CN113957172A

CN113957172A - 一种同时检测多种猫病原体的试剂盒及其检测方法与应用

Info

Publication number: CN113957172A
Application number: CN202111355281.9A
Authority: CN
Inventors: 方洁; 徐贵峰; 徐德峰; 朱兴彪; 张友兵; 马星星; 赵京鹏; 许然
Original assignee: Guangzhou Weijie Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Weijie Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2022-01-21
Anticipated expiration: 2041-11-16
Also published as: CN113957172B

Abstract

本发明公开了一种同时检测多种猫病原体的试剂盒及其检测方法与应用。其通过设计得到的特异性引物组和探针组，实现在一个反应中同时对猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体进行快速和准确的检测和鉴定。基于此设计得到的检测试剂盒特异性强且灵敏度高，可以有效检测出浓度为1.7×10²copies/mL的猫病原体，且无需多次反复检测，实际应用准确度高，能够广泛用于猫科病毒感染的疫情监测和防控。

Description

一种同时检测多种猫病原体的试剂盒及其检测方法与应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及了一种同时检测多种猫病原体的试剂盒及其检测方法与应用。

背景技术

猫泛白细胞减少症又名猫瘟、猫传染性肠炎，是猫的一种急性高度接触性传染病，主要由猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)引起。FPV属于细小病毒科细小病毒属成员，该病毒进入机体后，可以在肾脏上存活一年以上，因此，会给猫科动物带来严重危害。临床表现多以突然发高热、顽固性呕吐、腹泻、脱水、循环障碍及白细胞急剧减少为主要特征。如果母猫在怀孕期感染FPV，会造成死胎、流产或致使初生小猫出现神经症状，有较大的危害性。

猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)会引起猫病毒性呼吸道传染病，该病毒属于杯状病毒科，其感染的主要表现为上呼吸道症状，即精神沉郁、浆液性和粘液性鼻漏、结膜炎、口腔炎、气管炎、支气管炎，伴有双相热型发热。猫杯状病毒感染是猫的多发病之一，发病率较高。

猫传染性腹膜炎是由猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitisvirus)引起的一种慢性、渐进性和致死性传染病，以腹膜炎、大量腹水积聚及致死率较高为主要特征。猫传染性腹膜炎病毒主要感染0.5～5岁的猫，尤其是12月龄以下的猫感染性最强，此外，易感染猫群还包括纯种猫、多只猫混养以及流浪猫。猫终身携带冠状病毒，一旦体质降低时就有可能会发病，而且，该病毒会经由猫的粪便经口鼻传染其他的猫，具有较高的危害性和传播能力。

弓形虫(Toxoplasma Gondii)是细胞内寄生虫，是一种专性细胞内寄生虫，其寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏和眼底，致使人的免疫力下降，患各种疾病。弓形虫的生活周期需要两个宿主，中间宿主包括爬虫类、鱼类、昆虫类、鸟类、哺乳类等动物和人，终宿主则仅为猫科动物。

猫疱疹病毒(FHV-1)的感染对象只有猫科动物，FHV-1可引起猫的急性和高度接触性的上呼吸道感染，发病率很高(可达100％)。虽然成年猫感染后大多能够痊愈，但幼仔猫感染后症状严重，病死率可达50％，而且终生带毒排毒，并可垂直传播，危害很大。

猫衣原体感染的疾病流行率高，是猫的七大常见传染病之一，容易导致猫慢性结膜炎。衣原体感染指的是一种细胞内革兰氏阴性菌，主要引起眼部感染及上呼吸道感染。从病原性质上来讲，其不仅限于感染眼部和呼吸道，还可能会成为全身感染的病原，不及时治疗可能会发生全身性衣原体感染。

支原体是一种介于细菌、病毒的原核微生物，通过寄居在宿主细胞表面的受体上吸收营养，并释放有毒物质，从而损伤细胞和组织。猫支原体感染会引起猫传染性呼吸道疾病，但相对其他病毒发生率相对较低。主要症状是咳嗽、打喷嚏、结膜炎、呼吸困难和鼻子分泌脓性粘液等。猫支原体感染没有特殊的预防方法，因此猫一旦发病，需要及时治疗。

