CN112941211A - 猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112941211A
CN112941211A CN202110285406.9A CN202110285406A CN112941211A CN 112941211 A CN112941211 A CN 112941211A CN 202110285406 A CN202110285406 A CN 202110285406A CN 112941211 A CN112941211 A CN 112941211A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
streptococcus suis
kit
detection
epf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110285406.9A
Other languages
English (en)
Inventor
余美伦
秦香芹
朱佳伟
耿东涛
赵丽
孟庆雪
宫佳欣
高丹
何佳
李常禄
王磊
王宁
陶振明
白雪峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Hanbang Medical Science And Technology Co ltd
Original Assignee
Harbin Hanbang Medical Science And Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Hanbang Medical Science And Technology Co ltd filed Critical Harbin Hanbang Medical Science And Technology Co ltd
Priority to CN202110285406.9A priority Critical patent/CN112941211A/zh
Publication of CN112941211A publication Critical patent/CN112941211A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，主要包括包括SS‑2引物探针混合液、通用引物混合液、SS‑2PCR反应液、SS‑2引物探针混合液、SS‑2阴性对照、SS‑2阳性对照和SS‑2定量标准品。采用该试剂盒可以实现猪链球菌2型毒力基因的胞外因子epf、溶菌酶释放蛋白mrp和溶血素sly基因的定量检测。试剂盒的检测灵敏度高，最低检测限为1.0×103copies/mL；定量线性范围广，可对1.0×103copies/mL～1.0×1010copies/mL的猪链球菌2型的3种毒力基因准确定量；特异性强，与其他细菌和猪常见病毒无反应；重复性好，批内和批间变异系数均小于5％；稳定性强，反复冻融8次后1.0×103copies/mL的最低检测限参考品100％检出，非常适用于猪病常规疫情监测和猪血来源的生物制品对猪链球菌的检测需求。

Description

猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
猪链球菌是猪的常见病原体，猪链球菌病是多种链球菌引起猪的一类疾病的总称，根据菌体表面荚膜多糖的差异，将其分为35个血清型(1-34型及1/2型)，其中以2型分布最普遍，致病力也最强，1型、7型以及9型则次之。其中由猪链球菌2型引起的疾病是一种重要的人畜共患病，该病原可使猪产生脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎、败血症等多种病症甚至可引起急性死亡，同时还可感染人并致人死亡。
猪链球菌的致病力与毒力因子密切相关，目前已知的猪链球菌毒力基因主要有溶血素(sly)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)和荚膜多糖(cps)等。sly在猪链球菌粘附和裂解Hep-2细胞过程中发挥了重要作用，产生溶血素的猪链球菌活菌及培养上清和纯化的溶血素均能导致人脑微血管内皮单层细胞产生病变，说明猪链球菌溶血素是一种重要的毒力基因。mrp和epf猪链球菌2型毒力强弱的重要指标，研究认为根据mrp和epf的有无，猪链球菌2型存在3种表型：MRP+EPF+、MRP+EPF-和MRP-EPF-，人工感染小鼠和猪的试验结果表明MRP+EPF+可致猪产生典型脑炎、多发性关节炎和多发性浆液炎等症状，MRP+EPF-菌株引起的疾病较为温和，MRP-EPF-菌株则无致病性。猪血浆生物制品越来越多的被应用于疾病的治疗和康复中，对猪血清中猪链球菌2型epf、mrp和sly 3种毒力基因的检测为生物制品的生物安全性和使用安全性提供了重要的保障。
目前关于猪链球菌2型毒力基因的检测所公布的方法有基于琼脂糖凝胶电泳法，如专利申请号：CN200710067487.5和CN201010119005.8所公布的琼脂糖凝胶电泳检测均采用多重PCR后琼脂糖凝胶电泳检测的方法，检测灵敏度相对较低，可能导致假阴性漏检，但是由于实验操作过程比较多存在的气溶胶污染所导致的假阳性，不能对病毒含量定量检测。又如专利申请号：CN200610109571.4、CN200610109569.7均采用单重荧光PCR的方法分别对猪链球菌2型mrp和epf基因进行检测，不能定量病毒含量，操作费时。再如专利申请号CN201610255090.8公布了一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物和试剂盒，仅针对猪链球菌2型检测，无法检测是否含有或者含有何种毒力基因，不能为猪链球菌流行病学研究提供帮助，更无法进行定量检测。
