CN106520763A - 一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒 - Google Patents

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CN106520763A CN201611099305.8A CN201611099305A CN106520763A CN 106520763 A CN106520763 A CN 106520763A CN 201611099305 A CN201611099305 A CN 201611099305A CN 106520763 A CN106520763 A CN 106520763A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒。该组合物检测所用标本为血液，无创、方便获取且可大规模应用；主要基于数字PCR技术和Taqman探针，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接数出DNA分子个数，大大简化操作步骤，有效节约了检测时间；对HBV pgRNA检测是绝对定量，显著有别于real‑time PCR方法的相对定量；所述的检测组合物在HBV pgRNA含量极低的样品检测中，通过微滴化处理可以有效的减少背景干扰和提高检测灵敏度，灵敏度可低至5个拷贝。

Description

一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒。
背景技术
乙型病毒性肝炎(hepatitis B，简称乙肝)系由乙肝病毒(HBV)引起，以乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、肝大及肝功能异常为主要临床表现。部分病例有发热和黄疸；少数病例病程迁延转为慢性，或发展为肝硬化甚至肝癌；重者病情进展迅猛可发展为重型肝炎；另一些感染者则成为无症状的病毒携带者。
HBV-DNA定量检测指标降低在乙肝治疗中有着非常重要的意义，是乙肝转阴的前奏，也是康复最为关键的一步，只有体内的HBV-DNA定量指标降低，病毒的复制繁殖才会停止，乙肝的彻底治愈才有希望。
乙肝病毒DNA检测的临床意义一、对医生的诊断和用药非常重要。通过乙肝病毒DNA检测能够判定判断乙肝患者适合用哪类抗病毒药物；乙肝病毒DNA检测对用药的剂量、用药时间、是否需要联合用药以及用药的效果等提供重要的参考依据，也是临床上评价抗病毒或免疫增强药物疗效的最客观的指标。乙肝病毒DNA检测的临床意义二、能够直接反映乙肝病毒复制状态及传染性的最佳指标，通过乙肝病毒DNA的含量能直接反映病毒在体内存在的数量、是否传染，传染性有多强。但是需要说明的一点是:乙肝病毒载量的多少并不代表肝脏的损伤程度，也无法判断病情的严重程度。乙肝病毒DNA检测的临床意义三、反映病毒复制的活跃程度，间接地反映机体的免疫应答水平。
目前，实时荧光定量PCR(real-time PCR)是核酸(DNA或RNA)定量检测的主要方法。现已报道的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法都是基于real-time PCR技术。但这种定量方法需要参考品、标准曲线以及内标校正，检测结果只是一个相对定量的结果，并不能够进行绝对定量，灵敏度也相对较低，尤其是对低拷贝数HBV PgRNA的定量仍存在一定的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒。该组合物能够对HBV pgRNA进行绝对定量，可以有效的减少背景干扰和提高检测灵敏度，灵敏度可低至5个拷贝。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种组合物，包括引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID No.1～3所示；所述探针的序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了所述的组合物在制备扩增和/或检测乙型肝炎病毒的试剂和/或试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒为HBV pgRNA。
在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增和/或检测为痕量扩增和/或痕量检测，所述检测的灵敏度为5个拷贝/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增和/或检测的反应体系为：
或
在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增和/或检测的反应程序为：