上述几种疾病在感染后产生的临床症状相似，而且容易产生混合感染，对临床诊断带来极大的干扰性，而且，目前单一性的猫病原体检测耗时长，不能实现对多种病原进行快速和准确的检测和鉴别。因此，有必要建立一种快速的可同步实现大量不同病原的早期诊断方法，以节约诊断时间，以便尽快采取有效的防控措施。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种同时检测多种猫病原体的试剂盒及其检测方法与应用，能够解决单一性的猫病原体检测耗时长的问题，通过一次PCR扩增可同时检测出猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体7种猫病原体，且具有较强的特异性和较高的灵敏度。

本发明的第一个方面，提供一种同时检测多种猫病原体的多重荧光定量PCR引物组，所述猫病原体包括猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物组的核苷酸序列为：

猫内源基因引物对：

Feline-F：5’-AGCACGAAAGTAACTTTAACACCTCC-3’(SEQ ID NO.1)；

Feline-R：5’-TGCTAGTAGTTCTCTGGCGGATAG-3’(SEQ ID NO.2)；

猫瘟病毒引物对：

FPV-F：5’-TAGACTAACACATACATGGCAA-3’(SEQ ID NO.3)；

FPV-R：5’-GCTCCTTCAGATTGAGGC-3’(SEQ ID NO.4)；

猫杯状病毒引物对：

FCV-F：5’-TCGCTAAATCATTACCTACTCCC-3’(SEQ ID NO.5)；

FCV-R：5’-CACCAACAAAAGAGAACCCA-3’(SEQ ID NO.6)；

猫传染性腹膜炎病毒引物对：

FIP-F：5’-TTGCTGTTAAAATTTGCCAT-3’(SEQ ID NO.7)；

FIP-R：5’-TTGTCAATACGGTGTCCA-3’(SEQ ID NO.8)；

猫弓形虫引物对：

TOX-F：5’-AATAGCGTTTGTATATAACCA-3’(SEQ ID NO.9)；

TOX-R：5’-TTTGCAGCATTAATCAGT-3’(SEQ ID NO.10)；

猫衣原体引物对：

CP-F：5’-ATACATAGGCATATAAAGCGACAC-3’(SEQ ID NO.11)；

CP-R：5’-TGTTATCGACCCTACAACCCCA-3’(SEQ ID NO.12)；

猫支原体引物对：

MF-F：5’-CTATATATTCTAGCGATTGGA-3’(SEQ ID NO.13)；

MF-R：5’-ATCAAGATTCAAGTCCGA-3’(SEQ ID NO.14)；

猫疱疹病毒引物对：

FHV-F：5’-GTCTGTTTCCCACTCGCAA-3’(SEQ ID NO.15)；

FHV-R：5’-GTTCCTCGATATTCAAGGTTGT-3’(SEQ ID NO.16)。

本发明的第二个方面，提供一种同时检测多种猫病原体的多重荧光定量PCR探针组，所述猫病原体包括猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述探针组的核苷酸序列为：

猫内源基因探针：

Feline-P：5’-ACTACACGACAGCTAAGA-3’(SEQ ID NO.17)；

猫瘟病毒探针：

FPV-P：5’-AATAGAGCATTGGGCTTACCAC-3’(SEQ ID NO.18)；

猫杯状病毒探针：

FCV-P：5’-CCAATATCAAACCACGAGCCAT-3’(SEQ ID NO.19)；

猫传染性腹膜炎病毒探针：

FIP-P：5’-TCTGATTAAACACGCATTGACCAC-3’(SEQ ID NO.20)；

猫弓形虫探针：

TOX-P：5’-TATCAATTGGATTCGCGCTTT-3’(SEQ ID NO.21)；

猫衣原体探针：

CP-P：5’-TCCCCTTTCGCTCGCCGCTA-3’(SEQ ID NO.22)；

猫支原体探针：

MF-P：5’-TTTATTGCATCGCCACCT-3’(SEQ ID NO.23)；

猫疱疹病毒探针：

FHV-P：5’-TTCCACCAGGAGGTTCTCGT-3’(SEQ ID NO.24)；

或者为这些序列的核苷酸互补序列。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述各探针序列标记的荧光基团和淬灭基团各不相同。