实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强的优点，广泛的应用于病原微生物或病毒的检测中。多重实时荧光定量PCR是采用多对引物探针进行定量PCR检测的方法，多重实时荧光定量PCR由于体系中含有多对引物探针，因此即便经过反应体系的优化，其对不同拷贝数/浓度的模板核酸依然存在一定的PCR扩增偏好性，表现为高浓度的核酸模板优先扩增，低浓度的核酸模板扩增受到抑制。因此，迫切需要建立一种能够同时对猪链球菌2型主要毒力基因进行多重、定量、灵敏度高的实时荧光定量PCR检测方法。
发明内容
针对背景技术中提出的问题，本申请提出一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及其检测方法。
下述SS-2即为猪链球菌2型的简称，为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
本发明公开了一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及检测方法。其中，引物探针序列如下段中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11所示。本发明公开的一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括SS-2PCR反应液、SS-2引物探针混合液、SS-2阴性对照、SS-2阳性对照和SS-2定量标准品。采用该试剂盒可以实现猪链球菌2型毒力基因的胞外因子epf、溶菌酶释放蛋白mrp和溶血素sly基因的定量检测。试剂盒的检测灵敏度高，最低检测限为1.0×103copies/mL；定量线性范围广，可对1.0×103copies/mL～1.0×1010copies/mL的猪链球菌2型的3种毒力基因准确定量；特异性强，与其他细菌和猪常见病毒无反应；重复性好，批内和批间变异系数均小于5％；稳定性强，反复冻融8次后1.0×103copies/mL的最低检测限参考品100％检出，非常适用于猪病常规疫情监测和猪血来源的生物制品对猪链球菌的检测需求。
具体的，本发明的试剂盒的SS-2引物探针混合液包括epf、mrp和sly 3中毒力基因引物和探针以及1对通用引物混合液。其中，本发明3种毒力基因的多重实时荧光定量PCR引物的核苷酸序列如下所示：
引物epf-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGGTCAGCCACTCTCACACAAGATG-3’，(SEQ ID NO：1)，
引物epf-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCCAGTGGCATCCGTCACTTTAAT-3’，(SEQ ID NO：2)，
引物mrp-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGCCAGAAACAGACCGTCCAAA-3’，(SEQ ID NO：3)，
引物mrp-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCCATTTGTTCCTGGTGTCGTTG-3’，(SEQ ID NO：4)，
引物sly-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGATGGACGCTCTATGTTCATCAAG-3’，(SEQ ID NO：5)，
引物sly-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTTGATACTCAGCATTGCCACTAA-3’，(SEQ ID NO：6)；
多重实时荧光定量PCR引物是在3种毒力基因正反链特异性引物的5’端分别添加一段通用引物序列(见下划线序列)，通用引物(核苷酸)序列如下所示：
引物UP-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3’，(SEQ ID NO：7)，
引物UP-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATC-3’，(SEQ ID NO：8)，
本发明的一种检测猪链球菌2型3种毒力基因的多重实时荧光定量PCR探针的核苷酸序列如下所示：
探针epf-P：5’-CCAGCTAGGTCTCCTGCTCCCCAA-3’，(SEQ ID NO：9)，
探针mrp-P：5’-ACCCATTTGACCCAACAGAGCCAG-3’，(SEQ ID NO：10)，
探针sly-P：5’-AGGAGTACCCAAGTTCAAGCCGCA-3’，(SEQ ID NO：11)。
探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中一种；且探针epf、mrp和sly的5’端标记的荧光基团均不相同，即epf、mrp和sly的5’端标记的荧光基团分别为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、TET中其中任意三种，且该三种分别位于探针epf、mrp和sly的5’端。
