CN110714098A

CN110714098A - 一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110714098A
Application number: CN201911144546.3A
Authority: CN
Inventors: 杨德全; 鞠厚斌; 赵洪进; 王建; 李鑫; 沈海潇; 杨显超; 刘春国; 刘林青; 葛菲菲; 刘健; 邓波
Original assignee: Shanghai Animal Epidemic Prevention And Control Center (shanghai Veterinary Drug Feed Testing Institute And Shanghai Animal Husbandry Technology Promotion Center)
Current assignee: Shanghai Animal Epidemic Prevention And Control Center (shanghai Veterinary Drug Feed Testing Institute And Shanghai Animal Husbandry Technology Promotion Center)
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2020-01-21

Abstract

本发明涉及一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其包括用于检测猫杯状病毒的引物和用于检测猫传染性腹膜炎病毒的引物和探针；其中，所述引物包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的序列；所述探针包括如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示的序列。本发明还涉及包括上述组合物的试剂盒及其应用。本发明所述的试剂盒在闭管状态下进行扩增产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强；可同时实现FCV和FIPV两种病毒的检测，大大缩短了检测时间，降低了检测成本；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染，且其检测特异性强、敏感性高、快速、安全，对样品中含微量FCV和FIPV基因组的检测效果良好。

Description

一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测猫杯状病毒(FCV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)为大部分猫科动物的高致病性的病原体。在猫科动物中广泛的流行，且呈世界性分布，现已从世界上许多国家和地区的猫和猎豹中分离到。我国猫、猎豹和老虎之间也存在着猫杯状病毒，以及已经出现了毒株，该病毒对猫以及珍稀野生动物的健康造成了很大的威胁。尽管有针对预防FCV的疫苗(猫三联疫苗)已普遍在幼猫中使用，但仍存在一些免疫失败的报道。主要因为病毒对环境适应性很强，使多数免疫动物呈现出亚临床感染症状和持续感染症状，并可持续向外排毒。为了避免可能造成的严重后果，建立一种方便、快捷、灵敏的荧光定量PCR检测方法，用于感染动物的FCV检测尤为重要，也为有效控制该病的传播提供了有力的技术支持。

猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)引起的猫科动物的一种慢性、渐进性、致死性传染病，以腹膜炎、大量腹水积聚及致死率较高为主要特征。该病不同年龄的猫均易感，多发于4岁以下年轻成猫，纯种猫发病率高于一般家猫。本病的潜伏期长短不一，各种应激条件以及感染猫的自身疾病和猫免疫缺陷病等都是促使FIP发病的重要因素。该病呈地方流行性，发病率低，但一旦出现临床症状，致死率几乎为100％。为及时发现，实现快速诊断，建立一种方便、快捷、灵敏的荧光定量PCR检测方法，用于感染动物的FIPV检测尤为重要，也为有效控制该病的传播提供了有力的技术支持。

鉴于FCV和FIPV所引起的疾病为临床上猫的常见、多发疾病，且FIPV引起的疾病一般为致死性疾病，建立快速、准确的联合检测FCV和FIPV的方法是有效诊断和防控猫科动物感染FCV和FIPV的基础。

目前国内仅有检测FCV的单通道荧光定量PCR(姜雪，高玉伟，胡桂学等.猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J].吉林大学学报(理学版)，2013，51(5)：973-977)，但该方法检测FCV的检出量高从而导致其检测的敏感性较低，且每次仅能检出一种病毒，检测速度慢、效率低，且目前未发现有检测FIPV的单通道荧光定量PCR报道。因此，建立检测FCV和FIPV的双重荧光PCR能够快速、准确的检测FCV和FIPV的感染，为FCV和FIPV感染的流行病学调查及监测提供切实可行的方法。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的对FCV的检测采用单通道荧光PCR方法或者荧光PCR所具有的敏感性低、反应时间长等缺陷，本发明提供一种检测猫杯状病毒(FCV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的组合物、试剂盒及其应用，其在闭管状态下进行扩增产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强；可同时实现FCV和FIPV两种病毒的检测，大大缩短了检测时间，降低了检测成本；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染。因此，本发明所述的检测方法特异性强、敏感性高、快速、安全，对样品中含微量FCV和FIPV基因组的检测效果良好，可用于FCV和FIPV的实验室检测和分子流行病学调查。

