CN106555013A

CN106555013A - Hbv病毒的检测方法、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN106555013A
Application number: CN201611064389.1A
Authority: CN
Inventors: 叶锋; 刘明坤; 陈广磊
Original assignee: Beijing Jingzhun Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jingzhun Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2017-04-05

Abstract

本申请公开了HBV病毒的检测方法,包括如下步骤：从血清中分离得到核酸提取液，获取待测样本；采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针PgRNA‑FP 5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号；对结果分析。本发明的优点是根据HBV PgRNA多聚A进行特异性反转录，然后根据HBV PgRNA特异性引物和探针进行扩增，有效排除了HBV DNA带来的可能干扰，有效提高了检测HBV PgRNA特异性。

Description

HBV病毒的检测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种细菌的检测方法、试剂盒及其应用，具体讲，涉及一种HBV病毒的检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

HBV病毒属于双链DNA病毒，乙肝患者血液中既存在HBV DNA，又存在HBV RNA，HBVDNA的长度为3.2kb，HBV RNA中包含有4种mRNA，分别长3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb，其中，PgRNA长度为3.5kb,其序列和HBV DNA高度同源重叠，对于PCR特异性选择扩增有很大难度，要检测血液中(血清或血浆)PgRNA含量，目前常规方法为将提取后的乙型肝炎患者血清提取后的核酸进行DNaseI酶消化，将HBV DNA消化后，剩余的HBV PgRNA进行PCR扩增以其得到HBV PgRNA定量检测结果。但对于高浓度的HBV DNA消化需要多次反复验证DNaseI的用量，因此很难一次性针对所有浓度的HBV DNA进行一次性消化完全，导致剩余的HBV DNA含量干扰HBV PgRNA浓度，得到的结果不准确，如能够有针对性、选择性只扩增HBV PgRNA模板，就能够达到消除HBV DNA对于HBV PgRNA带来的影响。

现有技术通常采用HBV DNA和RNA共提取试剂盒，然后通过DNaseI酶对提取后的核酸进行消化去除HBV DNA而剩余RNA，但现实中HBV DNA浓度高低差异很大，很难筛选出一个特定浓度针对所有浓度的HBV DNA消除，因此针对高载量HBV DNA很难一次性清除干净，需要反复多次重复消除HBV DNA针对HBV PgRNA的影响，这样的操作在临床操作费时、费力，很容易造成污染和反复消化造成的定量不准确。

发明内容

本申请解决的主要问题是提供一种HBV病毒的检测方法及试剂盒，以根据HBVpgRNA多聚A进行特异性翻转录，然后根据HBV PgRNA特异性引物和探针进行扩增，有效排除了HBV DNA带来的可能干扰，有效提高了检测HBV PgRNA特异性。

为了解决上述技术问题，本发明公开了HBV病毒的检测方法,包括如下步骤：

待测样本获取：

将血清送检管振荡15s，彻底混匀后立即取200uL至1.5mL离心管中，向离心管内加入300uL裂解液、10μL蛋白酶K、4μL助沉剂和20uL磁珠1，漩涡振荡混匀离心管10秒，于室温轻柔颠倒混匀10min，使磁珠和核酸充分结合。

将离心管放在磁力架上，反复颠倒磁力架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液。

加入500uL洗液1，漩涡振荡3～5s使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，反复颠倒磁力架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液。

加入500uL洗液2，漩涡振荡3～5s使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，反复颠倒磁力架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液，并尽量吸弃管底残余液体，晾干5min。

加入50uL洗脱液，用移液枪缓慢吹打管壁上的磁珠使之浸于洗脱液中，55℃温育5min，期间轻轻晃动溶液两次使核酸充分洗脱。

将离心管置于磁力架上静置1min，磁分离后及时将上清液转移至新的无核酸酶离心管中，得到核酸提取液。

结果检测：

采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针PGRNA-FP 5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号；对结果分析。

