CN105907891A - 检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA 的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA 的方法、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，提取pgRNA后，使用RNase‑free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，采用qRT‑PCR的方法达到对pgRNA的定量检测，本申请还提供了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒。本申请，达到了如下效果：1)采用血液检测，无创，常规且可大规模应用；2)可检测血液中超低载量的PgRNA；4)该试剂盒及其在预测NA停药的应用可深入研究中国乙肝PgRNA形态，为开发PgRNA药物提供基础研究数据。给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志”的问题解决提供了方案。

Description

检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的方法、试剂盒及其应用。
背景技术
乙肝病毒颗粒在人体内的生命过程已经研究得很透彻：HBV的复制过程中存在逆转录的步骤，因此其生活周期不同于其它DNA病毒，由于逆转录酶的特性，HBV的突变率要高很多。
HBV DNA在完整病毒中以松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)的形式存在，HBV病毒颗粒进入肝细胞后，脱去外面的衣壳，其rcDNA进入细胞核，形成共价闭合环状DNA(covalentlt closed circular DNA，cccDNA)，以cccDNA为模板，转录形成前基因组RNA(PgRNA)和其它mRNA，PgRNA在逆转录酶的作用下形成rcDNA，rcDNA与相关蛋白组装形成HBV病毒颗粒。一些临床试验的研究结果表明，之所以部分HBV DNA已经检测不到，结果呈现阴性的乙肝患者的病情仍在继续，其根本原因在于患者体内病毒颗粒的核心部件没有清除干净，也没有停止工作。其中，HBV cccDNA就是目前临床上较为公认的“核心部件”之一。但是，现有的拉米夫定(LAM)等NA抗病毒药物并不能完全清除HBV cccDNA，经过较长一段时间抗病毒治疗后的乙肝患者稳定感染的细胞中，细胞核内cccDNA仍旧维持在一定的水平，每个肝细胞内约有5-50个拷贝。但是，HBV cccDNA主要存在于肝脏细胞中，取材及检测都非常困难。
嗜肝DNA病毒科中的乙型肝炎病毒(HBV)是经典的DNA逆转录病毒，其进入细胞后以DNA作为模板转录出四种转录体(RNA)，转录体中有一种称为前基因组RNA，也即是PgRNA。这种RNA上带有包装信号，能够被包装入核心颗粒。研究表明，仅有PgRNA能够被包装入核心颗粒，其它类型的转录体都不能被包装进入核心颗粒，这也就意味着HBV的DNA基因组仅能由包装入核心颗粒的PgRNA逆转录得到，即DNA-RNA-DNA。鉴于PgRNA的在乙肝病毒颗粒复制过程中的重要性，它很可能成为新的NA停药指标。
国内外，现在都没有获批的或科研型的成品商业化试剂盒，故，开发HBV PgRNA成品试剂盒具有一定的市场独家性和应用创新性。另外，在科学研究领域，国内对PgRNA的研究寥寥无几，国外对PgRNA的研究也多集中在与HBV DNA、HBsAg等直接相关性上，没有“PgRNA与抗病毒治疗停药后复发”的关系研究。
现阶段，乙肝治疗的目标是最大限度的长期抑制HBV病毒颗粒的复制，减轻肝细胞炎性坏死及肝纤维化，达到延缓和减少肝功能衰竭、肝硬化失代偿、肝癌及其他并发症的发生，从而改善生活质量和延长生存时间。
在乙肝治疗用药时，现在评估“何时停药”，也即是评估“治疗终点”的指标，除了常规生化指标HBeAg、HBsAg和ALT之外，写入临床指南的分子生物学指标就是HBV DNA，大致情况如下：
1)HBV DNA：依据此指标判断“何时停药”，存在延长治疗的“过度治疗”和停药后复发反弹的“再治疗”问题。另外，临床指南也明确指出此停药指标存在的问题，并提出十大待解决问题之一：寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志。
2)HBV cccDNA：检测HBV cccDNA的技术已不是问题，常见的有RT-PCR(实时聚合酶链式反应技术)和FISH(荧光原位杂交技术)。但是，国内外还没有CFDA/FDA批准的试剂盒应用，国内只存在少数科研型商品化试剂 盒。HBV cccDNA检测应用为何步履维艰、难以推广呢？主要原因有：①cccDNA主要存在于肝细胞中，在血液、组织液中HBV基因组以rcDNA形式存在。若要检测cccDNA，就必须以肝组织为标本。有创活检在绝大多数医院不是常规项目，而且肝组织标本检测cccDNA难度很大；②大量的实验结果表明都没能在外周血单个核细胞中检出cccDNA；③重症肝炎前期及重症期间的患者血清中都未能检出cccDNA；④总之，cccDNA在肝组织中存在的特殊性，导致cccDNA检测技术和应用难度都很大。