当进行双通道PCR扩增时，其通常含有两对以上的引物以及两个以上不同的探针，而本领域技术人员均知同时使用的多个引物其在设计过程中需要兼顾不同引物的Tm值以及各个引物的特异性问题，还需要尽量避免多个引物的混合容易出现的引物之间形成二聚体的情况；不同探针的设计以及同时使用也存在类似的问题。而本发明通过严谨的设计及筛选，得到了特异性高、敏感性好且两对引物和与之同时使用的两个探针，为后续猫科动物病毒性疾病检测的发展提供了支点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其包括用于检测猫杯状病毒(FCV)的引物和用于检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的引物；其中，所述用于检测FCV的引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；所述用于检测FIPV的引物包括如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

进一步地，所述组合物还包括用于检测FCV的探针和用于检测FIPV的探针；其中，所述用于检测FCV的探针包括如SEQ ID NO.5所示的序列；所述用于检测FIPV的探针包括如SEQ ID NO.6所示的序列。

进一步地，所述探针的5’端标记荧光基团，所述探针的3’端标记淬灭基团；其中，所述用于检测FCV的探针和用于检测FIPV的探针所标记的荧光基团和淬灭基团不同；优选地，用于检测FCV的探针5’端标记FAM基团，3’端标记TAMRA基团，用于检测FIPV的探针5’端标记HEX基团，3’端标记BHQ1基团。可理解的是，上述荧光基团和淬灭基团可为本领域常规使用的任一合适基团。

进一步地，上述检测采用实时荧光定量RT-PCR。

本发明的第二个方面是提供一种用于检测FCV和FIPV的试剂盒，其包括PCR反应体系，所述PCR反应体系包括任一上述的用于检测FCV和FIPV的组合物；其中，所述组合物优选包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的引物序列和如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示的探针序列。

进一步地，所述PCR反应体系中的各引物的浓度分别为200～400nM，优选为200nM；各探针的浓度分别为200～400nM，优选为400nM。

进一步地，所述PCR反应体系还包括PCR反应液和酶混合液，所述PCR反应液包括Mg²⁺、dNTP以及PCR反应缓冲液，所述酶混合液包括逆转录酶、热启动Taq酶以及RNA酶抑制剂。

进一步地，所述PCR反应体系中，所述Mg²⁺的浓度为1～2.5mmol/L，优选为2.0mmol/L；所述dNTP的浓度为0.1～0.25mmol/L，优选为0.2mmol/L；所述PCR缓冲液为2×One StepRT-PCR缓冲液；所述逆转录酶的用量为0.5～2U/反应；所述热启动Taq酶的用量为0.1～0.5U/反应；所述RNA酶抑制剂的用量为1～3U/反应。

进一步地，在本发明一较佳实施例中，所述PCR反应体系包括引物探针混合物，所述引物探针混合物由上述两引物对和两探针组成，其中所述两引物对(包含两个上游引物和两个下游引物：FCV-F、FIPV-F、FCV-R和FIPV-R)中各引物的量为0.25μL、浓度为10μM，各探针的量为0.5μL、浓度为10μM；所述PCR反应液由10μL 2×One Step RT-PCR缓冲液、2μL25mM的MgCl₂、1μL10mM的dNTP以及2μL DEPC-H₂O组成，所述酶混合液由1μL 40U/μL的RNA酶抑制剂、1μL 25U/μL的逆转录酶和1μL 5U/μL的Taq酶组成。

进一步地，所述试剂盒为实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

进一步地，为了更直观、准确地判定检测结果，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有FCV和FIPV目的基因序列的重组质粒，所述阴性对照为去离子水；优选地，所述阳性对照的浓度为7.6×10⁶拷贝/μL，所述阴性对照为DEPC-H₂O。

进一步地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂；其中，所述RNA提取试剂可为本领域常规的提取动物病毒RNA的试剂；优选地，所述RNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O中的一种或多种；所述样品裂解液优选Trizol，所述DEPC-乙醇优选质量百分数为75％的DEPC-乙醇。