与现有技术相比，本发明所述的HBV病毒的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：

1.本发明中所涉及的试剂盒中设置临界阳性质控品、阳性质控品、定量标准品均为灭活菌株或灭活标本，参与核酸提取及扩增，全面真实反映核酸提取和扩增。

2.本发明使用尿苷酶(UDG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR扩增产物的污染。

3.本发明采用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。

4.本发明的检测方法、试剂盒敏感性高，最低检出可达到1000copies/mL；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的细菌发生交叉反应，例如大肠杆菌、肠炎沙门菌、乙型肝炎病毒、人类疱疹病毒4型、人巨细胞病毒等。

5.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到PCR反应结果，并且成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展。从而实现对HBV病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明所述HBV病毒定性检测结果图；

图2是本发明所述HBV病毒定量检测标准品检测结果图；

图3是本发明所述HBV病毒定量检测标准品和待测样品检测结果图；

图4是本发明所述HBV PgRNA特异性引物F1序列示意图；

图5是本发明所述HBV pgRNA特异性探针RT-FP序列示意图；

图6是本发明所述HBV PgRNA B型灵敏度检测结果图；

图7是本发明所述HBV PgRNA C型灵敏度检测结果图；

图8是本发明所述HBV PgRNA标本精密度检测结果图；

图9是本发明所述方法与DNaseI方法学比较分析结果图；

图10是本发明所述临床标本检测结果图。

图11是本发明所述HBV PgRNA特异性检测示意图。

具体实施方式

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

以下结合附图对本申请作进一步详细说明，但不作为对本申请的限定。下文为了叙述方便，下文中所称的“左”“右”“上”“下”等与附图本身左、右、上、下等方向一致。

本实施例提供待测样本获取的方法，待测样本核酸提取可以采用商品化的离心柱提取法、商品化的磁珠提取法或商品化的煮沸裂解法。

本发明提供采用离心柱法从血清标本中获取HBV病毒DNA，获得待测样本的方法。具体方法如下：

待测样本获取：

结果检测：

实施例2

HBV病毒的定性检测

本实施例2提供一种HBV病毒的定性检测方法：

1、HBV病毒的PCR扩增反应

1)HBV病毒DNA的PCR扩增反应所用试剂及成分

(1)HBV病毒引物探针混合液：

针对HBV PgRNA设计了特异性引物序列F1和HBV PgRNA特异性探针RT-FP，F1和RT-FP经过和NCBI比对，特别是选择了6个B型、7个C型和7个D型进行Blast比对结果如1a和1b所示，结果显示比对结果吻合度100％，引物设计特异性高。

针对RT-R1(R2)引物，引物的3’端为13个多聚T，同时为了保证特异性引入VN兼并碱基序列(其中V代表碱基A C G 3种碱基,而N代表碱基A C T G四种碱基)，在5’端引入了一段非人和病毒类序列5’-ATTCGATATCGCATGATGACTG-3’,此片段的引物是为了反转录后形成的cDNA能够特异性选择PgRNA序列，而非扩增HBV DNA序列。

HBV病毒引物探针混合液具体组成成分为上游引物RT-F(50μM)0.6μL，下游引物RT-R(50μM)0.6μL，Taqman荧光探针RT-FP(20μM)0.5μL，纯化水3.3μL。

优选HBV病毒引物探针混合液的组分为：上游引物RT-F(50μM)0.6μL，下游引物RT-R(50μM)0.6μL，Taqman荧光探针RT-FP(20μM)0.5μL，内标上游引物(20μM)0.5μL，内标下游引物(20μM)0.5μL，内标探针(10μM)0.375μL，纯化水1.925μL。

所述上游引物RT-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；

所述下游引物RT-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；

所述Taqman荧光探针RT-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列,所述Taqman荧光探针RT-FP 5’端有荧光报告基团，3’端有荧光淬灭基团。

所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种；

优选的，当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5.5中的一种。

最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

(2)PCR反应液：

PCR反应液组成为：10×reaction buffer 5μL，10mM dNTP Mix 4μL，Taq DNAPolymerase 1.2μL，UDG酶0.2μL，10mM dUTP 1μL，纯化水13.6μL。

2)HBV病毒DNA(待测样本)PCR反应

(1)按以下比例进行PCR反应混合液配制与加样：PCR反应液25μL，HBV病毒引物探针混合液5μL加到PCR管中，振荡混匀，将提取好的待测样本20μL加到上述PCR管中，进行PCR扩增。