进一步的，所述的试剂盒还包括SS-2PCR反应Buffer、SS-2酶系、SS-2阴性对照、SS-2阳性对照和SS-2定量标准品。
其中，所述的SS-2定量标准品为含有不同拷贝数的epf、mrp和sly的3种基因的重组质粒；所述的SS-2阳性对照为含有特定拷贝数(即确定拷贝数)范围的epf、mrp和sly的3种基因的重组质粒。
所述的SS-2酶系为热启动Taq DNA聚合酶和dNTPs的混合液。
一种检测血液样本中猪链球菌2型的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取血清样本病毒核酸；
(2)配制SS-2定量PCR检测体系，其中，所述检测体系中包含所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒的引物和探针；
(3)定量PCR反应；
(4)结果判定。
本发明提供能同时检测和鉴别猪链球菌2型epf、mrp和sly 3种毒力基因的多重实时荧光定量PCR引物探针组。
作为优选的，epf、mrp和sly 3种毒力基因探针序列的5’端分别标记FAM、VIC、ROX荧光素，探针序列3’端分别标记BHQ1、BHQ1和BHQ2淬灭基团。基于上述引物探针组，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、重复性好的多重实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述引物探针组，所述的引物探针组定量PCR体系的终浓度分别为：epf引物浓度50nmol/Lol/L，探针浓度100nmol/Lol/L；mrp引物浓度50nmol/Lol/L，探针浓度160nmol/Lol/L；sly引物浓度50nmol/Lol/L，探针浓度80nmol/Lol/L，通用引物浓度400nmol/Lol/L。较低的epf、mrp和sly引物浓度先富集核酸模板，随后较高的通用引物进行定量PCR扩增检测，降低了PCR的扩增偏好性，增强了不同拷贝数模板扩增效率的一致性。试剂盒还包括有SS-2PCR反应Buffer、SS-2酶系、SS-2阴性对照、SS-2阳性对照和SS-2定量标准品。
SS-2定量PCR反应Buffer为商业化的PCR反应Buffer，该Buffer中为HEPES缓冲液，在PCR反应中的终浓度HEPES为20mmol/L，(NH4)2SO4的反应终浓度为10mmol/L，KCl的反应终浓度为50mmol/L，蔗糖的终浓度为25mmol/L，Mg2+的终浓度为2.5mmol/L。HEPES缓冲体系和适宜的Mg2+浓度能够增加检测的特异性，添加非还原糖蔗糖能够增加PCR反应Buffer在环境温度下的存储稳定性。
SS-2酶系由热启动Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL和25mM dNTPs 0.2μL组成，每份0.5μL，即25μL PCR反应体系中热启动Taq DNA聚合酶的含量为1.5U，dNTPs的终浓度为200μM。所述的热启动Taq DNA聚合酶(货号：MD026)、dNTPs(货号：MD016)均购自购自菲鹏生物股份有限公司。该酶系将dNTPs添加至热启动Taq DNA聚合酶中，由于酶系中含有的甘油成分不会反复冻融，确保了dNTPs在酶系中亦不会反复冻融，从而保证检测结果的准确性。
SS-2阴性对照为超纯水，由超纯水仪制备，电阻率大于18.0MΩ.CM。
SS-2定量标准品为人工合成的含有epf、mrp和sly的3种目的基因片段的重组质粒经浓度测定，定值后采用EB缓冲液(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：RK120-02)稀释至拷贝数分别为1.0×1010、1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103copies/mL后-20℃±5℃存储。该定量标准品不仅浓度范围广，由于采用了特定的缓冲液进行稀释，低温存储稳定性强，不会降解，进而保证了定量结果的精确性。
本发明还提供了上述猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)的使用方法：
(1)核酸提取
分离猪血血清，采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP315)按照试剂盒说明书操作进行血清病毒核酸提取，提取的病毒核酸如不能立即用于检测，存储于-20℃±5℃。
(2)试剂的配置
按照猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒的使用说明书配置定量25μL定量PCR检测体系，具体为将试剂盒室温溶解后，将试剂盒中各组分涡旋混匀，按照：SS-2PCR反应Buffer 17.5μL、SS-2酶系0.5μL、SS-2引物探针混合液2μL混合后进行分装，每测试分装20μL后添加核酸模板5μL，定量检测需要同步进行定量标准品的检测。
(3)PCR检测
按照如下PCR反应程序进行定量PCR检测：ABI7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为：95℃5分钟，然后经过95℃15秒，58℃45秒钟，5个循环；95℃15秒，60℃45秒钟(荧光收集)，40个循环。
(4)结果分析
质控标准：阴性对照检测结果在FAM、VIC、ROX通道均为阴性，阳性对照检测结果在FAM、VIC、ROX通道均为阳性，且扩增曲线呈明显“S”型曲线；