在本发明的一些具体实施方案中，扩增和/或检测乙型肝炎病毒具体为：由序列如SEQ ID No.2所示的上游引物、序列如SEQ ID No.3所示的下游引物和序列如SEQ ID No.4所示的探针定量检测HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)，再由序列如SEQ ID No.1所示的上游引物、序列如SEQ ID No.3所示的下游引物和序列如SEQ ID No.4所示的探针定量检测PreC-mRNA，取HBV RNA和PreC-mRNA的定量结果之差获得HBV pgRNA的含量。
HBV pgRNA结构特点：HBV pgRNA基因结构特殊，它的起始位置(nt1820)距离PreC-mRNA基因的起始位置(nt1788)较近，同时二者基因终点相同(图1)。因此，本发明提供的HBVpgRNA基因定量的策略是：先用引物2(上游引物)和引物3(下游引物)定量HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)总量，再用引物1(上游引物)和引物3(下游引物)定量PreC-mRNA，两者定量结果之差即为pgRNA水平。
本发明还提供了一种试剂盒，包括所述的组合物及分子生物学扩增中常用的助剂。
本发明还提供了一种基于所述组合物或所述试剂盒的扩增和/或检测乙型肝炎病毒的方法，取待测样本获得HBV核酸混合物，去除DNA后，逆转录后经数字PCR，获得HBVpgRNA的含量；
所述检测样本为血清或血浆。
在本发明的一些具体实施方案中，所述数字PCR具体为由序列如SEQ ID No.2所示的上游引物、序列如SEQ ID No.3所示的下游引物和序列如SEQ ID No.4所示的探针定量检测HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)，再由序列如SEQ ID No.1所示的上游引物、序列如SEQ IDNo.3所示的下游引物和序列如SEQ ID No.4所示的探针定量检测PreC-mRNA，取HBV RNA和PreC-mRNA的定量结果之差获得HBV pgRNA的含量。
与现有技术相比，本发明所述的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测组合物达到了如下效果：1、检测所用标本为血液，无创、方便获取且可大规模应用；2、所述的检测组合物主要基于数字PCR技术和Taqman探针，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，直接数出DNA分子个数，大大简化操作步骤，有效节约了检测时间；3、所述的检测组合物对HBV pgRNA检测是绝对定量，显著有别于real-time PCR方法的相对定量；4、所述的检测组合物在HBV pgRNA含量极低的样品检测中，通过微滴化处理可以有效的减少背景干扰和提高检测灵敏度，灵敏度可低至5个拷贝，有效的克服了现有的基于real-time PCR技术的检测方法无法对低拷贝数HBV PgRNA进行定量的不足之处。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示HBV pgRNA的基因结构特点；
图2示血液HBV pgRNA定量检测流程图；
图3示灵敏度检测结果；
图4示特异性检测结果；其中，图4(A)示ddPCR法检测特异性样品的浓度图；图4(B)示ddPCR法检测特异性样品的阳性微滴图。
具体实施方式
本发明公开了一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的技术方案具体如下：
一、引物及探针的设计：
1.HBV pgRNA结构特点：HBV pgRNA基因结构特殊，它的起始位置(nt1820)距离PreC-mRNA基因的起始位置(nt1788)较近，同时二者基因终点相同(如图1所示)。因此，HBVpgRNA基因定量的策略是：先用引物2(上游引物)和引物3(下游引物)定量HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)总量，再用引物1(上游引物)和引物3(下游引物)定量PreC-mRNA，两者定量结果之差即为pgRNA水平。
2.HBV基因型有A-J 9种基因型，在我国以B、C基因型为主，同时存在部分A、D基因型。从GenBank数据库中下载多条A～D基因型HBV参考序列，通过MEGA6.0软件分析不同基因型HBV基因组的保守区域。按照引物和探针的设计原则(尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成、探针的Tm值等)，在这些保守区域中通过Beacondesigner 8.14软件设计出针对HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA检测的特异性引物和探针序列。通过Blast数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对上述引物和探针序列进行序列比对分析，避免与其它病毒或人类基因发生非特异结合。