进一步地，在本发明一较佳实施例中，一种用于检测FCV和FIPV的试剂盒，其包括：

(1)RNA提取试剂，包括：

样品裂解液管：Trizol 750μL；氯仿管：氯仿200μL；75％乙醇管：75％DEPC-乙醇800μL；异丙醇管：异丙醇600μL；DEPC-H₂O管：11μL；以上为适合提取1个样本的RNA的试剂用量；所述RNA提取试剂需要4℃保存；

(2)反应体系，包括：

引物探针混合液管：10μM FCV和FIPV上、下游引物各0.25μL，10μM探针(FCV-P和FIPV-P)各0.5μL，合计2μL；PCR反应液管：2×One Step RT-PCR缓冲液(无Mg²⁺)(PCR Buffer(无Mg²⁺))10μL，25mM MgCl₂ 2μL，10mMdNTP 1μL，DEPC-H₂O 2μL，合计15μL；酶混合液(Enzyme Mix)管：40U/μLRNA酶抑制剂1μL，25U/μL逆转录酶1μL，5U/μL Taq酶1μL，合计3μL；

以上为单次反应的试剂用量，所述的反应体系需要-20℃保存；

(3)阳性对照管：浓度为7.6×10⁶拷贝/μL的FCV和FIPV阳性质粒5μL；

(4)阴性对照管：DEPC-H₂O 5μL。

进一步地，在上述较佳实施例中，所述2×One Step RT-PCR缓冲液(无Mg²⁺)(PCRBuffer(无Mg²⁺))、25mM MgCl₂、10mM dNTP混合物、逆转录酶和Taq酶也可以使用本领域常规的试剂盒产品，如可以使用荧光RT-PCR试剂盒(Real Time RT-PCR Kit)替代上述几种试剂，优选TaKaRa公司产品荧光PCR试剂盒(One Step PrimeScript^TM PCR Kit(Perfect RealTime))。

进一步地，所述试剂盒对FCV和FIPV的最低检测限均为7.6×10⁰拷贝/μL。

本发明的第三个方面是提供一种任一上述的组合物在制备检测FCV和FIPV的产品中的应用；其中，所述产品优选为试剂盒形式。更进一步地，所述试剂盒为双通道实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

本发明的第四个方面是提供一种非诊断目的的检测FCV和FIPV的方法，其包括：

步骤(1)使用RNA提取试剂提取待检样品中的RNA；

步骤(2)以步骤(1)提取的RNA为模板，采用任一上述的组合物或任一上述的试剂盒进行RT-PCR反应；

步骤(3)在步骤(2)所述的RT-PCR反应结束后，分析检测结果。

进一步地，步骤(1)中，所述提取待检样品的RNA的方法为本领域的常规方法，优选为采用Trizol法提取样品的RNA；步骤(1)中所述RNA提取试剂优选包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O中的一种或多种；所述样品裂解液优选为Trizol，所述DEPC-乙醇优选为质量百分数为75％的DEPC-乙醇。

进一步地，所述待检样品为猫鼻拭样品。

进一步地，步骤(2)中，所述RT-PCR反应的反应过程为：分别取引物探针混合液1～3μL、PCR反应液14～16μL、酶混合液2～4μL配制成17～23μL反应体系，再加入2～8μL步骤(1)所得的RNA；将FCV和FIPV阳性质粒作为阳性对照样品，DEPC-H₂O作为阴性对照样品，与待检样品RNA同时进行荧光RT-PCR反应；其中，步骤(2)中，所述RT-PCR反应的反应条件优选为：(1)42～50℃逆转录10～15min；(2)94～95℃10～15min；(3)94～95℃10～15s；(4)55～60℃35～60s；(3)-(4)循环40～45次(收集荧光信号)。

进一步地，步骤(3)中，所述分析检测结果的操作过程可为本领域的常规方法，优选所述分析检测结果的操作过程如下：反应结束后，阳性对照应用两个检测通道读取数据时，应出现两条相应的典型扩增曲线，且Ct值≤30；阴性对照应用两个检测通道读取数据时，均无Ct值且无扩增曲线。二者均成立可判定试验成立，否则试验无效。若两个检测通道Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表明FCV和FIPV病毒核酸均为阳性；如仅FAM检测通道出现典型的扩增曲线，且Ct值≤35，而HEX检测通道无Ct值且无典型扩增曲线，表明FCV核酸阳性；如仅HEX检测通道出现典型的扩增曲线，且Ct值≤35，而FAM检测通道无Ct值且无典型扩增曲线，表明FIPV核酸阳性。若双检测通道均无Ct值且无典型扩增曲线，表明样品中无FCV和FIPV病毒核酸。若任一检测通道Ct值＞35，且出现典型的扩增曲线的样品建议重复试验，重复试验结果相同为阳性，否则为阴性。