结果判读：在质控合格的前提下进行结果分析，定性分析可直接根据检测Ct值进行阴性或者阳性判定，在FAM、VIC和ROX任一通道为阳性检测结果均为阳性；定量分析结合标准曲线进行定量分析。
上述方案，本发明的有益效果：
(1)多重检测：特定的引物设计和优化的引物探针浓度结合相应的PCR扩增程序，实现不同基因、不同模板拷贝数扩增效率的一致性；进而实现对猪链球菌2型3种常见毒力基因epf、mrp和sly的定量PCR检测，检测有助于对猪血来源的生物制品进行质量监控，使得猪血来源的生物制品的生物安全性得到保障；
(2)应用广泛：既可以对猪链球菌2型进行定性检测，也可以对猪链球菌2型epf、mrp和sly基因进行定量检测，满足不同的检测需求，应用广泛。
(3)灵敏度高，定量线性范围广：最低检测灵敏度为1.0×103copies/mL，即每个PCR反应可检测浓度低至5个拷贝的毒力基因；可对1.0×103copies/mL～1.0×1010copies/mL浓度范围准确定量，定量范围基本猪链球菌2型感染的细菌含量；
(4)重复性、稳定性好：定量PCR反应试剂采用独立的PCR反应组分，每种组分均经过优化。将dNTPs添加至热启动Taq酶中，避免了dNTPs在PCRBuffer中的反复冻融，确保dNTPs的稳定性；PCR反应Buffer为HEPES缓冲体系，并且含有优化的Mg2+浓度和蔗糖等试剂组分，进一步增加了PCR试剂的稳定性和检测结果的特异性。试剂盒在不同仪器，不同施员，不同检测时间测试结果显示Ct值变异系数＜5％，可反复冻融8次不影响检测结果。
附图说明：
图1是试剂盒FAM通道epf基因定量线性范围显示图；
图2是试剂盒VIC通道mrp基因定量线性范围显示图；
图3是试剂盒ROX通道sly基因定量线性范围显示图；
图4是试剂盒FAM通道epf基因对高、中、低浓度参考品的重复性结果显示图；
图5是试剂盒VIC通道mrp基因对高、中、低浓度参考品的重复性结果显示图；
图6是试剂盒ROX通道sly基因对高、中、低浓度参考品的重复性结果显示图；
图7-1-1、图7-1-2分别为表1-1中epf组合1、epf组合2的结果显示图；
图7-2-1、图7-2-2分别为表1-2中mrp组合1、mrp组合2的结果显示图；
图7-3-1、图7-3-2分别为表1-3中sly组合1、sly组合2的结果显示图。
实施例
下面通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1引物的设计、合成、筛选与验证
选择猪链球菌2型epf、mrp和sly基因的相对保守的区域作为待检靶标，根据引物探针的设计原则，针对每个基因分别各设计了两对引物和探针组合，送于生工生物工程(上海)股份有限公司合成，相应的引物探针信息如下：
Figure BDA0002980244270000091
Figure BDA0002980244270000101
将含有猪链球菌2型epf、mrp和sly3种目的基因片段的质粒DNA作为初始浓度样本(浓度约为3×1011copies/mL)，依次向下10倍稀释8个梯度作模板。用上述3个基因的两组引物探针结合其它PCR反应成份配制相应的PCR反应液，然后对8个梯度模板进行荧光定量PCR检测。选择荧光曲线线型较好，平台期一致以及灵敏度高的引物探针组合作为后续实验的引物探针组。检测结果见表1-1～表1-3和图7-1类～图7-3类。
表1-1不同epf基因引物探针组合Ct值扩增结果
Figure BDA0002980244270000102
见图7-1-1、图7-1-2为不同epf基因引物探针组合扩增图。
由表1-1和图7-1类可知：组合1荧光曲线线型较好，且平台期一致，说明其灵敏度较高。因此，综合考虑在后述的所有实验中，均采用组合1。
表1-2不同mrp基因引物探针组合Ct值扩增结果
Figure BDA0002980244270000111
见图7-2-1、图7-2-2为不同epf基因引物探针组合扩增图。
由表1-2和图7-2类可知：组合1荧光曲线线型较好，且平台期一致，说明其灵敏度较高。因此，综合考虑在后述的所有实验中，均采用组合1。
表1-3不同sly基因引物探针组合Ct值扩增结果
Figure BDA0002980244270000112
见图7-3-1、图7-3-2为不同sly基因引物探针组合扩增图。
由表1-3和图7-3类可知：组合1荧光曲线线型较好，且平台期一致，说明其灵敏度较高。因此，综合考虑在后述的所有实验中，均采用组合1。
实施例2试剂盒的组装
试剂盒规格为100测试/盒，具体成分及规格见下表2-1。
表2-1 SS-2试剂盒信息
Figure BDA0002980244270000113
Figure BDA0002980244270000121
其中SS-2 PCR反应Buffer为购自菲鹏生物的商品化Buffer，在PCR反应中的终浓度HEPES为20mmol/L，(NH4)2SO4的反应终浓度为10mmol/L，KCl的反应终浓度为50mmol/L，蔗糖的终浓度为25mmol/L，Mg2+的终浓度为2.5mmol/L。
SS-2引物探针混合液为含有实施例1所确定的epf、mrp和sly 3个基因的引物探针混合液，25μL定量PCR反应体系中epf、mrp和sly的引物终浓度均为50nmol/L，对应的探针浓度分别为100nmol/L、160nmol/L和80nmol/L，通用引物浓度为400nmol/L。
SS-2酶系为含有热启动Taq DNA聚合酶和dNTPs的混合溶液，25μL定量PCR反应体系中Taq DNA聚合酶的用量为1.5U，dNTPs的终浓度为200μM。
SS-2阴性对照为超纯水，由超纯水仪制备，电阻率大于18.0MΩ.CM。