在本发明的一些更优选的实施方式中，FPV和CP探针序列标记的荧光基团都为FAM，猝灭基团为BHQ1；FCV和MF探针序列标记的荧光基团都为VIC/HEX，猝灭基团为BHQ1；FIP和FHV探针序列标记的荧光基团都为ROX/TXR，猝灭基团为BHQ2；TOX和Feline探针序列标记的荧光基团都为CY5，猝灭基团为BHQ3。

本发明的第三个方面，提供一种同时检测多种猫病原体的多重荧光定量PCR试剂，所述猫病原体包括猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述多重荧光定量PCR试剂中含有本发明的第一个方面中的引物组和/或本发明第二个方面的探针组。

本发明的第四个方面，提供了一种本发明第三个方面中的PCR试剂在制备猫病原体检测试剂盒中的应用，所述猫病原体包括猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猫病原体检测试剂盒中还包括核酸释放剂、PCR反应液、酶、阴性质控品和阳性质控品中的至少一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述核酸释放剂含有30～500mM Tris、50～700mM KCl、5～15mM MgCl₂、0.001％～0.01％十二烷基硫酸钠(SDS)和0.2％～10％蔗糖。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述PCR反应液含有30～500mM Tris、50～700mM KCl、5～15mM MgCl₂、0.03％～0.05％Triton X-100、5％～10.0％甘油、0.1～5mMdNTP、30～100mM(NH₄)₂SO₄和0.2％～0.5％二甲基亚砜(DMSO)。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述酶液由2U/μL热启动Taq酶、25U/μL MMLV逆转录酶、20mM Tris、30％甘油和10～20mM二硫苏糖醇(DTT)组成。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述阴性质控品为双蒸水。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述阳性质控品为以FPV、CP、FCV、MF、FIP、FHV、TOX和Feline通用引物扩增标准菌株，然后利用上述引物组PCR扩增获得目的片段，将8段目的片段运用多片段重组方式构建成质粒载体，从而获得阳性表达质粒。

当然，本领域技术人员也可以根据实际情况，选择其他适宜的猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体标准品作为阳性质控品。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述试剂盒的使用包括以下步骤：

(1)提取检测样品中的核酸；

(2)使用所述猫病原体检测试剂盒中的引物组和探针组进行PCR扩增；

(3)根据扩增曲线定性或定量样品中的猫病原体。

其中，定量的方法为：使用阳性标准品作为阳性质控，并绘制标准曲线，根据检测样品扩增曲线中的CT值计算样品中阳性质控品的浓度含量。

在本发明的一些更优选的实施方式中，本发明中的多重荧光定量PCR扩增反应体系为：

和

在本发明的一些更优选的实施方式中，本发明中多重荧光定量PCR扩增反应程序为：40～50℃，5～15min；93～95℃，3～15min；93～95℃，15～35s，52～58℃，35～60s，40个循环。

本发明的有益效果是：

(1)本发明突破了普通PCR方法的限制，一次PCR扩增可同时检测出猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体7种猫病原体，且特异性强，能根据荧光信号值区分开样本中的猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体，且扩增体系中的反应液都是通用的，减少了反应液的使用，避免在配置过程中出现搞混的情况。

(2)不同的引物探针间没有互补结构，退火温度接近，保证了整个体系中猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体的扩增效率一致。

(3)本发明中的检测方法检测灵敏度高，检出限为1.7×10²copies/mL，能够广泛用于各类检测样品中的猫病原体的分类和鉴别，为后续的治疗工作提供了有利的支持。

附图说明

图1为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对FPV、FCV、FIP以及TOX进行荧光定量PCR检测的扩增曲线，其中，A组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10copies/mL；在每组线条中蓝色线为FPV检测结果、粉色线为FCV检测结果、红色线为FIP检测结果、黄色线为TOX检测结果；