3.引物和探针的优化：针对HBV pgRNA基因结构特点和HBV基因型的多样性，设计了多对引物和探针，经过多轮筛选和优化，最终确定一套灵敏度和特异度最优的引物和探针。如表1所示。探针的5’端用FAM修饰，3’端用TAMRA修饰。
表1
二、实验方法
1.实验流程：血液HBV pgRNA定量检测流程图见图2。
2.实验步骤：
(1)提取HBV核酸混合物。用QIAamp UltraSens Virus kit(Qiagen,Hilden,Germany)从200-1000μl血清或血浆样本提取HBV核酸混合物。按说明书操作，具体如下：
1)吸取200μl血清样品至2ml的离心管中，再加800μl PBS溶液；
2)加入800μl Buffer AC至离心管中，吸取5.6μl的Carrier RNA溶液至离心管的盖子中，合盖，上下颠倒3次混匀，然后涡旋10秒；
3)静置10min；离心，1200×g，3min；
4)弃上清，加300μl Buffer AR加热至60℃，再加入20μl蛋白酶K,充分涡旋；
5)40℃加热器中加热震荡10min；
6)加300μl Buffer AB，涡旋混匀，短暂离心；
7)吸取700μl的溶解产物至柱中，合盖，离心，3000—5000×g，1min；
8)弃掉收集管，将柱子移至一个新的收集管中，再加入500μl Buffer AW1，离心，6000×g，1min；
9)弃掉收集管，将柱子移至一个新的收集管中，再加500μl Buffer AW2，离心，20000×g，3min；
10)弃掉收集管，将柱子移至一个新的1.5ml收集管中，加30μl BufferAVE，离心，6000×g，1min；
11)重复洗脱，再加30μl Buffer AVE，离心，6000×g，1min。
(2)去除DNA反应。
a.按下列组分配制反应体系：
表2
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl
gDNA Eraser 1.0μl
HBV核酸混合物 7.0μl
合计 10.0μl
b.反应条件：
表3
温度 时间 备注
42℃ 2分钟
4℃ ∞ 保温
(3)逆转录反应。用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa，Dalian，China)对步骤(2)产物进行逆转录反应，将其逆转录成为cDNA。
a.按下列组分配制反应体系：
表4
试剂 使用量
步骤2的反应液 10.0μl
Reverse Transcriptase 1.0μl
RT Primer Mix 4.0μl
5×Reaction Buffer 4.0μl
RNAse free H2O 1.0μl
合计 20.0μl
b.反应条件：
表5
(4)数字PCR反应。以步骤(3)的产物为模板，按表6和表7配置2份反应体系，其中1份加入引物2(序列如SEQ ID No.2所示)和引物3(序列如SEQ ID No.3所示的下游引物)，目的是定量HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)总量；另1份加入引物1(序列如SEQ ID No.1所示的上游引物)和引物3(序列如SEQ ID No.3所示的下游引物)，目的是定量PreC-mRNA；其它组分和用量相同。
a.配制数字PCR反应混合液，按下列组分配制反应体系：
表6
试剂 使用量
2×ddPCR Supermix 10.0μl
序列如SEQ ID No.2所示的上游引物(10μM) 1.0μl
序列如SEQ ID No.3所示的下游引物(10μM) 1.0μl
序列如SEQ ID No.4所示的Probe(10μM) 0.5μl
cDNA 1.0μl
RNAse free H2O 6.5μl
合计 20.0μl
表7
试剂 使用量
2×ddPCR Supermix 10.0μl
序列如SEQ ID No.1所示的上游引物(10μM) 1.0μl
序列如SEQ ID No.3所示的下游引物(10μM) 1.0μl
序列如SEQ ID No.4所示的Probe(10μM) 0.5μl
cDNA 1.0μl
RNAse free H2O 6.5μl
合计 20.0μl
b.将配制好的PCR反应液上样至微滴发生卡，HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10000～20000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应。
c.将生成的微滴从微滴发生卡转移至PCR反应板，然后进行PCR反应，反应条件：
表8
(5)读取荧光信号：步骤(4)PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，在FAM通道中进行HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA的定量检测，通过Quanta soft软件进行定量分析，读出“HBV RNA(PreC-mRNA+pgRNA)”、“PreC-mRNA”的拷贝数。计算出pgRNA的拷贝数。