SS-2定量标准品和SS-2阳性对照由人工合并含有epf、mrp和sly 3个目的基因片段的质粒DNA经EB缓冲液稀释后测定核酸浓度，根据拷贝数就算公式：拷贝数＝N copies/mL＝(6.02×1023)×(Y×10-6)/(D×660)，(N：效价值，Y：质粒浓度ng/mL，D：质粒片段大小bp)，将目的片段分别稀释至相应的拷贝数后分装并于-80℃±5℃存储。其中，SS-2阳性对照的拷贝数范围在105copies/mL～107copies/mL之间。
实施例3试剂盒的使用
试剂配制：将试剂盒自-20℃±5℃冰箱中取出后室温溶解，将试剂盒中各试剂组分涡旋混匀，按照：每个反应SS-2 PCR反应Buffer 17.5μL、SS-2酶系0.5μL、SS-2引物探针混合液2μL混合后涡旋混匀，简短离心后分装于PCR管中，按照20μL/反应进行分装后移至加样区。
加样：分别取5ul样本核酸、不同浓度的标准品、阴性对照和阳性对照分别添加至PCR反应管中，盖紧PCR反应管，涡旋混匀后简短离心。
PCR扩增：在ABI7500荧光定量PCR仪上反应条件为：95℃5分钟，然后经过95℃15秒，58℃45秒钟，5个循环；95℃15秒，60℃45秒钟(荧光收集)，40个循环。
结果分析：
(1)质控标准：阴性对照检测结果在FAM、VIC、ROX通道均为阴性，阳性对照检测结果在FAM、VIC、ROX通道均为阳性，且扩增曲线呈明显“S”型曲线。
(2)结果判读：在质控合格的前提下进行结果分析，定性分析可直接根据检测Ct值进行阴性或者阳性判定，在FAM、VIC和ROX任一通道为阳性检测结果均为阳性；定量分析需要结合定量标准品的标准曲线，将待测样品猪链球菌2型的检测CT值代入标准曲线公式，计算样品中含有的猪链球菌毒力基因的基因拷贝数。
实施例4试剂盒定量线性范围
用阴性猪血清将浓度为1.0×1012copies/mL的质控品稀释至浓度分别为1.0×1010copies/mL、1.0×109copies/mL、1.0×108copies/mL、1.0×107copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×102copies/mL，阴性猪血浆作为阴性对照。采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP315)按照试剂盒说明书操作进行血清病毒核酸提取。提取的核酸采用本发明研制的“猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)”按照使用说明书操作在ABI7500实时荧光定量PCR仪器上进行试剂的配制和定量检测。每个浓度梯度设置3次重复，通过分析实验结果确定试剂盒的检测线性范围，要求线性范围内其理论浓度log值与测定浓度log值的线性相关系数|r|≥0.98。检测结果见表4-1～表4-3。
表4-1 epf基因检测Ct值
Figure BDA0002980244270000141
表4-2 mrp基因检测Ct值
Figure BDA0002980244270000142
Figure BDA0002980244270000151
表4-3 sly基因检测Ct值
Figure BDA0002980244270000152
由以上统计结果可以确定SS DNA检测线性范围为1.0×103copies/mL～1.0×109copies/mL，在此范围内epf线性相关系数R2为0.9990，|r|＝0.999；mrp线性相关系数R2为0.9936，|r|＝0.997；sly线性相关系数R2为0.9986，|r|＝0.999，由此可知|r|均≥0.98。
实施例5批间不精密度
取中值精密度参考品R3：1.0×106copies/mL作为待检样本，用质检合格的2018102001(lot1)、2018102101(lot2)、2018102201(lot3)三批“猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)”试剂盒按照试剂盒使用说明书操作在ABI7500实时荧光定量PCR仪器上进行试剂的配制和定量检测，每个浓度梯度设置10次重复。考查试剂盒对阳性样本的批间不精密度，计算检测Ct值变异系数，要求参考品R3的批间Ct值变异系数≤5％，阴性样本应均为阴性。检测结果见表5-1～表5-3。
表5-1 epf基因批间不精密度
Figure BDA0002980244270000153
Figure BDA0002980244270000161
表5-2 mrp基因批间不精密度
Figure BDA0002980244270000162
表5-3 sly基因批间不精密度
Figure BDA0002980244270000163
三批“猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)”在ABI7500仪器上epf、mrp和sly的批间不精密度分别为1.24％，0.90％，1.03％。
实施例6批内不精密度
取中值精密度参考品R3：3.0×106copies/mL作为待检样本，用2018102001批次“猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)”检测试剂盒分别按照(1)不同仪器：ABI7500和MA-6000实时荧光定量；(2)不同施员；(3)不同时间进行检测，每种处理10次平行检测。计算检测结果Ct值变异系数，要求阳性样本相同品牌型号仪器的所有批内Ct值变异系数≤5％，不同品牌型号仪器的所有批内Ct值变异系数≤10％，阴性样本应均为阴性。检测结果见表6-1～表6-3.