图2为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对CP、MF、FHV以及Feline进行荧光定量PCR检测的扩增曲线，其中，A组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表所检测病毒的浓度为1.7×10copies/mL；在每组线条中紫色线为CP检测结果、红棕色线为MF检测结果、蓝色线为FHV检测结果、墨绿色线为Feline检测结果；

图3为使用本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测方法对FPV特异性检测的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图4为使用本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测方法对CP特异性检测的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图5为使用本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测方法对FCV特异性检测的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图6为使用本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测方法对MF特异性检测的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图7为使用本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测方法对FIP特异性检测的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图8为使用本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测方法对FHV特异性检测的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图9为使用本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测方法对TOX特异性检测的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图10为使用本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测方法对犬细小病毒样本特异性检测的检测结果，未检测到扩增曲线；

图11为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对FPV的灵敏度测试结果，其中A线条代表FPV的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表FPV的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表FPV的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表FPV的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表FPV的浓度为1.7×10copies/mL；

图12为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对CP的灵敏度测试结果，其中A线条代表CP的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表CP的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表CP的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表CP的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表CP的浓度为1.7×10copies/mL；

图13为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对FCV的灵敏度测试结果，其中A线条代表FCV的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表FCV的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表FCV的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表FCV的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表FCV的浓度为1.7×10copies/mL；

图14为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对MF的灵敏度测试结果，其中A线条代表MF的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表MF的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表MF的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表MF的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表MF的浓度为1.7×10copies/mL；

图15为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对FIP的灵敏度测试结果，其中A线条代表FIP的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表FIP的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表FIP的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表FIP的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表FIP的浓度为1.7×10copies/mL；

图16为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对FHV的灵敏度测试结果，其中A线条代表FHV的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表FHV的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表FHV的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表FHV的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表FHV的浓度为1.7×10copies/mL；

图17为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对TOX的灵敏度测试结果，其中A线条代表TOX的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表TOX的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表TOX的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表TOX的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表TOX的浓度为1.7×10copies/mL；

图18为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对Feline的灵敏度测试结果，其中A线条代表Feline的浓度为1.7×10⁵copies/mL，B组线条代表Feline的浓度为1.7×10⁴copies/mL，C组线条代表Feline的浓度为1.7×10³copies/mL，D组线条代表Feline的浓度为1.7×10²copies/mL，E组线条代表Feline的浓度为1.7×10copies/mL；

图19为本发明中实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对2例FPV感染猫粪便的检测结果；

图20为本发明中实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对1例CP感染猫粪便的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图21为本发明中实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对1例FCV感染猫粪便的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图22为本发明中实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对1例MF感染猫粪便的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图23为本发明中实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对1例FIP感染猫粪便的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图24为本发明中实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对2例FHV感染猫粪便的检测结果(两条检测项曲线，两条内参曲线)；

图25为本发明中实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对1例TOX感染猫粪便的检测结果，其中，红色线表示扩增曲线，绿色线为阴性质控线；

图26为本发明中实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对8例健康猫采集样本、阴性对照组样本的检测结果，无扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

同时检测多种猫病原体的多重荧光定量PCR检测试剂盒的制备

(1)引物探针设计合成：

根据Genebank公布的猫瘟病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIP)、猫弓形虫(TOX)、猫疱疹病毒(FHV)、猫衣原体(CP)和猫支原体(MF)病毒的基因组序列，比对分析7类群的序列差异，根据每个病毒的特异性区域设计探针，根据每个病毒的保守区域设计上游引物和下游引物。对设计的引物探针逐一测试筛选，挑选出最优的引物探针组合。

其中，FPV和CP探针序列标记的荧光基团都为FAM，猝灭基团为BHQ1；FCV和MF探针序列标记的荧光基团都为VIC/HEX，猝灭基团为BHQ1；FIP和FHV探针序列标记的荧光基团都为ROX/TXR，猝灭基团为BHQ2；TOX和Feline探针序列标记的荧光基团都为CY5，猝灭基团为BHQ3。