三、标准品制备
从HepAD38细胞培养上清中的提取HBV核酸混合物(HBV RNA/DNA)，然后去除HBVDNA,经过逆转录后，用高保真酶PrimSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，Dalian,China)、特异性引物1和引物3，通过PCR扩增目的片段，再切胶回收PCR产物，与pEASY-T5载体(TransgenBio,Beijing,China)连接，转入JM109感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上培养后挑选白斑，在LB液体培养基中培养过夜，然后提取质粒DNA，经菌落PCR和测序验证为目的DNA片段后确定为阳性质粒。用分光光度计测定阳性质粒的吸光值，计算拷贝数/mL，然后稀释成107拷贝/mL 106拷贝/mL、105拷贝/mL、104拷贝/mL、103拷贝/mL、102拷贝/mL、101拷贝/mL、5拷贝/mL、1拷贝/mL，-20℃保存备用。
四、检测方法
1.灵敏度检测：选择上述浓度梯度的标准品，用ddPCR方法对每个浓度的样品进行定量检测，从而确定本方法的灵敏度。并与real-time PCR方法检测的结果进行比较。
2.特异性检测：选择HBV阳性血清样品、HBV阴性血清样品(正常人)、生理盐水以及已知单纯甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的血清样品，用ddPCR方法进行检测，从而考查本方法的特异性，并与real-time PCR方法检测的结果进行比较。
3.重复性实验：选择106拷贝/mL、104拷贝/mL的标准品，用ddPCR方法和real-timePCR方法分别进行检测，每个浓度样品重复3次，计算每个样品检测结果的平均值(Mean)、标准差(SD)以及变异系数(CV)。
与现有技术相比，本发明所述的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测组合物达到了如下效果：1、检测所用标本为血液，无创、方便获取且可大规模应用；2、所述的检测组合物主要基于数字PCR技术和Taqman探针，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，直接数出DNA分子个数，大大简化操作步骤，有效节约了检测时间；3、所述的检测组合物对HBV pgRNA检测是绝对定量，显著有别于real-time PCR方法的相对定量；4、所述的检测组合物在HBV pgRNA含量极低的样品检测中，通过微滴化处理可以有效的减少背景干扰和提高检测灵敏度，灵敏度可低至5个拷贝，有效的克服了现有的基于real-time PCR技术的检测方法无法对低拷贝数HBV PgRNA进行定量的不足之处。
本发明提供的组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1引物及探针的设计
HBV pgRNA结构特点：HBV pgRNA基因结构特殊，它的起始位置(nt1820)距离PreC-mRNA基因的起始位置(nt1788)较近，同时二者基因终点相同(图1)。因此，HBV pgRNA基因定量的策略是：先用引物2(上游引物)和引物3(下游引物)定量HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)总量，再用引物1(上游引物)和引物3(下游引物)定量PreC-mRNA，两者定量结果之差即为pgRNA水平。
HBV基因型有A-J 9种基因型，在我国以B、C基因型为主，同时存在部分A、D基因型。从GenBank数据库中下载多条A～D基因型HBV参考序列，通过MEGA6.0软件分析不同基因型HBV基因组的保守区域。按照引物和探针的设计原则(尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成、探针的Tm值等)，在这些保守区域中通过Beacon designer8.14软件设计出针对HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA检测的特异性引物和探针序列。通过Blast数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对上述引物和探针序列进行序列比对分析，避免与其它病毒或人类基因发生非特异结合。
引物和探针的优化：针对HBV pgRNA基因结构特点和HBV基因型的多样性，设计了多对引物和探针，经过多轮筛选和优化，最终确定一套灵敏度和特异度最优的引物和探针。如表9所示。探针的5’端用FAM修饰，3’端用TAMRA修饰。
表9
实施例2
(1)提取HBV核酸混合物。用QIAamp UltraSens Virus kit(Qiagen,Hilden,Germany)从200-1000μl血清或血浆样本提取HBV核酸混合物。按说明书操作，具体如下：