3)尽管HBV PgRNA也主要存在于肝细胞中，但是，类似于临床ALT(丙谷转氨酶)、AST(谷草转氨酶)在肝细胞遭到破坏后会释放入血液一样，预测HBV PgRNA也会存在于血液中，并与疾病的严重程度相关。专利预实验结果也已充分证实了乙肝患者血液中存在HBVPgRNA的结论，只是血液中HBV PgRNA含量较低，其本身也较容易被RNase降解。所以，开发稳定、可靠、灵敏的HBV PgRNA定量检测方法是解决问题的技术关键所在，专利已完成相关技术难点的攻关。
4)临床上常用的拉米夫定(LAM)等抗病毒药物抑制的是PgRNA逆转录，而cccDNA的含量又相对稳定，再加上“乙肝病毒DNA基因组仅能由包装入核心颗粒的PgRNA逆转录得到”的特殊地位，血液中的HBV PgRNA含量可能是一个更好的评价患者病情的指标。
5)临床上服用抗病毒药物的患者停药后1年内，约一半的患者表现出持续的病毒学应答，但是还有约50％的患者停药后很快就会复发反弹，专利预测这与患者体内“尽管HBV DNA低载量，但是HBV PgRNA高载量”的原因有关，HBV PgRNA可能成为预测NA停药的新指标。
因此，采用高灵敏度、操作简单、检测时间短的RT-qPCR技术对抗病毒治疗的乙肝患者血液样本实施HBV PgRNA含量的定量测定，给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志” 的问题解决提供了新的思路与可能。
HBV PgRNA：国内外，既没有获批的、科研型的HBV PgRNA成品商业化试剂盒，也没有PgRNA与“NA停药后复发”相关性上的研究。核苷(酸)类似物(NA)抗病毒治疗是抑制PgRNA的逆转录，最终结果是逐渐耗竭肝细胞内的cccDNA，而肝内cccDNA的含量又相对稳定(5-50个拷贝)，再加上近年来的实验研究和专利预实验已证实乙肝患者血液中PgRNA的存在性并可以检测到。故此“血HBV PgRNA定量检测试剂盒”具有市场独家性和应用创新性，有良好的经济前景和应用前景。
发明内容
本申请解决的主要问题是提供检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、试剂盒，以解决无法实现的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明公开了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血3-5ml注入无菌收集管，室温放置；
HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的HBV RNA，获得HBV RNA粗品；
HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase-free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，包括如下步骤：
1)建立如下反应体系：
RNase-Free DNase 10X反应缓冲液1ul；
RNase-Free DNase1ul/ug；
RNA无核酸酶的水补足至10ul；
将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取1-8ul加入如下反应体系中；
2)37℃孵育半小时；
3)加入1ul终止液终止反应；
4)65℃孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；
pgRNA的定量检测：使用qRT-PCR定量检测pgRNA，包括：如下步骤：
1)配制qRT-PCR反应体系，
qRT-PCR反应体系：
PCR反应液 12.5μL；
引物探针混合液 1.5ul；
灭菌蒸馏水 6μL；
所述引物的上游引物包含如SEQ ID NO：3所示的碱基序列；
下游引物包含如SEQ ID NO：6所示的碱基序列；
所述探针，包含如SEQ ID NO：7所示的碱基序列；
2)各反应管在漩涡振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离心后按20μL/管分装至PCR仪样品反应管中待用；
3)将HBV pgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取5μL加入相应的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离心机离心10秒，将管壁上的液体全部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽；
4)将振荡均匀的反应管置于qPCR仪中，根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热循环条件，完成qRT-PCR反应；
结果分析及判定：采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。
优选地，所述PCR的反应条件：(1)预变性的条件，95℃3min；(2)变性的条件，94℃15sec×40个循环；(3)退火，延伸，荧光采集,60℃35sec×40个循环；(4)仪器冷却，25℃1min。
优选地，所述HBV pgRNA的提取的步骤，包括：
1)在样品反应管中加入10μL蛋白酶K、4μL助沉剂、300μL病毒裂解液，20μL磁珠，充分振荡混匀；
2)加入200μL待处理样本，振荡混匀各离心管，室温颠倒混匀10分钟，使磁珠和核酸充分结合；