最终筛选得到的引物对及对应的探针序列如下所示：

Feline的上游、下游的引物和探针序列分别是：

上游引物：Feline-F：5’-AGCACGAAAGTAACTTTAACACCTCC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：Feline-R：5’-TGCTAGTAGTTCTCTGGCGGATAG-3’(SEQ ID NO.2)；

探针：Feline-P：5’-ACTACACGACAGCTAAGA-3’(SEQ ID NO.17)；

FPV的上游、下游的引物和探针序列分别是：

上游引物：FPV-F：5’-TAGACTAACACATACATGGCAA-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：FPV-R：5’-GCTCCTTCAGATTGAGGC-3’(SEQ ID NO.4)；

探针：FPV-P：5’-AATAGAGCATTGGGCTTACCAC-3’(SEQ ID NO.18)；

FCV的上游、下游的引物和探针序列分别是：

上游引物：FCV-F：5’-TCGCTAAATCATTACCTACTCCC-3’(SEQ ID NO.5)；

下游引物：FCV-R：5’-CACCAACAAAAGAGAACCCA-3’(SEQ ID NO.6)；

探针：FCV-P：5’-CCAATATCAAACCACGAGCCAT-3’(SEQ ID NO.19)；

FIP的上游、下游的引物和探针序列分别是：

上游引物：FIP-F：5’-TTGCTGTTAAAATTTGCCAT-3’(SEQ ID NO.7)；

下游引物：FIP-R：5’-TTGTCAATACGGTGTCCA-3’(SEQ ID NO.8)；

探针：FIP-P：5’-TCTGATTAAACACGCATTGACCAC-3’(SEQ ID NO.20)；

TOX的上游、下游的引物和探针序列分别是：

上游引物：TOX-F：5’-AATAGCGTTTGTATATAACCA-3’(SEQ ID NO.9)；

下游引物：TOX-R：5’-TTTGCAGCATTAATCAGT-3’(SEQ ID NO.10)；

探针：TOX-P：5’-TATCAATTGGATTCGCGCTTT-3’(SEQ ID NO.21)；

CP的上游、下游的引物和探针序列分别是：

上游引物：CP-F：5’-ATACATAGGCATATAAAGCGACAC-3’(SEQ ID NO.11)；

下游引物：CP-R：5’-TGTTATCGACCCTACAACCCCA-3’(SEQ ID NO.12)；

探针：CP-P：5’-TCCCCTTTCGCTCGCCGCTA-3’(SEQ ID NO.22)；

MF的上游、下游的引物和探针序列分别是：

上游引物：MF-F：5’-CTATATATTCTAGCGATTGGA-3’(SEQ ID NO.13)；

下游引物：MF-R：5’-ATCAAGATTCAAGTCCGA-3’(SEQ ID NO.14)；

探针：MF-P：5’-TTTATTGCATCGCCACCT-3’(SEQ ID NO.23)；

FHV的上游、下游的引物和探针序列分别是：

上游引物：FHV-F：5’-GTCTGTTTCCCACTCGCAA-3’(SEQ ID NO.15)；

下游引物：FHV-R：5’-GTTCCTCGATATTCAAGGTTGT-3’(SEQ ID NO.16)；

探针：FHV-P：5’-TTCCACCAGGAGGTTCTCGT-3’(SEQ ID NO.24)。

(2)配制多重荧光定量PCR扩增体系：

根据表1和表2所示体系(由于PCR扩增容量限制，分为两个体系(体系1和体系2)进行扩增，当然，在容量允许的条件下，可在同一体系下进行扩增)配制多重荧光定量PCR扩增体系。

表1多重荧光定量PCR扩增体系1

表2多重荧光定量PCR扩增体系2

组分	含量
		PCR反应液	20μL
CP-F和CP-R	各0.36μL
		CP-P	0.30μL
MF-F和MF-R	各0.36μL
		MF-P	0.25μL
FHV-F和FHV-R	各0.36μL
		FHV-P	0.30μL
Feline-F和Feline-R	各0.36μL
		Feline-P	0.27μL
酶	1μL
		检测样品核酸	5μL