1)吸取200μl血清样品至2ml的离心管中，再加800μl PBS溶液；
2)加入800μl Buffer AC至离心管中，吸取5.6μl的Carrier RNA溶液至离心管的盖子中，合盖，上下颠倒3次混匀，然后涡旋10秒；
3)静置10min；离心，1200×g，3min；
4)弃上清，加300μl Buffer AR加热至60℃，再加入20μl蛋白酶K,充分涡旋；
5)40℃加热器中加热震荡10min；
6)加300μl Buffer AB，涡旋混匀，短暂离心；
7)吸取700μl的溶解产物至柱中，合盖，离心，3000—5000×g，1min；
8)弃掉收集管，将柱子移至一个新的收集管中，再加入500μl Buffer AW1，离心，6000×g，1min；
9)弃掉收集管，将柱子移至一个新的收集管中，再加500μl Buffer AW2，离心，20000×g，3min；
10)弃掉收集管，将柱子移至一个新的1.5ml收集管中，加30μl Buffer AVE，离心，6000×g，1min；
11)重复洗脱，再加30μl Buffer AVE，离心，6000×g，1min。
(2)去除DNA反应。
a.按下列组分配制反应体系：
表10
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl
gDNA Eraser 1.0μl
HBV核酸混合物 7.0μl
合计 10.0μl
b.反应条件：
表11
温度 时间 备注
42℃ 2分钟
4℃ ∞ 保温
(3)逆转录反应。用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa，Dalian，China)对步骤(2)产物进行逆转录反应，将其逆转录成为cDNA。
a.按下列组分配制反应体系：
表12
b.反应条件：
表13
(4)数字PCR反应。以步骤(3)的产物为模板，按表14和表15配置2份反应体系，其中1份加入引物2和引物3，目的是定量HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)总量；另1份加入引物1和引物3，目的是定量PreC-mRNA；其它组分和用量相同。
a.配制数字PCR反应混合液，按下列组分配制反应体系：
表14
试剂 使用量
2×ddPCR Supermix 10.0μl
序列如SEQ ID No.2所示的上游引物(10μM) 1.0μl
序列如SEQ ID No.3所示的下游引物(10μM) 1.0μl
序列如SEQ ID No.4所示的Probe(10μM) 0.5μl
cDNA 1.0μl
RNAse free H2O 6.5μl
合计 20.0μl
表15
b.将配制好的PCR反应液上样至微滴发生卡，HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10000～20000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应。
c.将生成的微滴从微滴发生卡转移至PCR反应板，然后进行PCR反应，反应条件：
表16
读取荧光信号：步骤(4)PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，在FAM通道中进行HBV RNA(pgRNA+PreC-mRNA)和PreC-mRNA的定量检测，通过Quanta soft软件进行定量分析，读出“HBV RNA(PreC-mRNA+pgRNA)”、“PreC-mRNA”的拷贝数。计算出pgRNA的拷贝数。
实施例3标准品制备
从HepAD38细胞培养上清中的提取HBV核酸混合物(HBV RNA/DNA)，然后去除HBVDNA，经过逆转录后，用高保真酶PrimSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，Dalian,China)、特异性引物1(序列如SEQ ID No.1所示)和引物3(序列如SEQ ID No.3所示)，通过PCR扩增目的片段，再切胶回收PCR产物，与pEASY-T5载体(TransgenBio,Beijing,China)连接，转入JM109感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上培养后挑选白斑，在LB液体培养基中培养过夜，然后提取质粒DNA，经菌落PCR和测序验证为目的DNA片段后确定为阳性质粒。用分光光度计测定阳性质粒的吸光值，计算拷贝数/mL，然后稀释成107拷贝/mL 106拷贝/mL、105拷贝/mL、104拷贝/mL、103拷贝/mL、102拷贝/mL、101拷贝/mL、5拷贝/mL、1拷贝/mL，-20℃保存备用。
实施例4灵敏度检测
选择实施例3制得的浓度梯度的标准品，用ddPCR方法对每个浓度的样品进行定量检测，从而确定本方法的灵敏度。并与real-time PCR方法检测的结果进行比较。
表17
结果：