3)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁珠吸附完全，溶液澄清后弃去上清液，吸附在离心管盖上的磁珠可通过反复颠倒磁力架冲洗下来；
4)加入500μL洗液A,漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离后去上清；
5)加入500μL洗液B,漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离后去上清；
6)将离心管放置在磁力架上，缓慢加入550μL洗液C，静置1分钟磁分离后弃去上清液，取下离心管；
7)加入50μL洗脱液，用移液器缓慢吹打混匀，55℃温育5分钟，期间轻轻晃动溶液两次；
8)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁分离后将上清液转移至新的灭菌离心管中，获得HBV pgRNA粗品。
应用上述方法获得的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO：8所示。
优选地，所述样本处理的步骤，包括：
血清样本采集：抽取静脉血3-5mL，注入无菌收集管，待样本自行析出血清或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清；
血浆样本采集：抽取静脉血3-5mL，注入含有EDTA的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，待样本自行析出血浆或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血浆。
本发明还提供了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要求1所述的引物和探针。
优选地，该试剂盒，还包括：阴性质控品、定量标准品I、定量标准品II、定量标准品III、定量标准品IV。
优选地，所述试剂盒包括：蛋白酶K、助沉剂、病毒裂解液、磁珠、洗液A、洗液B、洗液C、洗脱液、引物探针混合液、反应液、样本稀释液、阴性质控品、定量标准品I、定量标准品II、定量标准品III、定量标准品IV、内标模板，各组份含量为：
本发明提供的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒应用于乙肝患者血液中HBV PgRNA的检测。所述检测包括HBV PgRNA定性检测和 /或定量检测。该试剂盒使用方便，检测灵敏度极高，检测结果可靠。
与现有技术相比，本发明所述的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：
1)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法为血液检测，无创，常规且可大规模应用，解决HBV cccDNA依赖肝穿的问题。
2)本申请提供的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法、试剂盒超越常规病原体RT-PCR技术，可检测血液中超低载量的PgRNA。
3)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测的试剂盒解决临床上依赖HBV DNA指标，判断抗病毒治疗停药后，出现“停药后复发”的问题，给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志”的问题解决提供了方案。
4)HBV PgRNA试剂盒及其在预测NA停药的应用可深入研究中国乙肝PgRNA形态，为开发PgRNA药物提供基础研究数据。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例1所述的qPCR的结果分析图。
图2是本发明实施例1所述的qPCR的结果分析图。
图3是本发明实施例1所述的qPCR的结果分析图。
图4是本发明实施例2所述的实验结果图。
图5是本发明实施例2所述的实验结果图。
图6是本发明实施例2所述的实验结果图。
图7是本发明实施例2所述的实验结果图。
图8是本发明实施例2所述的实验结果图。
图9是本发明实施例2所述的实验结果图。
图10是本发明实施例2所述的实验结果图。
图11是本发明实施例2所述的实验结果图。
图12是本发明实施例2所述的实验结果图。
图13是本发明实施例2所述的实验结果图。
图14是本发明实施例2所述的实验结果图。
图15是本发明实施例2所述的实验结果图。
图16是本发明实施例3所述的实验结果图。
图17是本发明实施例4所述的实验结果图。
图18是本发明实施例4所述的实验结果图。
具体实施方式
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
以下结合附图对本申请作进一步详细说明，但不作为对本申请的限定。
实施例1
1.样本采集：采集血清或血浆。
1)血清样品采集：用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处 抽取静脉血3～5mL，注入无菌收集管，室温放置不超过4小时，待样本自行析出血清或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清，转移到1.5mL灭菌离心管中备用。