其中，在本实施例中，经过发明人测试得到最优的引物对和探针浓度组合，各引物对的浓度均为2μM，探针的浓度则根据病毒的种类各不相同，具体为：FPV探针浓度为1.5μM，CP探针浓度为1.6μM，FCV探针浓度为1.5μM，MF探针浓度为1.2μM，FIP探针浓度为1.4μM，FHV探针浓度为1.6μM，TOX探针浓度为1.5μM，Feline探针浓度为1.3μM。

待测样品核酸可使用常规的核酸提取试剂盒(根据样品类型使用DNA提取试剂盒，或使用RNA提取试剂盒提取RNA后进行反转录)进行提取获得，或采用核酸释放剂(由150mMTris、200mM KCl、15mM MgCl₂、0.001％SDS和5％蔗糖混合制得)进行提取。

PCR反应液为本领域常规的多重荧光PCR反应液，在本实施例中，其具体组分为：170mM Tris、100mM KCl、19mM MgCl₂、0.03％Triton-X100、5％甘油、2.5mM dNTP、30mM(NH₄)₂SO₄和0.2％DMSO。

酶采用本领域常规的多重荧光PCR适用酶种，在本实施例中，其具体为：2U/μL热启动Taq酶、25U/μL MMLV逆转录酶25mM Tris、30％甘油和1mM DTT。其中，热启动Taq酶在0.5～5U/μL浓度范围内以0.5U/μL梯度变化筛选得到最佳使用浓度，MMLV逆转录酶在5～50U/μL浓度范围内以2.5U/μL梯度变化筛选获得最佳使用浓度。

本实施例中的试剂盒还可以含有阳性质控品和阴性质控品。

在本实施例中，阳性质控品为：以FPV、CP、FCV、MF、FIP、FHV、TOX和Feline通用引物扩增标准菌株，然后利用上述实施例中的引物组PCR扩增获得目的片段，将8段目的片段运用多片段重组方式构建成质粒载体，从而获得阳性表达质粒。

在本实施例中，阴性质控品设置为双蒸水。

扩增程序为：40～50℃，5～15min；93～95℃，3～15min；93～95℃，15～35s，52～58℃，35～60s，40个循环。在本实施例中，扩增程序设置为：50℃，10min；94℃，5min；94℃，15s，60℃，30s，40个循环。

(3)样品中的病毒定性和定量分析：

根据扩增曲线对样品中的病毒进行定性和定量分析。

定性结果判断标准为：

阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；

可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于38.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于38.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；

阴性：检测不到样本Ct值或Ct值大于38。

定量检测的方法为：

使用阳性标准品作为阳性质控，并绘制标准曲线，根据检测样品扩增曲线中的Ct值计算样品中阳性质控品的浓度含量。

图1～2为本发明实施例中的多重荧光定量PCR检测试剂盒对猫病原体FPV、FCV、FIP、TOX、CP、MF、FHV以及Feline进行荧光定量PCR检测的扩增曲线，从图中可以看出，使用本实施例中制备的多重荧光定量PCR检测试剂盒可以同时检测出样品中的各猫病原体，并且对不同浓度的猫病原体(1.7×10⁵、1.7×10⁴、1.7×10³、1.7×10²copies/mL)均可以进行检测。

上述实施例中的检测试剂盒的检测效果评估

(1)特异性测试：

取FPV、CP、FCV、MF、FIP、FHV、TOX标准样品及1例犬细小病毒样本进行特异性测试。按照上述实施例中的检测方法(扩增体系和扩增程序均保持一致)进行检测。检测结果如图3～10所示。从结果中可以看出，FPV、CP、FCV、MF、FIP、FHV、TOX标准样品的特异性检测结果均为其对应检测项阳性，其他检测项为阴性，无非特异性扩增；犬细小病毒样本检测结果均为阴性。

(2)灵敏度检测：

用紫外分光光度计测定阳性质控品(制备方法同上述实施例)核酸浓度为2.8×10⁶copies/mL，用双蒸水对其进行10倍梯度稀释(稀释后的浓度分别为1.7×10⁵、1.7×10⁴、1.7×10³、1.7×10²和1.7×10¹copies/mL)，采用上述实施例中的检测方法(扩增体系和扩增程序均保持一致)进行检测。