ddPCR方法在大于等于5拷贝/mL样品中每次重复均能检出HBV pgRNA，而在1拷贝/mL样品中部分重复未能检测HBV pgRNA，说明本方法具有较高的灵敏度,检测范围可至5拷贝/mL(如表17、图3所示)。要显著(P＜0.05)高于Real-time PCR方法(103拷贝/mL)
实施例5特异性检测
选择HBV阳性血清样品、HBV阴性血清样品(正常人)、生理盐水以及已知单纯甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的血清样品，用ddPCR方法进行检测，从而考查本方法的特异性，并与real-time PCR方法检测的结果进行比较。
表18
结果：
ddPCR方法在检测HBV阴性样品(正常人)、生理盐水、HAV、HCV样品，均没有阳性微滴(如图4(A)、图4(B)所示)。在低拷贝:如5拷贝/ml、10拷贝/ml的阳性样品中，ddPCR法可检测到阳性微滴，而Real-timePCR方法扩增曲线平直，与阈值线无交点，未能检测到目的基因。因此，表明本方法具有更优(P＜0.05)的特异性。
实施例6重复性实验
选择106拷贝/mL、104拷贝/mL的标准品(实施例3制得)，用ddPCR方法和real-timePCR方法分别进行检测，每个浓度样品重复3次，计算每个样品检测结果的平均值(Mean)、标准差(SD)以及变异系数(CV)。
表19
结果：
ddPCR方法无论在检测高拷贝或低拷贝浓度样品中，均表现出很好的重复性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学附属第二医院
<120> 一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒
<130> MP1617552
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtctgttca ccagcacc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cctctgccta atcatctca 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggtgtcaat gtccatgc 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caaagccacc caaggcacag c 21

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID No.1～3所示；所述探针的序列如SEQ ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的组合物在制备扩增和/或检测乙型肝炎病毒的试剂和/或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乙型肝炎病毒为HBV pgRNA。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述扩增和/或检测为痕量扩增和/或痕量检测，所述检测的灵敏度为5个拷贝/mL。
5.根据权利要求2至4任一项所述的应用，其特征在于，所述扩增和/或检测的反应体系为：
或
6.根据权利要求2至5任一项所述的应用，其特征在于，所述扩增和/或检测的反应程序为：
7.根据权利要求2至6任一项所述的应用，其特征在于，扩增和/或检测乙型肝炎病毒具体为：由序列如SEQ ID No.2所示的上游引物、序列如SEQ ID No.3所示的下游引物和序列如SEQ ID No.4所示的探针定量检测HBV RNA，再由序列如SEQ ID No.1所示的上游引物、序列如SEQ ID No.3所示的下游引物和序列如SEQ ID No.4所示的探针定量检测PreC-mRNA，取HBV RNA和PreC-mRNA的定量结果之差获得HBV pgRNA的含量。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的组合物及分子生物学扩增中常用的助剂。
9.一种基于如权利要求1所述的组合物或如权利要求8所述的试剂盒的扩增和/或检测乙型肝炎病毒的方法，其特征在于，取待测样本获得HBV核酸混合物，去除DNA后，逆转录后经数字PCR，获得HBV pgRNA的含量；
所述检测样本为血清或血浆。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述数字PCR具体为由序列如SEQ IDNo.2所示的上游引物、序列如SEQ ID No.3所示的下游引物和序列如SEQ ID No.4所示的探针定量检测HBV RNA，再由序列如SEQ ID No.1所示的上游引物、序列如SEQ ID No.3所示的下游引物和序列如SEQ ID No.4所示的探针定量检测PreC-mRNA，取HBV RNA和PreC-mRNA的定量结果之差获得HBV pgRNA的含量。
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