进一步地，在本发明一较佳实施例中，一种非诊断目的的检测FCV和FIPV的方法，其是一种采用荧光定量RT-PCR检测FCV和FIPV的方法，其包括如下步骤：

(1)样品RNA的提取：于750μL Trizol裂解液中加入待测样品200μL，混匀，15～25℃静置5min后，再加入200μL氯仿，振荡混匀，于4℃、12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μL于-20℃预冷的异丙醇，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μL 75％DEPC-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于15～25℃干燥后加入11μL DEPC-H₂O溶解，备用。

(2)RT-PCR反应与结果分析：分别取引物探针混合液2μL、PCR反应液15μL、酶混合液3μL配制成反应体系；

取阴性对照、标本、阳性对照各5μL，分别加入反应体系中使用市售的荧光定量PCR仪(如ViiA 7)进行PCR扩增。PCR循环条件是：①42℃逆转录10min；②94℃15min；③95℃15s；④60℃45s，③-④循环45次(收集荧光信号)；

反应结束后保存检测数据文件；根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果；如扩增曲线有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

可理解的是，本领域技术人员对上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案，具有如下技术效果：

本发明提供的用于检测FCV和FIPV的方法具有特异性好，敏感性高(检测限可低至7.6×10⁰拷贝/μL)，操作简单、快速，能够同时检测FCV和FIPV，省时省力等优点；本发明试剂盒具有成本低、检测速度快、不易污染、结果易于判定等优点，适用于FCV和FIPV感染的快速诊断。本发明方法和试剂盒还适合大规模的流行病学调查研究。因此，本发明的检测方法和试剂盒具有很好的应用前景。

附图说明

图1为组合1检测FCV和FIPV的双通道的荧光RT-PCR的扩增曲线结果示意图；其中，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL进行扩增后，以检测FCV的FAM通道和以检测FIPV的HEX通道均出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显。

图2为组合1检测FCV和FIPV的双通道的荧光RT-PCR的标准曲线结果示意图；其中，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL进行扩增，3个重复，FAM和HEX检测通道的标准品起始模板浓度与Ct值均呈现良好的线性关系；FAM检测通道：斜率接近-3.523，相关系数R²为0.998；HEX检测通道：斜率接近-3.335，相关系数R²为0.997。

图3为组合2检测FCV和FIPV的双通道的荧光PCR的扩增曲线结果示意图；其中，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL进行扩增后，以检测FCV的FAM通道和以检测FIPV的HEX通道均出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显。

图4为组合2检测FCV和FIPV的双通道的荧光PCR的标准曲线结果示意图；其中，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL进行扩增，3个重复，FAM和HEX检测通道的标准品起始模板浓度与Ct值均呈现较好的线性关系；FAM检测通道：斜率接近-3.402，相关系数R²为0.988；HEX检测通道：斜率接近-3.265，相关系数R²为0.991。

图5为组合1检测FCV和FIPV的双通道的荧光PCR的特异性试验结果示意图；其中，7份特异性参考品中，FCV疫苗株和FIPV阳性样品的扩增曲线为S型扩增曲线，其他5份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；5份特异性参考品分别为RV疫苗株、FHV疫苗株、FPV疫苗株、CIV、CDV阳性样品等猫的常见病原体。

图6为组合2检测FCV和FIPV的双通道的荧光PCR的特异性试验结果示意图，7份特异性参考品中，FCV疫苗株和FIPV阳性样品的扩增曲线为S型扩增曲线，RV疫苗株出现非S型扩增曲线且与基线交叉，有Ct值，可判为假阳性。其他5份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；5份特异性参考品分别为RV疫苗株、FHV疫苗株、FPV疫苗株、CIV、CDV阳性样品等猫的常见病原体。