(2)PCR反应的反应条件设置为：37℃2min；95℃3min；94℃15s，60℃35s，10个循环；94℃15s，60℃35s荧光(荧光收集)，35个循环；25℃1min。

表1扩增所需要的引物和探针序列

引物名称	引物序列(5’-3’)	备注
			F1	CCTAATCATCTCWTGTTCATGTCCTA
RT-FP	TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCT	5’FAM修饰3’BHQ1修饰
			RT-R1(R2)	ATTCGATATCGCATGATGACTGTTTTTTTTTTTTTVN
R2	ATTCGATATCGCATGATGACTG

如图11所示，HBV PgRNA特异性检测步骤如下：

第一步：采用RT-F1(携带F2引物序列)引物针对提取后的核酸进行反转录。

第二步：反转录后形成带有引物R2序列的cDNA。

第三步：采用HBV PgRNA特异性引物F1和RT-FP探针和引物的F2引物进行PCR扩增检测。

2、PCR反应结果判读(HBV病毒的定性检测结果分析)

本实施例2采用最优方案，即HBV病毒引物探针混合液含内标，所述Taqman荧光探针RT-FP的荧光报告基团为6-FAM；荧光淬灭基团为BHQ1。

本实施例2采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为对应荧光素，本实施例设定为FAM、VIC荧光素，荧光信号收集设在60℃。

HBV病毒引物探针混合液有无内标，不影响待检样品通道曲线的响应，即HBV病毒检出为阳性时，待检样品对应通道会出现S型曲线；HBV病毒检出为阴性时，待检样品对应通道不出现S型曲线。

本实施2采用HBV病毒引物探针混合液含内标，所述Taqman荧光探针RT-FP的荧光报告基团为6-FAM；荧光淬灭基团为BHQ1的方案，因此检测结果会包含内标通道曲线：

如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无S型曲线，判定为PGRNA阴性；如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线，判定为PGRNA阳性。利用上述方法对12例HBV病毒血清样本、5例健康人血清样本，2例大肠杆菌血清样本、2例肠炎沙门菌血清样本、2例乙型肝炎病毒血清样本、2例人类疱疹病毒4型血清样本、2例人巨细胞病毒血清样本，标本来源XXX医院共计27份样本进行检测，结果如图1所示：

其中，12例HBV病毒血清样本检测均为阳性，内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线；健康人血清样本，大肠杆菌血清样本、肠炎沙门菌血清样本、乙型肝炎病毒血清样本、人类疱疹病毒4型血清样本、人巨细胞病毒血清样本，检测均为阴性，内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无S型曲线。

HBV PgRNA试剂评价和操作流程：

灵敏度分析：选择HBV PgRNA B型和C型标本各1例(浓度为5X105次方),分别进行线性稀释至5X104 5X103 5X102进行灵敏度检测；

精密度分析：选择HBV PgRNA B型和C型标本各1例(浓度为5X103次方),分别进行8次重复检测；

和DNaseI方法学比较分析：选择3例HBV PgRNA标本浓度分别为()，分别进行此方法和DNaseI的方法学比较分析；

临床标本分析：选择15例临床HBV血清DNA呈现阳性标本进行扩增检测。

本实施例2采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。

按下表的逆转录体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于冰上。

表2引物逆转录反应

b:将上一步得到的核酸提取液加入到混合液中，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5sec，简短离心以收集管壁残留的液体。