2)血浆样品采集：用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血3～5mL，注入含有EDTA的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，室温放置不超过4小时，待样本自行析出血浆或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血浆，转移到1.5mL灭菌离心管中备用。
2.HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的HBV RNA。
实验开始前取出试剂盒所需组分，轻微振荡，使其充分混匀，如试剂中有沉淀，请溶解后使用，样本如为冷冻冷藏检测前先恢复至室温。操作时，如发现管壁和管盖有液体，短暂离心使液体甩入管底，再置于磁力架上。
1)取N+5个1.5mL灭菌离心管(N为需要提取临床样本的数量，另5个离心管用于试剂盒定量标准品及阴性质控品的提取)，分别加入10μL蛋白酶K、4μL助沉剂、300μL病毒裂解液，20μL磁珠(使用前充分振荡混匀)，加入200μL待处理样本，振荡混匀各离心管，室温颠倒混匀10分钟，使磁珠和核酸充分结合。
2)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁珠吸附完全，溶液澄清后弃去上清液，吸附在离心管盖上的磁珠可通过反复颠倒磁力架冲洗下来；
3)加入500μL洗液A,漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离后去上清；
4)加入500μL洗液B,漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离后去上清；
5)将离心管放置在磁力架上，缓慢加入550μL洗液C，静置1分钟磁分离后弃去上清液，取下离心管；
6)加入50μL洗脱液，用移液器缓慢吹打混匀，55℃温育5分钟，期间轻轻晃动溶液两次；
7)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁分离后将上清液转移至新的灭菌离心管中，获得HBV pgRNA粗品。
3.HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase-free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA。
1)建立如下反应体系：
RNase-Free DNase 10X反应缓冲液1ul；
RNase-Free DNase1ul/ug；
RNA无核酸酶的水补足至10ul；
将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取1-8ul加入如下反应体系中；
2)37℃孵育半小时；
3)加入1ul终止液终止反应；
4)65℃孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；
4.pgRNA的定量检测：使用qRT-PCR定量检测pgRNA。
实验开始前取出试剂盒各组分，充分解冻并持续振荡15秒混匀。准备相应数量的PCR仪样品反应管，除样本外还应包括1个阴性质控品及4个定量标准品反应管。
1)配置反应液
确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(5)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下表：
所述引物：上游引物包含如SEQ ID NO：3所示的碱基序列；
下游引物包含如SEQ ID NO：6所示的碱基序列；
所述探针，包含如SEQ ID NO：7所示的碱基序列。
2)在漩涡振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离心后按20μL/管分装至PCR仪样品反应管中待用。
4)将HBV pgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取5μL加入相应的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离心机离心10秒，将管壁上的液体全部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽。
5)根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热循环条件，完成qRT-PCR反应；具体条件如下：
5.结果分析及判定：采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。
采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，以均数±标准差表示，P﹤0.05为差异有统计学意义。
1)pgRNA的定性分析：
检测PCR扩增序列：得到如SEQ ID NO：7所示的碱基序列。
通过“标准曲线法”进行:
由于本申请中PCR扩增产物为159bp，这一段序列为pgRNA独有的序列，其余RNA不含有，所以，在排除HBV DNA污染的情况下：
如果提取液中含有pgRNA，qPCR扩增将出现扩增曲线；