图7为组合1检测FCV和FIPV的双通道的荧光PCR的敏感性试验结果示意图，7份敏感性参考品中浓度为7.6×10⁰拷贝/μL的样本在FAM和HEX检测通道中有S型扩增曲线可明确判定为阳性，最低检测限为7.6×10⁰拷贝/μL。

图8为组合2检测FCV和FIPV的双通道的荧光PCR的敏感性试验结果，7份敏感性参考品中浓度为7.6×10⁰拷贝/μL的样本在FAM和HEX检测通道中有扩增曲线且Ct值大于35，可判断为阴性，其余样本在FAM和HEX检测通道中均有S型扩增曲线可明确判定为阳性，最低检测限为7.6×10¹拷贝/μL。

图9为某宠物医院疑似发病猫检测FCV和FIPV的荧光PCR的检测图；其中，P1、P2分别为FCV、FIPV阳性对照；N1、N2分别为FCV、FIPV阴性对照；S1～S4为4份猫鼻拭样品。

具体实施方式

本发明涉及一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其包括用于检测猫杯状病毒的引物和用于检测猫传染性腹膜炎病毒的引物；还可包括用于检测猫杯状病毒的探针和用于检测猫传染性腹膜炎病毒的探针；其中，所述用于检测猫杯状病毒的引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；所述用于检测猫传染性腹膜炎病毒的引物包括如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列；所述用于检测猫杯状病毒的探针包括如SEQ ID NO.5所示的序列；所述用于检测猫传染性腹膜炎病毒的探针包括如SEQ ID NO.6所示的序列。本发明还涉及包括上述组合物的试剂盒及其应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中所用引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

下述实施例中部分试剂和仪器的来源如下：

2×One Step RT-PCR缓冲液(PCR Buffer)(无Mg²⁺)、25mM MgCl₂、10mM dNTP混合物、逆转录酶、5U/μL Taq酶以及荧光RT-PCR试剂盒[One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)]均购自宝生物工程(大连)有限公司；

ViiA 7为赛默菲产品；

狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、杯状病毒疫苗株(FCV)、猫细小病毒疫苗株(FPV)均为荷兰英特威产品。

犬流感病毒(CIV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)阳性样品、犬瘟热(CDV)阳性样品均为上海市动物疫病预防控制中心实验室保存。

实施例1

本实施例为一较佳的用于检测猫杯状病毒(FCV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的特异性引物和探针的设计。

根据FCV ORF1基因的保守序列设计引物和探针，再根据FIPV 7b基因的保守序列设计引物和探针，如下表1所示，按照以下序列，合成特异性荧光RT-PCR引物和探针。以DEPC-H₂O稀释引物至10μM，-20℃保存备用。

表1引物和探针组合

其中FCV-F1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，FCV-R1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，FIPV-F1的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所示，FIPV-R1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，FCV-P1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，FIPV-P1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。

实施例2

本实施例为一较佳的含有实施例1中组合1的用于检测猫杯状病毒(FCV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的反应体系的建立和优化。

1、样品的准备：合成目的扩增区域FCV ORF1和FIPV 7b，连接到PET30a载体，转化到BL21(B)受体菌，挑选阳性克隆，构建成含有FCV和FIPV目的扩增区域的阳性质粒作为FCV和FIPV检测的阳性对照；以狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、犬流感病毒(CIV)、犬瘟热(CDV)阳性样品作为特异性参考品；以去离子水作为阴性对照，分别用TRIZOL提取上述阳性对照与特异性参考品的RNA，阴性对照待用。

2、引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从100nM/反应至400nM/反应梯度的引物和探针进行PCR反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在200～400nM/反应之间均可，其中最佳的引物浓度为200nM/反应、探针浓度为400nM/反应。

3、镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mmol/L至2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2.0mmol/L。

4、dNTP浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTP浓度为0.2mmol/L。

5、热启动Taq酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1U(酶单位)至0.8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的热启动Taq酶用量为0.1～0.5U/反应。

6、逆转录酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的逆转录酶用量为0.5～2U/反应。

7、RNA酶抑制剂用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.5U(酶单位)至4U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNA酶抑制剂用量为1～3U/反应。

8、反应温度的优化：根据酶的活性和靶核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：42℃逆转录10min；94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。