c:37℃孵育60min。

d:将逆转录所得的cDNA进行后续实验操作。

2.2.5cDNA浓缩与纯化

a将逆转录所得的cDNA转移至1.5mL离心管中，向离心管中加入40ul已于室温平衡30min的磁珠2，涡旋振荡混匀，简短离心，室温放置5min。

b将离心管置于磁力架上静置3min，弃上清。

c加入250ul洗液3，静置30s，转动离心管使磁珠移动进行清洗，重复转动两次，弃上清。

d重复上一步骤。

e移除残余的洗液3，室温干燥至少5min。

f加入20ul洗脱液，涡旋振荡10s。

g磁力架上静置1min，上清转移至新的离心管中，得到纯化的cDNA。

qPCR定量

a按照如下体系进行qPCR反应体系的配置。

表3单引物逆转录扩增体系

b qPCR反应条件如下：

a：灵敏度分析：

分别对HBV PgRNA B型和C型标本进行稀释后，结果显示该试剂针对B型和C型的灵敏度为500copies/mL。

b：精密度分析：

选取1例HBV PgRNA标本，将此标本用阴性血清稀释至500copies/mL，分别进行10次检测，结果显示精密度重复良好(变异系数CV＝1.6％,<5％)。

c：和DNaseI方法学比较分析：

选取3例HBV DNA阳性标本P1、P2和P3，分别经过DNaseI和此方法进行检测后，3例标本对应的结果基本一致，可以确定此方法针对HBV PgRNA具有选择性，HBV DNA干扰可以忽略。

d：临床标本的分析：

选取了HBV DNA15例临床阳性标本(P1-P15)，结果显示曲线扩增良好，结果分析容易。

本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到PCR反应结果，并且成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展。从而实现对HBV病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。

由于方法部分已经对本申请实施例进行了详细描述，这里对实施例中涉及的系统与方法对应部分的展开描述省略，不再赘述。对于系统中具体内容的描述可参考方法实施例的内容，这里不再具体限定。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京旌准医疗科技有限公司

<120> HBV病毒的检测方法、试剂盒及其应用

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aat gcc cct atc tta tca aca ctt c 25

Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu

1 5

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tta tca aca ctt ccg gaa act act g 25

Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr

1 5

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctt ccg gaa act act gtt gtt aga c 25

Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg

1 5

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgg gat tcc cga gat tga g 19

Trp Asp Ser Arg Asp *** Xaa

1 5

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcc cac ctt atg agt cca agg 21

Ser His Leu Met Ser Pro Arg

1 5

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gta aag ttt ccc acc tta tga gtc c 25

Val Lys Phe Pro Thr Leu *** Val

1 5

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agg cag gtc ccc tag aag aag aac tcc 27

Arg Gln Val Pro *** Lys Lys Asn Ser

1 5

<210> 8

<211> 3215

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctc cac aac att cca cca agc tct gct aga tcc cag agt gag ggg cct ata ttttcc tgc 60

Leu His Asn Ile Pro Pro Ser Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Gly Pro Ile Phe Ser Cys

5 10 15 20

tgg tgg ctc cag ttc cgg aac agt aaa ccc tgt tcc gac tac tgc ctc acc catatc gtc 120

Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Thr His Ile Val

25 30 35 40

aat ctt ctc gag gac tgg gga ccc tgc acc gaa cat gga gag cac aac atc aggatt cct 180

Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His Asn Ile Arg Ile Pro

45 50 55 60

agg acc cct gct cgt gtt aca ggc ggg gtt ttt ctt gtt gac aag aat cct cacaat acc 240

Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr

65 70 75 80

aca gag tct aga ctc gtg gtg gac ttc tct caa ttt tct agg ggg agc acc cacgtg tcc 300

Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Ser Thr His Val Ser

85 90 95 100

tgg cca aaa ttc gca gtc ccc aac ctc caa tca ctc acc aac ctc ttg tcc tccaat ttg 360

Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu

105 110 115 120

tcc tgg cta tcg ctg gat gtg tct gcg gcg ttt tat cat att cct ctt cat cctgct gct 420

Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala

125 130 135 140

atg cct cat ctt ctt gtt ggt tct tct gga cta cca agg tat gtt gcc cgt ttgtcc tct 480

Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Pro Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser

145 150 155 160

act tcc agg aac atc aac tac cag cac ggg acc atg caa gac ctg cac gat tcctgc tca 540

Thr Ser Arg Asn Ile Asn Tyr Gln His Gly Thr Met Gln Asp Leu His Asp Ser Cys Ser

165 170 175 180

agg aac ctc tat gtt tcc ctc ttg ttg ctg tac aaa acc ttc gga cgg aaa ctgcac ttg 600

Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu

185 190 195 200

tat tcc cat ccc atc atc ctg ggc ttt cgc aag att cct atg gga gtg ggc cttagt ccg 660

Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro

205 210 215 220

ttt ctc ctg gct cag ttt act agt gcc att tgt tca gtg gtt cgc agg gct ttcccc cac 720

Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His

225 230 235 240

tgt ttg gct ttc agt tat atg gat gat gtg gta ttg ggg gcc aag tct gta caacat ctt 780

Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu

245 250 255 260

gag tcc ctt ttt acc tct att acc aat ttt ctt ttg tcg ttg ggt ata cat ttgaac cct 840

Glu Ser Leu Phe Thr Ser Ile Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro

265 270 275 280

aat aaa acc aaa cgt tgg ggc tac tcc ctt aac ttc atg gga tat gta att ggaagt tgg 900

Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp

285 290 295 300

ggg act tta cca cag gaa cat att gta tta aaa atc aag caa tgt ttt cgg aaactg cct 960

Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Leu Lys Ile Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro

305 310 315 320

gta aat aga cct att gat tgg aaa gta tgt caa aga att gtg ggt ctt ttg ggcttt gct 1020

Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala

325 330 335 340

gcc cct ttt aca caa tgt ggc tat cct gcc ttg atg cct tta tat gca tgt atacaa tct 1080

Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser

345 350 355 360

aag cag gct ttc act ttc tcg cca act tac aag gcc ttt ctg tgt caa caa tacctg cac 1140

Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Gln Gln Tyr Leu His

365 370 375 380

ctt tac ccc gtt gcc cgg caa cgg tca ggt ctc tgc caa gtg ttt gct gac gcaacc ccc 1200

Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Ser Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro

385 390 395 400

act gga tgg ggc ttg gcc ata ggc cat cgg cgc atg cgt gga acc ttt gtg gctcct ctg 1260

Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Arg Arg Met Arg Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu

405 410 415 420

ccg atc cat act gcg gaa ctc cta gca gct tgt ttt gct cgc agc cgg tct ggagca aaa 1320

Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys

425 430 435 440

ctt atc ggg act gac aac tct gtt gtc ctc tct cgg aaa tac acc tcc ttc ccatgg ctg 1380

Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu

445 450 455 460

ctc ggg tgt gct gcc aac tgg atc ctg cgc ggg acg tcc ttt gtc tac gtc ccgtcg gcg 1440

Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala

465 470 475 480

ctg aat ccc gcg gac gac ccg tct cgg ggc cgt ttg ggc ctc tac cgt ccc cttctt cat 1500

Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Tyr Arg Pro Leu Leu His

485 490 495 500

ctg ctg ttc cag ccg act acg ggg cgc acc tct ctt tac gcg gtc tcc ccg tctgtg cct 1560

Leu Leu Phe Gln Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Val Ser Pro Ser Val Pro

505 510 515 520

tct cat ctg ccg gac cgt gtg cac ttc gct tca cct ctg cac gtc gca tgg agacca ccg 1620

Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro

525 530 535 540

tga atg ccc acc agg tct tgc cca agc tct tac ata aga gga ctc ttg gac tctcag caa 1680

*** Met Pro Thr Arg Ser Cys Pro Ser Ser Tyr Ile Arg Gly Leu Leu Asp Ser Gln Gln

545 550 555 560

tgt caa cga ccg acc ttg aag cat act tca aag act gtt tgt tta agg act gggagg agt 1740

Cys Gln Arg Pro Thr Leu Lys His Thr Ser Lys Thr Val Cys Leu Arg Thr Gly Arg Ser

565 570 575 580

tgg ggg agg aga tta ggt taa agg tct ttg tac tag gag gct gta ggc ata aattgg tct 1800

Trp Gly Arg Arg Leu Gly *** Arg Ser Leu Tyr *** Glu Ala Val Gly Ile Asn Trp Ser

585 590 595 600

gtt cac cag cac cat gca act ttt tca cct ctg cct aat cat ctc atg ttc atgtcc tac 1860

Val His Gln His His Ala Thr Phe Ser Pro Leu Pro Asn His Leu Met Phe Met Ser Tyr

605 610 615 620

tgt tca agc ctc caa gct gtg cct tgg gtg gct ttg ggg cat gga cat tga cccgta taa 1920