表6-1不同仪器对epf、mrp和sly基因检测Ct值的影响
Figure BDA0002980244270000164
Figure BDA0002980244270000171
表6-2不同操作施员对epf、mrp和sly基因检测Ct值的影响
Figure BDA0002980244270000172
表6-3不同检测时间对epf、mrp和sly基因检测Ct值的影响
Figure BDA0002980244270000173
由表6-1～表6-3可知：本项目构建的猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)检测试剂盒在不同仪器、不同操作施用和不同检测时间下对epf、mrp和sly基因检测批内不精密度均不超过5％，批内精密度高。
实施例7试剂盒稳定性研究
用质检合格的2018102001、2018102101、2018102201三批“猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)”分别进行冻融1次、2次、4次、6次、8次的稳定性验证实验。以检测限参考品L(1.0×103copies/mL)和阴性对照，研究不同通融次数对试剂盒最低检测限的影响。检测结果见表7-1～表7-3.
表7-1不同冻融次数对试剂盒epf基因的影响
Figure BDA0002980244270000181
表7-2不同冻融次数对试剂盒mrp基因的影响
Figure BDA0002980244270000182
表7-3不同冻融次数对试剂盒sly基因的影响
Figure BDA0002980244270000183
由上表统计结果可以得出，三批猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)在分别进行冻融1次、2次、4次、6次、8次后均能对最低检测限参考品100％检出，说明试剂盒稳定性好。
实施例8特异性研究
用质检合格的2018102001批次“猪链球菌2型epf/mrp/sly基因检测试剂盒(荧光PCR法)”对猪链球菌的其他分型：1型、2型、3型、4型、9型和16型以及其他细菌如：大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、金色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎链球菌(ATCC 49619)、化脓性链球菌(ATCC 19615)、粪肠球菌(ATCC 29212)和乙型溶血性链球菌(ATCC 21059)，购自广州环凯微生物研究中心。以及猪常见病毒如：伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、猪丹毒杆菌和猪细小病毒提取的核酸进行检测。
检测结果显示仅对猪链球菌2型sly、mrp和epf基因结果为阳性，对其他细菌和病毒检测结果为阴性，表明该试剂盒可以特异性检测猪链球菌2型DNA。
引物epf-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGGTCAGCCACTCTCACACAAGATG-3’，(SEQ ID NO：1)，
引物epf-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCCAGTGGCATCCGTCACTTTAAT-3’，(SEQ ID NO：2)，
引物mrp-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGCCAGAAACAGACCGTCCAAA-3’，(SEQ ID NO：3)，
引物mrp-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCCATTTGTTCCTGGTGTCGTTG-3’，(SEQ ID NO：4)，
引物sly-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGATGGACGCTCTATGTTCATCAAG-3’，(SEQ ID NO：5)，
引物sly-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTTGATACTCAGCATTGCCACTAA-3’，(SEQ ID NO：6)；
多重实时荧光定量PCR引物是在3种毒力基因正反链特异性引物的5’端分别添加一段通用引物序列(见下划线序列)，所述的通用引物核苷酸序列如下所示：
引物UP-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3’，(SEQ ID NO：7)，
引物UP-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATC-3’，(SEQ ID NO：8)，
本发明的一种检测猪链球菌2型3种毒力基因的多重实时荧光定量PCR探针的核苷酸序列如下所示：
探针epf-P：5’-CCAGCTAGGTCTCCTGCTCCCCAA-3’，(SEQ ID NO：9)，
探针mrp-P：5’-ACCCATTTGACCCAACAGAGCCAG-3’，(SEQ ID NO：10)，
探针sly-P：5’-AGGAGTACCCAAGTTCAAGCCGCA-3’，(SEQ ID NO：11)。
Figure BDA0002980244270000201
Figure BDA0002980244270000211
Figure BDA0002980244270000221
Figure BDA0002980244270000231
序列表
<110> 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司
<120> 猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11

Claims (10)

1.一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括SS-2引物探针混合液和通用引物混合液，其特征在于：
SS-2引物的核苷酸序列如下所示：
引物epf-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGGTCAGCCACTCTCACACAAGATG-3’，(SEQ ID NO：1)，
引物epf-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCCAGTGGCATCCGTCACTTTAAT-3’，(SEQ ID NO：2)，
引物mrp-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGCCAGAAACAGACCGTCCAAA-3’，(SEQ ID NO：3)，
引物mrp-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCCATTTGTTCCTGGTGTCGTTG-3’，(SEQ ID NO：4)，
引物sly-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGATGGACGCTCTATGTTCATCAAG-3’，(SEQ ID NO：5)，
引物sly-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTTGATACTCAGCATTGCCACTAA-3’，(SEQ ID NO：6)；
SS-2正反链特异性引物的5’端分别连接一段通用引物核苷酸序列，所述的通用引物核苷酸序列如下所示：