检测结果如图11～18所示。图11～18分别为上述实施例中的检测方法检测FPV(图11)和CP(图12)中荧光FAM的灵敏度结果、检测FVC(图13)和MF(图14)中荧光VIC/HEX的灵敏度结果图、检测FIP(图15)和FHV(图16)中荧光ROX/TXR的灵敏度结果、TOX(图17)和Feline(图18)中CY5的灵敏度结果，图11～18中从左到右的样本浓度依次为1.7×10⁵、1.7×10⁴、1.7×10³、1.7×10²、1.7×10¹copies/mL，其中，可以发现，1.7×10¹copies/mL无扩增曲线。从而可以说明上述实施例中的检测方法对于猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体样品的检测灵敏度为：1.7×10²copies/mL。

上述实施例中的检测试剂盒的实际应用效果

为了验证上述实施例中的检测试剂盒是否可以实际应用于日常检测中，发明人选择了日常检测中的常见样品对上述实施例中的检测试剂盒进行检测试验。

在本实施例中，用于检测样品分别为粪便、肛拭子、结膜囊拭子及鼻咽拭子等，具体为：已知FPV感染猫粪便2例、CP细胞培养液1例、FCV感染咽拭子1例、MF细胞培养液1例、FIP感染水样便1例、FHV感染鼻咽拭子2例和TOX感染肛拭子1例。并以健康猫采集样本作为阴性对照。

具体检测步骤为：

(1)样品前处理：

粪便样品：取0.5g粪便于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL的EP管中，8000rpm离心2min，取上清200μL于1.5mL的EP管中，备用。水样便时，处理步骤为：取1mL水样便于EP管中，8000rpm离心2min，取上清200μL于1.5mL的EP管中。

其他液体样品：直接取200μL用于DNA/RNA提取。

(2)样品检测：

取上述处理好的样本，用核酸释放剂或核酸提取试剂盒进行核酸提取。将提取得到的待测样品核酸按照上述实施例中的检测方法(扩增体系保持一致)进行检测。

设置阴性对照和阳性对照(参考上述实施例中的阴性对照和阳性对照)，将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类，报告基团为FAM、VIC、TXR、CY5，淬灭基团选择none，扩增条件为50℃，10min；94℃，5min；94℃，15s，60℃，0s，40个循环。

结果如图19～26所示。结果显示，已知的FPV和CP阳性样本在FAM通道检测出S型曲线，已知的FCV和MF阳性样本在VIC通道检测出S型曲线，已知的FIP和FHV阳性样本在TXR通道检测出S型曲线，已知的TOX和Feline阳性样本在CY5通道检测出S型曲线；已知的健康猫采集样本、阴性对照组共计8例样本全为阴性。从而可以说明，本发明实施例中的引物组和探针组检测靶标的准确率达100％，具有很好的特异性，具有较好的应用效果。

实施例是对技术方案内容的细化和解释，或是最优化的技术方案，即给一个或几个具体的实施方案。实施例应尽量详细和具体，能按此再现发明技术，如原料的产地、名称、型号、操作程序、组成、配方、用途、效果、参数、条件、手段等都应尽可能的说明清楚。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州蔚捷生物医药科技有限公司

<120> 一种同时检测多种猫病原体的试剂盒及其检测方法与应用

<130>

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcacgaaag taactttaac acctcc 26

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgctagtagt tctctggcgg atag 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagactaaca catacatggc aa 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctccttcag attgaggc 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcgctaaatc attacctact ccc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caccaacaaa agagaaccca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttgctgttaa aatttgccat 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgtcaatac ggtgtcca 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aatagcgttt gtatataacc a 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttgcagcat taatcagt 18

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atacataggc atataaagcg acac 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgttatcgac cctacaaccc ca 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctatatattc tagcgattgg a 21

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atcaagattc aagtccga 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtctgtttcc cactcgcaa 19

