ~ 14,000rpm/min离心5 ~ 10分钟，取上清液，获得PCR扩增样品DNA模板；
（2）质控品的处理：分别取所述试剂盒中的HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控，按照与步骤（1）相同的方法处理，分别得到HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的DNA模板；
（3）配制数字PCR反应混合液：向步骤（1）和步骤（2）处理后得到的样品DNA模板、HBV-B病毒基因阳性质控DNA模板、HBV-C病毒基因阳性质控DNA模板和阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别采用数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制；
（4）将步骤（3）制备的样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10,000 ~ 20,000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；
（5）读取荧光信号：步骤（4）PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM和/或VIC通道中进行HBV-B和/或HBV-C的分型检测，通过Quanta soft软件进行定量分析，计算出HBV-B型和/或HBV-C型的拷贝数。
2.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液的成分包括50mM pH 8.3的Tris-HCl、0.5M的NaCl、5 mM 的EDTA、质量浓度2.5%的CTAB和2 mM的DTT。
3.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液A的成分包括4 mM MgCl2 、50mM pH8.3的Tris-HCl、300 mMdNTP、900 nM所述HBV-B型和HBV-C型通用上游引物、900 nM所述HBV-B型和HBV-C型通用下游引物、250 nM所述HBV-B探针和250 nM所述HBV-C探针。
4.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液B的成分包括4mM MgCl2 、50mM pH8.3的Tris-HCl、300mMdNTP、900 nM所述内标上游引物、900 nM所述内标下游引物和250 nM所述内标探针。
5.根据权利要求3或4所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B的成分中还均含有热启动Taq酶和UNG酶；其中，Taq酶和UNG酶的浓度均为1U/μL。
6.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，所述HBV-B的标准质粒溶液、HBV-C的标准质粒溶液和β-globin的标准质粒溶液浓度均为100 拷贝/μL。
7.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，步骤（1）中所述灭菌水、DNA提取液和内标溶液的体积比为100:100:1。
8.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，步骤（3）中所述数字PCR反应缓冲液、灭菌水和DNA模板的体积比为2:1:1。
9.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，步骤（4）中的PCR扩增反应条件为：95℃变性5分钟；95℃变性10秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃变性10分钟，4℃停止反应。
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