引物UP-F：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3’，(SEQ ID NO：7)，
引物UP-R：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATC-3’，(SEQ ID NO：8)。
SS-2探针的核苷酸序列如下所示：
探针epf-P：5’-CCAGCTAGGTCTCCTGCTCCCCAA-3’，(SEQ ID NO：9)，
探针mrp-P：5’-ACCCATTTGACCCAACAGAGCCAG-3’，(SEQ ID NO：10)，
探针sly-P：5’-AGGAGTACCCAAGTTCAAGCCGCA-3’，(SEQ ID NO：11)；
探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中一种；且探针epf、mrp和sly的5’端标记的荧光基团均不相同。
2.根据权利要求1所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括SS-2PCR反应Buffer、SS-2酶系、SS-2阴性对照、SS-2阳性对照和SS-2定量标准品。
3.根据权利要求2所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的SS-2阳性对照维含有确定拷贝数的epf、mrp和sly的3种基因的重组质粒；SS-2定量标准品为含有不同拷贝数的epf、mrp和sly的3种基因的重组质粒；所述的SS-2酶系为热启动Taq DNA聚合酶和dNTPs的混合液。
4.根据权利要求1所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：epf、mrp和sly 3种毒力基因探针序列的5’端分别标记FAM、VIC、ROX荧光素，探针序列3’端分别标记BHQ1、BHQ1和BHQ2淬灭基团。
5.根据权利要求1或2或4所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：epf基因引物浓度50nmol/L，探针浓度100nmol/L；mrp基因引物浓度50nmol/L，探针浓度160nmol/L；sly基因引物浓度50nmol/L，探针浓度80nmol/L；通用引物浓度400nmol/L。
6.根据权利要求2所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：SS-2PCR反应Buffer中包括HEPES缓冲液，在PCR反应中的终浓度HEPES为20mmol/L，(NH4)2SO4的反应终浓度为10mmol/L，KCl的反应终浓度为50mmol/L，蔗糖的终浓度为25mmol/L，Mg2+的终浓度为2.5mmol/L。
7.根据权利要求2所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的SS-2酶系由热启动Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL和25mmol/L dNTPs 0.2μL组成，每份0.5μL。
8.根据权利要求2所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的SS-2阴性对照为超纯水，电阻率大于18.0MΩ.CM；所述的SS-2定量标准品为人工合成的含有不同拷贝数的epf、mrp和sly的3种目的基因片段的重组质粒经浓度测定，定值后采用EB缓冲液稀释至拷贝数分别为1.0×1010、1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104和1.0×103copies/mL后-20℃±5℃存储。
9.一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
(1)提取血清样本病毒核酸；
(2)配制SS-2定量PCR检测体系，其中，所述检测体系中包括所述的引物和探针；
(3)定量PCR反应；
(4)结果判定。
10.根据权利要求9所述的一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)核酸提取
分离猪血血清，采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行血清病毒核酸提取，提取的病毒核酸立即用于检测，否则存储于-20℃±5℃；
(2)试剂的配置
配置定量25μL定量PCR检测体系，具体为将试剂盒室温溶解后，将试剂盒各组分涡旋混匀，按照：SS-2PCR反应Buffer 17.5μL、SS-2酶系0.5μL、SS-2引物探针混合液2μL混合后进行分装，每测试分装20μL后添加核酸模板5μL，定量检测需要同步进行不同拷贝数的定量标准品检测；
(3)PCR检测
按照如下PCR反应程序进行定量PCR检测：ABI7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为：95℃5分钟，然后经过95℃15秒，58℃45秒钟，5个循环；95℃15秒，60℃45秒钟荧光收集，40个循环。
(4)结果分析
质控标准：阴性对照检测结果在FAM、VIC、ROX通道均为阴性，阳性对照检测结果在FAM、VIC、ROX通道均为阳性，且扩增曲线呈明显“S”型曲线；
结果判读：在质控合格的前提下进行结果分析，定性分析可直接根据检测Ct值进行阴性或者阳性判定，在FAM、VIC和ROX任一通道为阳性检测结果均为阳性；定量分析需要结合定量标准品的标准曲线，将待测样品猪链球菌2型的检测CT值代入标准曲线公式，计算样品中含有的猪链球菌毒力基因的基因拷贝数。
CN202110285406.9A 2021-03-17 2021-03-17 猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法 Pending CN112941211A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110285406.9A CN112941211A (zh) 2021-03-17 2021-03-17 猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110285406.9A CN112941211A (zh) 2021-03-17 2021-03-17 猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112941211A true CN112941211A (zh) 2021-06-11

Family

ID=76228699

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110285406.9A Pending CN112941211A (zh) 2021-03-17 2021-03-17 猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112941211A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042378A (zh) * 2023-03-29 2023-05-02 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 一种猪链球菌2型毒力基因检测试剂盒及其检测方法