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gttcctcgat attcaaggtt gt 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

actacacgac agctaaga 18

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aatagagcat tgggcttacc ac 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccaatatcaa accacgagcc at 22

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tctgattaaa cacgcattga ccac 24

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tatcaattgg attcgcgctt t 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tcccctttcg ctcgccgcta 20

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tttattgcat cgccacct 18

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttccaccagg aggttctcgt 20

Claims

1.同时检测多种猫病原体的多重荧光定量PCR引物组，其特征在于，所述猫病原体包括猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体；

所述引物组的核苷酸序列为：

猫内源基因引物对：

Feline-F：5’-AGCACGAAAGTAACTTTAACACCTCC-3’；

Feline-R：5’-TGCTAGTAGTTCTCTGGCGGATAG-3’；

猫瘟病毒引物对：

FPV-F：5’-TAGACTAACACATACATGGCAA-3’；

FPV-R：5’-GCTCCTTCAGATTGAGGC-3’；

猫杯状病毒引物对：

FCV-F：5’-TCGCTAAATCATTACCTACTCCC-3’；

FCV-R：5’-CACCAACAAAAGAGAACCCA-3’；

猫传染性腹膜炎病毒引物对：

FIP-F：5’-TTGCTGTTAAAATTTGCCAT-3’；

FIP-R：5’-TTGTCAATACGGTGTCCA-3’；

猫弓形虫引物对：

TOX-F：5’-AATAGCGTTTGTATATAACCA-3’；

TOX-R：5’-TTTGCAGCATTAATCAGT-3’；

猫衣原体引物对：

CP-F：5’-ATACATAGGCATATAAAGCGACAC-3’；

CP-R：5’-TGTTATCGACCCTACAACCCCA-3’；

猫支原体引物对：

MF-F：5’-CTATATATTCTAGCGATTGGA-3’；

MF-R：5’-ATCAAGATTCAAGTCCGA-3’；

猫疱疹病毒引物对：

FHV-F：5’-GTCTGTTTCCCACTCGCAA-3’；

FHV-R：5’-GTTCCTCGATATTCAAGGTTGT-3’。

2.同时检测多种猫病原体的多重荧光定量PCR探针组，其特征在于，所述猫病原体包括猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体；

所述探针组的核苷酸序列为：

猫内源基因探针：

Feline-P：5’-ACTACACGACAGCTAAGA-3’；

猫瘟病毒探针：

FPV-P：5’-AATAGAGCATTGGGCTTACCAC-3’；

猫杯状病毒探针：

FCV-P：5’-CCAATATCAAACCACGAGCCAT-3’；

猫传染性腹膜炎病毒探针：

FIP-P：5’-TCTGATTAAACACGCATTGACCAC-3’；

猫弓形虫探针：

TOX-P：5’-TATCAATTGGATTCGCGCTTT-3’；

猫衣原体探针：

CP-P：5’-TCCCCTTTCGCTCGCCGCTA-3’；

猫支原体探针：

MF-P：5’-TTTATTGCATCGCCACCT-3’；

猫疱疹病毒探针：

FHV-P：5’-TTCCACCAGGAGGTTCTCGT-3’；

或者为这些序列的核苷酸互补序列。

3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团；各探针序列标记的荧光基团和淬灭基团各不相同。

4.一种同时检测多种猫病原体的多重荧光定量PCR试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述的引物组和/或权利要求2或3所述的探针组。

5.权利要求4所述的多重荧光定量PCR试剂在制备猫病原体检测试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述猫病原体检测试剂盒中还包括核酸释放剂、PCR反应液、酶、阴性质控品和阳性质控品中的至少一种。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述猫病原体检测试剂盒的使用方法为：

(1)提取检测样品中的核酸；

(3)根据扩增曲线定性或定量样品中的猫病原体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的体系为：

和

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的程序为：40～50℃，5～15min；93～95℃，3～15min；93～95℃，15～35s；52～58℃，35～60s，40个循环。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述猫病原体包括猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫弓形虫、猫疱疹病毒、猫衣原体和猫支原体。