实施例3

本实施例为一较佳的采用实施例1中组合1的标准曲线的建立。

将FCV和FIPV阳性质粒DNA用分光光度计测定浓度后，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL，设置3个重复，进行扩增，反应结束后，利用Vii荧光定量PCR分析软件自动得到标准曲线。结果显示以引物(FCV-F1和FCV-R1)和探针FCV-P1建立的检测FCV的FAM检测通道，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有良好的线性范围，斜率接近-3.523，相关系数R²为0.998(见图1和图2)。以引物(FIPV-F1和FIPV-R1)和探针FIPV-P1建立的检测FIPV的HEX检测通道，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有良好的线性范围，斜率接近-3.335，相关系数R²为0.997(见图1和图2)。根据Ct值和标准曲线即可对样品进行准确定量。

实施例4

本实施例采用采用实施例3中所述优化的体系及扩增条件进行特异性和敏感性试验。

取7份特异性参考品分别为狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、杯状病毒疫苗株(FCV)、猫细小病毒疫苗株(FPV)、犬流感病毒(CIV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)阳性样品、犬瘟热(CDV)阳性样品等7个样本，提取核酸，采用荧光PCR进行试剂盒的特异性试验。其中，(1)样品RNA的提取：于750μL Trizol裂解液中加入待测样品200μL，混匀，15～25℃静置5min后，再加入200μL氯仿，振荡混匀，于4℃、12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μL于-20℃预冷的异丙醇，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μL 75％DEPC-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于15～25℃干燥后加入11μLDEPC-H₂O溶解，备用。(2)PCR反应：分别取引物探针混合液2μL、PCR反应液15μL、酶混合液3μL配制成反应体系。荧光PCR的条件如下：42℃逆转录10min；94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。

建立的双通道荧光PCR结果表明FCV疫苗株和FIPV阳性样品分别在FAM和HEX通道出现S型扩增曲线。而狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、猫细小病毒疫苗株(FPV)、犬流感病毒(CIV)、犬瘟热(CDV)阳性样品均没有出现特异性扩增曲线(见图5)，说明所建立的双通道荧光PCR的特异性好。

将含FCV和FIPV目的基因的阳性质粒DNA用分光光度计测定浓度后，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³、7.6×10²、7.6×10¹、7.6×10⁰拷贝/μL进行荧光PCR扩增，结果表明以引物(FCV-F1和FCV-R1)和探针FCV-P1建立的检测FCV的荧光PCR方法的最低检测限约为7.6×10⁰拷贝/μL(见图7)，以引物(FIPV-F1和FIPV-R1)和探针FIPV-P1建立的检测FIPV的荧光PCR方法的最低检测限约为7.6×10⁰拷贝/μL(见图7)。而姜雪(姜雪，高玉伟，胡桂学，等.猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J].吉林大学学报(理学版)，2013，51(5)：973-977)等针对FCV ORF2基因片段设计特异性引物和探针建立的荧光RT-PCR方法，最低可检出量为2.26×10¹拷贝/μL。而组合1中FCV的敏感性是现有技术(可检出量为2.26×10¹拷贝/μL)的3倍。现有文献并没有报道FIPV所建立的荧光RT-PCR方法的最低检测限。由此可见，本发明的敏感性高于现有单通道荧光定量PCR的敏感性。此外，本发明的反应体系为一步法反应体系和反应程序设置时间比现有技术报道的荧光RT-PCR的二步法反应体系更简单、试剂配制更方便，反应时间更短，约节省30min。

实施例5

本实施例为一较佳的含有实施例2中反应体系的试剂盒的组装。

按照RNA提取和荧光RT-PCR两个部分完成试剂盒组分的配制，以下提供的数据及试剂组成为单次荧光PCR检测所需试剂：

(1)RNA提取(4℃保存)

样品裂解液管：Trizol 750μL；

氯仿管：氯仿200μL；

75％乙醇管：75％DEPC-乙醇800μL；

异丙醇管：异丙醇600μL；

DEPC-H₂O管：11μL；

(2)荧光RT-PCR(-20℃保存)

引物探针混合液管：10μM FCV和FIPV上、下游引物各0.25μL，10μM探针(FCV-P和FIPV-P)各0.5μL，合计2μL；

PCR反应液管：2×One Step RT-PCR缓冲液(无Mg²⁺)(PCR Buffer(无Mg²⁺))10μL，25mM MgCl₂ 2μL，10mM dNTP 1μL，DEPC-H₂O 2μL，合计15μL；