Cys Ser Ser Leu Gln Ala Val Pro Trp Val Ala Leu Gly His Gly His *** Pro Val ***

625 630 635 640

aga att tgg agc ttc tgt gga gtt act ctc ttt ttt gcc ttc tga ctt ctt tccttc tat 1980

Arg Ile Trp Ser Phe Cys Gly Val Thr Leu Phe Phe Ala Phe *** Leu Leu Ser Phe Tyr

645 650 655 660

tcg aga tct cct cga cac cgc ctc tgc tct gta tcg gga ggc ctt aga gtc tccgga aca 2040

Ser Arg Ser Pro Arg His Arg Leu Cys Ser Val Ser Gly Gly Leu Arg Val Ser Gly Thr

665 670 675 680

ttg ttc acc tca cca tac agc act cag gca agc tat tct ctg ttg ggg tga gttgat gaa 2100

Leu Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Thr Gln Ala Ser Tyr Ser Leu Leu Gly *** Val Asp Glu

685 690 695 700

tct ggc cac ctg ggt ggg aag taa ttt gga aga ccc agc atc cag gga att agtagt cag 2160

Ser Gly His Leu Gly Gly Lys *** Phe Gly Arg Pro Ser Ile Gln Gly Ile Ser Ser Gln

705 710 715 720

cta tgt caa tgt taa tat ggg cct aaa aat cag aca act att gtg gtt tca catttc ctg 2220

Leu Cys Gln Cys *** Tyr Gly Pro Lys Asn Gln Thr Thr Ile Val Val Ser His Phe Leu

725 730 735 740

tct tac ttt tgg aag aga aac tgt tct tga gta ttt ggt gtc ttt tgg agt gtggat tcg 2280

Ser Tyr Phe Trp Lys Arg Asn Cys Ser *** Val Phe Gly Val Phe Trp Ser Val Asp Ser

745 750 755 760

cac tcc tcc agc tta cag acc acc aaa tgc ccc tat ctt atc aac act tcc ggaaac tac 2340

His Ser Ser Ser Leu Gln Thr Thr Lys Cys Pro Tyr Leu Ile Asn Thr Ser Gly Asn Tyr

765 770 775 780

tgt tgt tag acg acg agg cag gtc ccc tag aag aag aac tcc ctc gcc tcg cagacg aag 2400

Cys Cys *** Thr Thr Arg Gln Val Pro *** Lys Lys Asn Ser Leu Ala Ser Gln Thr Lys

785 790 795 800

gtc tca atc gcc gcg tcg cag aag atc tca atc tcg gga atc tca atg tta gtatcc ctt 2460

Val Ser Ile Ala Ala Ser Gln Lys Ile Ser Ile Ser Gly Ile Ser Met Leu Val Ser Leu

805 810 815 820

gga ctc ata agg tgg gaa act tta ctg ggc ttt att ctt cta ctg ttc ctg tcttta atc 2520

Gly Leu Ile Arg Trp Glu Thr Leu Leu Gly Phe Ile Leu Leu Leu Phe Leu Ser Leu Ile

825 830 835 840

ctg agt ggc aaa ctc cct cct ttc cta aca ttc att tac agg aag aca tta ttaata gat 2580

Leu Ser Gly Lys Leu Pro Pro Phe Leu Thr Phe Ile Tyr Arg Lys Thr Leu Leu Ile Asp

845 850 855 860

gtc aac aat atg tgg gcc ctc tta cag tta atg aaa aaa gga gat taa aat taatta tgc 2640

Val Asn Asn Met Trp Ala Leu Leu Gln Leu Met Lys Lys Gly Asp *** Asn *** Leu Cys

865 870 875 880

ctg cta ggt tct atc cta acc tta cca aat att tgc cct tgg ata aag gca ttaaac ctt 2700

Leu Leu Gly Ser Ile Leu Thr Leu Pro Asn Ile Cys Pro Trp Ile Lys Ala Leu Asn Leu

885 890 895 900

att atc ctg aac atg cag tta atc att act tca aaa cta ggc att att tac atactc tgt 2760