如果提取液中不含有pgRNA，qPCR将没有扩增曲线出现，即为阴性。
2)pgRNA的定量分析：通过“标准曲线法”进行(以BIO-RAD CFX96为例)：
需要4个梯度浓度的标准品，我们采用的是假病毒(或者质粒)，分别为A，B，C，D，其浓度为A：1.0×10^6copies/ml，B：1.0×10^5copies/ml，C：1.0×10^4copies/ml，D：1.0×10^3copies/ml，qPCR结果如图1所示。SPSS21.0统计软件自动绘制标准曲线如图2所示，图中圆圈处为4个定量标准品，×处为待测样本，根据待测样本的Ct值，从标准曲线中读出待测样本的量，软件自动给出结果，如图3所示。由图3可得到：待测样本的Ct值为33.69，相应的pgRNA定量为6.732x10^4copies/ml。
实施例2
引物、探针的设计：
目前，我国HBV基因型以B型和C型为主，还有少量D型，另外还存在少量的上述基因型的融合型。
本发明在设计引物和探针时，同时考虑并兼顾了B型、C型和D型。参照国际公认数据库NCBI中所有HBV B型、C型和D型的序列，经比对后，选取了PgRNA差异于其它mRNA的序列部分，即大约1800bp～2800bp之间的部分进行分析。设计的引物和探针均位于HBV各基因型保守区序列或者相对保守区序列，确保了“专利所用引物和探针”对中国HBV各类常见基因型的兼容性。设计出如SEQ ID NO：1-NO：6所示的碱基序列的引物，如SEQ ID NO：7所示的碱基序列的探针。
引物、探针的筛选：PgRNA特异性引物，共3条上游引物(F1、F2、F3，对应如SEQ IDNO：1-NO：3所示的碱基序列)，3条下游引物(R1、 R2、R3对应如SEQ ID NO：4-NO：6所示的碱基序列)，一条公用探针(FP对应如SEQ ID NO：7所示的碱基序列)：
1.3条上游引物与3条下游引物两两组合共9种组合，所用探针均为FP，所以共9种引物探针组合，具体如下表：
实验结果：通过数次实验多样本的比较，整体实验效果F3组合>F2组合>F1组合，部分实验结果如下图4-图6所示。下次实验挑选出F3组合和F2组合继续验证。
2.挑选出的F3组合和F2组合继续实验，共6种引物探针组合，分别命名为ABCDEF，具体如下表：
实验结果：通过数次实验多样本的比较，C和F(即F2R3组合和F3R3组合)实验效果要好于其它组合，部分实验结果如下图7-图12所示。下次实验挑选出C和F继续验证。
3.继续验证F2R3组合和F3R3组合。
实验结果：通过数次实验多样本的比较，F3R3组合整体实验效果要好于F2R3组合，部分实验结果如下图13-图14所示。所以最后选出的引物探针 组合为：F3R3FP。
HBV DNA病毒载量分别为1.0×108IU/ml～1.0×101IU/ml，梯度稀释的8个浓度，用自行设计的PgRNA特异性探针进行扩增。因为HBV DNA和PgRNA扩增的序列相同，因此用此引物探针组合同样可以扩增HBV DNA。具体实验结果如图15所示，1.0×108IU/ml～1.0×103IU/ml浓度样本结果均匀分布，1.0×102IU/ml～1.0×101IU/ml的样本未扩出。
实施例3
HBV pgRNA提取液DNA扩增验证
应用实施例2中筛选出的引物、探针PCR扩增HBV pgRNA，应用软件SPSS 21.0统计软件分析结果，会得到如图16所示的图像。出现HBV DNA扩增曲线。病毒RNA提取液中会出现残留DNA的现象，残留少量的HBV DNA会对后续的RNA逆转录扩增造成影响，因此必须去除。
实施例4
使用RNase-free Dnase I消除HBV DNA的验证：
应用如实施例1中的使用RNase-free Dnase I对获得的HBV pgRNA处理后，对HBVpgRNA进行PCR扩增，应用软件SPSS 21.0统计软件分析结果，会得到如图17所示的图像，未出现HBV DNA扩增曲线。因此该方法可以有效地纯化HBV pgRNA，消除残留的HBV DNA会对后续的RNA逆转录扩增造成影响。
对两例纯净pgRNA样本按照实施例1的方法监测分析，其病毒载量分别为1.9×105IU/ml和3.8×107IU/ml，PCR结果图18所示。靠前的是载量为1.9×105IU/ml的样本，靠后的为3.8×107IU/ml的样本。从图中可以看出，HBV DNA载量较高的样本PgRNA定量反而较低。
实施例5
PgRNA试剂盒组成如下表所示：
序号 产品组成 主要成分 规格及装量
1 蛋白酶K 蛋白酶K 240μl×1管
2 助沉剂 助沉剂 96μl×1管
3 病毒裂解液 异硫氰酸胍 7.2ml×1管
4 磁珠 磁性硅胶颗粒 480μl×1管
5 洗液A 盐溶液 12ml×1管
6 洗液B DEPC Treated Water 12ml×1管
7 洗液C 盐溶液 13.2ml×1管
8 洗脱液 DEPC Treated Water 1200μl×1管
9 引物探针混合液 引物探针混合物 126μl×1管
10 反应液 逆转录酶、Taq酶、dNTP、Mg2+ 630μl×1管
11 样本稀释液 阴性血清 1ml×1管
12 阴性质控品 阴性血清 210μl×1管
13 定量标准品I 包装型病毒5.0×103copies/ml 210μl×1管
14 定量标准品II 包装型病毒5.0×104copies/ml 210μl×1管
15 定量标准品III 包装型病毒5.0×105copies/ml 210μl×1管