酶混合液(Enzyme Mix)管：40U/μL RNA酶抑制剂1μL，25U/μL逆转录酶1μL，5U/μLTaq酶1μL；

阳性对照管：浓度为7.6×10⁶拷贝/μL的含FCV和FIPV目的基因的阳性质粒5μL；

阴性对照管：DEPC-H₂O 5μL。

按照48份检测剂量为一个包装，将上述配制好的试剂分别装入10个无RNase酶的瓶或管中，并按照相应的储存温度保存运送。

实施例6

本实施例为实施例5所述的试剂盒的应用。

采用实施例5所述的双通道检测FCV和FIPV荧光定量RT-PCR检测试剂盒对上海某宠物医院送检的临床疑似FCV和/或FIPV感染的4份猫鼻拭子样品进行检测。

(1)RNA的提取

于750μL Trizol裂解液中加入待测样品200μL，混匀，室温静置5min后，再加入200μL氯仿，振荡混匀，于4℃12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μL异丙醇(-20℃预冷)，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μL 75％DEPC-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于室温干燥后加入11μL DEPC-H₂O溶解，备用。

(2)荧光RT-PCR反应与结果分析

分别取引物探针混合液2μL、PCR反应液15μL、酶混合液3μL配制成反应体系。

取阴性对照(N1、N2)、标本(S1、S2、S3、S4)、含FCV、FIPV目的基因的阳性对照(P1、P2)各5μL，分别加入反应体系中使用市售的荧光定量PCR仪(如Vii7)进行PCR扩增。PCR循环条件是：42℃逆转录10min；94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。

整个反应共需60min，反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果，结果如图9所示。检测结果表明，设定的对照全部成立；FAM检测通道，S1、S2、S3、S4 4份样品的Ct值分别为26.42、none、none、29.84，S1、S4样品的Ct值均小于35，且出现典型的S型扩增曲线，表明S1、S4样品中均有FCV核酸阳性。HEX检测通道，S1、S2、S3、S4 4份样品的Ct值分别为none、none、26.63、none，只有S3样品的Ct值小于35，且出现典型的S型扩增曲线，表明S3样品中有FIPV核酸阳性。

对比例

(1)特异性引物和探针的设计

针对GenBank中FCV的保守基因ORF1和FIPV的保守基因7b的保守序列分别设计不同于上述实施例的特异性引物和探针，如下表2所示，按照以下序列，合成特异性荧光RT-PCR引物和探针。以DEPC-H₂O稀释引物至10μM，-20℃保存备用。

表2引物和探针组合

上述FCV-F2～FIPV-P2的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.7～12所示。

(2)标准曲线的建立

采用组合2使用实施例2建立和优化的体系进行标准曲线的建立，建立方法同实施例3。结果显示：

以组合2建立的双通道荧光RT-PCR方法，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有较好的线性范围，FAM检测通道：斜率接近-3.402，相关系数R²为0.988；HEX检测通道：斜率接近-3.265，相关系数R²为0.991(见图3和图4)。

根据Ct值和标准曲线即可对样品进行准确定量。

(3)特异性和敏感性试验

①特异性试验

具体操作步骤同实施例4，结果显示：

组合2的荧光RT-PCR FCV疫苗株和FIPV阳性样品在FAM和HEX通道均出现S型扩增曲线。而狂犬病毒疫苗株(RV)的扩增曲线尾部上翘，出现非特异扩增，其他猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、猫细小病毒疫苗株(FPV)、犬流感病毒(CIV)、犬瘟热(CDV)阳性样品均没有出现特异性扩增曲线(见图6)，说明所建立的双通道荧光PCR的特异性良好。

由此可见，组合1的荧光RT-PCR特异性优于组合2的荧光RT-PCR特异性。

②敏感性试验

具体操作步骤同实施例4，结果显示：

组合2的荧光RT-PCR方法，以引物(FCV-F2和FCV-R2)和探针FCV-P2建立的检测FCV的荧光PCR方法的最低检测限约为7.6×10¹拷贝/μL(见图8)，以引物(FIPV-F2和FIPV-R2)和探针FIPV-P2建立的检测FIPV的荧光PCR方法的最低检测限约为7.6×10¹拷贝/μL(见图8)。由此可见，组合2的荧光RT-PCR方法的检测限高于组合1。