Ile Ile Leu Asn Met Gln Leu Ile Ile Thr Ser Lys Leu Gly Ile Ile Tyr Ile Leu Cys

905 910 915 920

gga agg ctg gca ttc tat ata aaa gag aaa cta cac gca gcg ctt cat ttt gtgggt cac 2820

Gly Arg Leu Ala Phe Tyr Ile Lys Glu Lys Leu His Ala Ala Leu His Phe Val Gly His

925 930 935 940

cat att ctt ggg aac aag agc tac agc atg gga ggt tgg tct tcc aaa cct cgacaa ggc 2880

His Ile Leu Gly Asn Lys Ser Tyr Ser Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly

945 950 955 960

atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aat cct ctg gga ttc ttt ccc gat cac cagttg gac 2940

Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp

965 970 975 980

cct gcg ttc gga gcc aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc aac aaggat cac 3000

Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His

985 990 995 1000

tgg cca gag gca aat cag gta gga gcg gga gca ttc ggg cca ggg ttc acc ccacca cac 3060

Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His

1005 1010 1015 1020

ggc ggt ctt ttg ggg tgg agc cct cag gct cag ggc ata ttg aca aca gtg ccagca gcg 3120

Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala

1025 1030 1035 1040

cct cct cct gcc tcc acc aat cgg cag tca gga aga cag cct act ccc atc tctcca cct 3180

Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro

1045 1050 1055 1060

cta aga gac agt cat cct cag gcc atg cag tgg aa 3215

Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp

1065 1070

Claims

1.HBV病毒的检测方法,包括如下步骤：

待测样本获取：

结果检测：

采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针PgRNA-FP5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号；对结果分析。

2.根据权利要求1所述的HBV病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：37℃2min；95℃3min；94℃15s，60℃35s，10个循环；94℃15s，60℃35s荧光，35个循环；25℃1min。

3.根据权利要求1所述的HBV病毒的检测方法，其特征在于，所述PgRNA引物探针混合液，还包括：内标上游引物，内标下游引物，内标探针。

4.根据权利要求1所述的HBV病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应，还包括：平行设置Brucella阴性质控品、Brucella临界阳性质控品、Brucella阳性质控品和Brucella定量标准品I～IV反应组，所述Brucella 阴性控品为阴性血清，所述Brucella临界阳性质控品、Brucella阳性质控品的待测模板为灭活菌株或灭活阳性标本，所述Brucella定量标准品I～IV的待测模板为灭活菌株或灭活阳性标本。

5.根据权利要求1所述HBV病毒的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针PgRNA-FP的5’端是为荧光基团，其为FAM,VIC,HEX,TET,ROX，CY3和CY5中的一种，其中探针的3’端为猝灭基团，其为BHQ1，BHQ2，BHQ3，TAMRA，DABCYL中的一种。

6.根据权利要求1所述的HBV病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR反应液，包括UDG酶防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括：UDG酶及dUTP。

7.检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的上游引物RT-F，下游引物RT-R，Taqman荧光探针RT-FP，纯化水；

所述上游引物RT-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；

所述下游引物RT-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；

所述Taqman荧光探针RT-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。

8.根据权利要求7所述的检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针、Brucella阴性质控品、Brucella阳性质控品、Brucella临界阳性质控品和Brucella定量标准品I～IV，所述Brucella阴性质控品为阴性血清，所述Brucella临界阳性质控品、Brucella阳性质控品为灭活菌株或灭活标本，所述Brucella定量标准品I～IV为灭活菌株或灭活阳性标本，所述Brucella定量标准品I～IV，包括Brucella定量标准品I、Brucella定量标准品II、Brucella定量标准品III、Brucella定量标准品IV。

9.根据权利要7或8任一项所述的检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：HBV病毒引物探针混合液、PCR反应液、Brucella定量标准品、Brucella阳性质控品、Brucella临界阳性质控品、Brucella阴性质控品、Brucella内标质控品，各组分含量为：

10.权利要求7-9任一项所述的检测HBV病毒的试剂盒，用于HBV病毒的检测。