16 定量标准品IV 包装型病毒5.0×106copies/ml 210μl×1管
17 内标模板 无生物活性基因片段 200μl×1管
所述引物包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示的碱基序列,；
所述探针包含如SEQ ID NO：7所示的碱基序列。
上述试剂盒的技术指标：
1)最低检出限
在102copies/ml、5×102copies/ml、1×103copies/ml、2×103copies/ml四个滴度处进行十次重复检测，至少在1×103copies/ml处阳性率为100％。
2)精密度
同一批试剂对浓度为1×103copies/ml的样本进行10次重复检测，Ct值的检测结果CV≤5％。
3)线性范围
对浓度大于1×108copies/ml样本进行倍比稀释，分别进行检测，线性范围至少达到1×103～1×108copies/ml。
4)对不同基因型的覆盖
对中国常见的乙型肝炎病毒(B、C、D基因型)的pgRNA均能做到有效检测。
5)特异性
a.分别对含有HCV、HCMV、EBV、甲型肝炎病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、甲型流感病毒等病原体的样本进行检测，检测结果均为阴性；
b.干扰物质：样本中常见干扰物质高浓度的胆红素、甘油三酯、血红蛋白、总IgG对PCR结果无明显干扰；
c.药物影响：常用抗病毒药物高浓度的干扰素和拉米夫定对PCR检测结果无明显干扰。
6)稳定性
试剂盒有效期至少达到12个月。
实施例6
乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒的应用：
1.病例的入组：确诊为慢性乙型肝炎病毒感染者，排除合并感染HCV、HIV患者，肝硬化、肝癌患者，妊娠期妇女及婴幼儿患者。研究对象分组如 下：
(1)a组：未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者，10例；
(2)b组：经抗病毒治疗3个月以上的慢性HBV感染者，10例；
(3)c组：经抗病毒治疗停药3个月内病毒学复发或临床复发的患者，10例；
(4)d组：经抗病毒治疗停药后1年内未复发的患者，10例。
记录所有入组病人的临床资料，包括病人的性别、年龄、血常规、乙肝五项、HbsAg定量、HBV DNA载量、PgRNA定量、肝功能(ALT、AST)、抗病毒治疗方案以及抗病毒治疗持续时间等，使用实施例5提供的试剂盒按照试剂盒操作标准测定标本中的PgRNA。
3.统计数据，分析实验结果，分析各组病例的PgRNA的含量。
与现有技术相比，本发明所述的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：
1)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法为血液检测，无创，常规且可大规模应用，解决HBV cccDNA依赖肝穿的问题。
2)本申请提供的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法、试剂盒超越常规病原体RT-PCR技术，可检测血液中超低载量的PgRNA。
3)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测的试剂盒解决临床上依赖HBV DNA指标，判断抗病毒治疗停药后，出现“停药后复发”的问题，给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志”的问题解决提供了方案。
4)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测的试剂盒及其在预测NA停药的应用可深入研究中国乙肝PgRNA形态，为开发PgRNA药物提供基础研究数据。
由于方法部分已经对本申请实施例进行了详细描述，这里对实施例中涉及的系统与方法对应部分的展开描述省略，不再赘述。对于系统中具体内容的描述可参考方法实施例的内容，这里不再具体限定。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血3-5ml注入无菌收集管，室温放置；
HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的HBVRNA，获得HBV RNA粗品；
HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase-free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，包括如下步骤：
1)建立如下反应体系：
RNase-Free DNase 10X反应缓冲液1ul；
RNase-Free DNase1ul/ug；
RNA无核酸酶的水补足至10ul；
将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取1-8ul加入如下反应体系中；
2)37℃孵育半小时；
3)加入1ul终止液终止反应；
4)65℃孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；
pgRNA的定量检测：使用qRT-PCR定量检测pgRNA，包括：如下步骤：
1)配制qRT-PCR反应体系，