由上述实施例和对比例可知，本发明所述的试剂盒和方法在闭管状态下进行扩增反应及产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强、敏感性更高；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染；可同时实现FCV和FIPV两种病毒的检测。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心）

<120> 一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物、试剂盒及其应用

<130> 2019112004-zf-cpp

<141> 2019-11-20

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列-引物FCV-F1(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgttaaytc rgtgtttgat ttg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列-引物FCV-R1(Artificial Sequence)

<400> 2

ggctctgatd gcttgaaact g 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列-引物FIPV-F1(Artificial Sequence)

<400> 3

gggaaagccc gaaacaca 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列-引物FIPV-R1(Artificial Sequence)

<400> 4

actgcctcca cactccacaa t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列-探针FCV-P1(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgggctct tcgccgtcac c 21

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列-探针FIPV-P1(Artificial Sequence)

<400> 6

tacgataaac aactggaccc cgaccga 27

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列-引物FCV-F2(Artificial Sequence)

<400> 7

gtaaaagaaa tttgagacaa t 21

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列-引物FCV-R2(Artificial Sequence)

<400> 8

tactgaagwt cgcgyct 17

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列-引物FIPV-F2(Artificial Sequence)

<400> 9

agcaactact gccacaggat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列-引物FIPV-R2(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaaggttca tctccccagt 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列-探针FCV-P2(Artificial Sequence)

<400> 11

caaactctga gcttcgtgct taaa 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列-探针FIPV-P2(Artificial Sequence)

<400> 12

aatggccaca cagggacaac gc 22

Claims

1.一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测猫杯状病毒的引物和用于检测猫传染性腹膜炎病毒的引物；

其中，所述用于检测猫杯状病毒的引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；所述用于检测猫传染性腹膜炎病毒的引物包括如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

2.根据权利要求1所述的用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其特征在于，所述组合物还包括用于检测猫杯状病毒的探针和用于检测猫传染性腹膜炎病毒的探针；

其中，所述用于检测猫杯状病毒的探针包括如SEQ ID NO.5所示的序列；所述用于检测猫传染性腹膜炎病毒的探针包括如SEQ ID NO.6所示的序列。

3.一种用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应体系，所述PCR反应体系包括如权利要求1或2所述的用于检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的组合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中的各引物的浓度分别为200～400nM；各探针的浓度分别为200～400nM。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系还包括PCR反应液和酶混合液，所述PCR反应液包括Mg²⁺、dNTP以及PCR反应缓冲液，所述酶混合液包括逆转录酶、热启动Taq酶以及RNA酶抑制剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中，所述Mg²⁺的浓度为1～2.5mmol/L；所述dNTP的浓度为0.1～0.25mmol/L；所述PCR缓冲液为2×One Step RT-PCR缓冲液；所述逆转录酶的用量为0.5～2U/反应；所述热启动Taq酶的用量为0.1～0.5U/反应；所述RNA酶抑制剂的用量为1～3U/反应。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，各引物的用量为0.25μL、浓度为10μM，各探针的量为0.5μL、浓度为10μM；所述PCR反应液由10μL 2×One Step RT-PCR缓冲液、2μL25mM的MgCl₂、1μL 10mM的dNTP以及2μL DEPC-H₂O组成，所述酶混合液由1μL 40U/μL的RNA酶抑制剂、1μL 25U/μL的逆转录酶和1μL 5U/μL的Taq酶组成。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有猫杯状病毒和/或猫传染性腹膜炎病毒目的基因序列的重组质粒，所述阴性对照为去离子水。

9.一种如权利要求1或2所述的组合物在制备检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的产品中的应用。

10.一种非诊断目的的检测猫杯状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤(1)使用RNA提取试剂提取待检样品中的RNA；

步骤(2)以步骤(1)提取的RNA为模板，采用如权利要求1或2所述的组合物或采用如权利要求3～8中任一项所述的试剂盒进行RT-PCR反应；

步骤(3)在步骤(2)所述的RT-PCR反应结束后，分析检测结果。