CN117965705A (zh) * 2024-03-29 2024-05-03 上海锐赛循益生物技术有限公司 一种改变不同核酸靶标相对pcr扩增速度的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1908191A (zh) * 2006-06-29 2007-02-07 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 应用于猪链球菌2型致病性检测的多重荧光pcr检测试剂及方法
CN101812518A (zh) * 2010-03-08 2010-08-25 上海交通大学 猪链球菌毒力因子的多重pcr检测试剂盒及其检测方法
CN103981278A (zh) * 2014-06-06 2014-08-13 黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对
CN110607374A (zh) * 2019-10-09 2019-12-24 百特元生物科技（北京）有限公司 一种同时扩增人27个str基因座的荧光标记扩增试剂盒及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1908191A (zh) * 2006-06-29 2007-02-07 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 应用于猪链球菌2型致病性检测的多重荧光pcr检测试剂及方法
CN101812518A (zh) * 2010-03-08 2010-08-25 上海交通大学 猪链球菌毒力因子的多重pcr检测试剂盒及其检测方法
CN103981278A (zh) * 2014-06-06 2014-08-13 黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对
CN110607374A (zh) * 2019-10-09 2019-12-24 百特元生物科技（北京）有限公司 一种同时扩增人27个str基因座的荧光标记扩增试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATHERINE E. VARLEY AND ROBI D. MITRA1: "Nested Patch PCR for Highly Multiplexed Amplification of Genomic Loci", 《COLD SPRING HARB PROTOC》 *
ZONGLIANGGAO ET AL.: "Delineation of the Exact Transcription Termination Signal for Type 3 Polymerase III", 《MOLECULAR THERAPY NUCLEIC ACIDS》 *
王花茹等: "致病性猪链球菌主要毒力因子基因多重PCR检测", 《中华流行病学杂志》 *
王蓉蓉 等: "猪链球菌2型主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立", 《中国动物传染病学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042378A (zh) * 2023-03-29 2023-05-02 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 一种猪链球菌2型毒力基因检测试剂盒及其检测方法
CN116042378B (zh) * 2023-03-29 2023-06-23 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 一种猪链球菌2型毒力基因检测试剂盒及其检测方法
CN117965705A (zh) * 2024-03-29 2024-05-03 上海锐赛循益生物技术有限公司 一种改变不同核酸靶标相对pcr扩增速度的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
US6867021B2 (en) Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli
CN114085903B (zh) 检测线粒体3243a＞g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法
CN111705163A (zh) 基于热对流pcr的新型冠状病毒快速检测试剂盒
CN112941211A (zh) 猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN110714098A (zh) 一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物、试剂盒及其应用
CN112063747A (zh) 一种基于荧光pcr技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用
CN113637798A (zh) 检测新冠病毒Alpha毒株S基因Δ69/70HV缺失突变位点的引物、探针及其应用
CN113025734A (zh) 鉴别布鲁氏菌疫苗株a19与野毒株的引物、探针及应用
CN114058738B (zh) 一种检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒荧光定量pcr检测试剂盒
CN113718045B (zh) 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用
CN111235321A (zh) 一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒
CN116656845A (zh) 诊断布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN111719020B (zh) 一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒及引物和探针
CN108315480B (zh) 一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量pcr引物、探针和试剂盒
CN113186359A (zh) 猪星状病毒检测和分型富集多重pcr快速诊断试剂盒
CN112899385A (zh) 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用
Wang et al. A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2
CN117417989B (zh) 一种用于检测耐药基因的多重荧光定量pcr试剂盒和方法
CN113736894B (zh) 四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒
CN116287478B (zh) 用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒
CN117144029A (zh) 一种检测猪细菌性腹泻病原的荧光定量pcr引物探针组
CN113151603A (zh) 猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN117757990A (zh) 一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合、试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210611