qRT-PCR反应体系：
PCR反应液12.5μL；
引物探针混合液1.5ul；
灭菌蒸馏水6μL；
所述引物的上游引物包含如SEQ ID NO：3所示的碱基序列；
下游引物包含如SEQ ID NO：6所示的碱基序列；
所述探针，包含如SEQ ID NO：7所示的碱基序列；
2)各反应管在漩涡振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离心后按20μL/管分装至PCR仪样品反应管中待用；
3)将HBV pgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取5μL加入相应的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离心机离心10秒，将管壁上的液体全部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽；
4)将振荡均匀的反应管置于qPCR仪中，根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热循环条件，完成qRT-PCR反应；
结果分析及判定：采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。
2.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件：(1)预变性的条件，95℃3min；(2)变性的条件，94℃15sec×40个循环；(3)退火，延伸，荧光采集,60℃35sec×40个循环；(4)仪器冷却，25℃1min。
3.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，其特征在于，所述HBV pgRNA的提取的步骤，包括：
1)在样品反应管中加入10μL蛋白酶K、4μL助沉剂、300μL病毒裂解液，20μL磁珠，充分振荡混匀；
2)加入200μL待处理样本，振荡混匀各离心管，室温颠倒混匀10分钟，使磁珠和核酸充分结合；
3)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁珠吸附完全，溶液澄清后弃去上清液，吸附在离心管盖上的磁珠可通过反复颠倒磁力架冲洗下来；
4)加入500μL洗液A,漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离后去上清；
5)加入500μL洗液B,漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离后去上清；
6)将离心管放置在磁力架上，缓慢加入550μL洗液C，静置1分钟磁分离后弃去上清液，取下离心管；
7)加入50μL洗脱液，用移液器缓慢吹打混匀，55℃温育5分钟，期间轻轻晃动溶液两次；
8)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁分离后将上清液转移至新的灭菌离心管中，获得HBV pgRNA粗品。
4.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，其特征在于，所述引物的扩增产物序列如SEQ ID NO：8所示。
5.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，其特征在于，所述样本处理的步骤，包括：
血清样本采集：抽取静脉血3-5mL，注入无菌收集管，待样本自行析出血清或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清；
血浆样本采集：抽取静脉血3-5mL，注入含有EDTA的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，待样本自行析出血浆或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血浆。
6.检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要求1所述的引物和探针。
7.根据权利要求6所述的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒，还包括：阴性质控品、定量标准品I、定量标准品II、定量标准品III、定量标准品IV。
8.根据权利要求6或7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：蛋白酶K、助沉剂、病毒裂解液、磁珠、洗液A、洗液B、洗液C、洗脱液、引物探针混合液、反应液、样本稀释液、阴性质控品、定量标准品I、定量标准品II、定量标准品III、定量标准品IV、内标模板，各组份含量为：
9.权利要求6所述检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒应用于乙肝患者血液中HBV PgRNA的检测。
10.根据权利要求9所述的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒，其特征在于，所述检测包括HBV PgRNA定性检测和/或定量检测。
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