CN109593883B

CN109593883B - 猪圆环病毒多重实时荧光pcr检测引物对、探针、及制备的试剂盒

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Publication number: CN109593883B
Application number: CN201710939193.0A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 李向东; 孙明; 张超林
Original assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2017-09-30
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2037-09-30
Also published as: CN109593883A

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测引物对和探针以及含有该PCR引物对和探针的试剂盒。该PCR引物对和探针能特异性地、高灵敏度地检测PCV3病毒DNA样品，为猪圆环病毒3型感染的猪只进行早期预防提供依据。

Description

猪圆环病毒多重实时荧光PCR检测引物对、探针、及制备的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及多重实时荧光PCR检测，具体涉及猪圆环病毒3型、1型、和/或2型和多重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定而发现，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征，肺炎,猪皮炎和肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

然而，在一起猪的繁殖障碍病例中，分离到一株病毒基因组为2.0kb的圆环病毒，经后续试验证实，其与已知的圆环病毒无论是核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白具有＞70％的氨基酸序列的同源性，因此可以肯定这是一种新的猪圆环病毒。

目前检测PCV的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及PCR检测等。但这些常规方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。且临床上猪圆环病毒各基因型常呈混合感染状况，现有技术中针对猪圆环病毒的PCR检测主要是针对各型单一的检测，加之PCV2和PCV3在临床上发病症状及其相似，因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的鉴别检测方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供猪圆环病毒多重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒。

本发明的一个方面在于提供一种猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测引物对和探针，其中，所述引物对为序列为SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的上游引物和序列为SEQ IDNO.17所示核苷酸序列的下游引物，以及序列为SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的探针。

本发明的所述的猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测引物对和探针能特异性检测猪圆环病毒3型病毒，灵敏度高，其检测的DNA含量下限可达1×10^-7ng/μl，在特定条件下甚至可达1×10^-8ng/μl。

本发明的另一个方面在于提供一种猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测引物对和探针，其中，所述引物对为序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的上游引物和序列为SEQ IDNO.6所示核苷酸序列的下游引物，以及序列为SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的探针。

本发明的所述的猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测引物对和探针能特异性检测猪圆环病毒1型病毒，灵敏度高，其检测的DNA含量下限可达1×10^-6ng/μl，在特定条件下甚至可达1×10^-7ng/μl。

本发明的另一个方面在于提供一种猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测引物对和探针，其中，所述引物对为序列为SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的上游引物和序列为SEQ IDNO.10所示核苷酸序列的下游引物，以及序列为SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的探针。

本发明的所述的猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测引物对和探针能特异性检测猪圆环病毒2型病毒，灵敏度高，其检测的DNA含量下限可达1×10^-6ng/μl，在特定条件下甚至可达1×10^-7ng/μl。

本发明的另一个方面在于提供一种猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括所述的猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测引物对和探针。

由于本发明实时荧光PCR检测引物对和探针具有特异性强、敏感性高的特点，包含本发明引物对的试剂盒灵敏、便捷、特异性强、敏感性高、可靠性好，只需一次检测变能判定样本是否含有PCV1、PCV2、PCV3或共同感染，可以同时进行大批量的样本分析，为猪圆环病毒疫情的监测、防控提供有力的技术支持，有很好的应用前景。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

猪圆环病毒3型为基因组2.0kb的圆环病毒，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，是一种新的猪圆环病毒，其能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

本发明的一个方面涉及一种猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测引物对和探针，其中，所述引物对为序列为SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的上游引物和序列为SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的下游引物，以及序列为SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的探针。

本发明还涉及一种猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测引物对和探针，其中，所述引物对为序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的上游引物和序列为SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的下游引物，以及序列为SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的探针。

本发明还涉及一种猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测引物对和探针，其中，所述引物对为序列为SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的上游引物和序列为SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的下游引物，以及序列为SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的探针。

本发明的另一方面涉及一种猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括所述的猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测引物对和探针，所述引物对为序列为SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的上游引物和序列为SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的下游引物，以及序列为SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的探针。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括所述的猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测引物对和探针和/或所述的猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测引物对和探针；以及所述两种或三种探针分别使用不同检测通道的荧光素标记。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液由TaqDNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT和甘油组成，Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT和甘油含量分别为0.5U/μl、20mM、0.1mM、50％V/V。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由所述猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测引物对和探针、反应缓冲液、dDTPs和ddH₂O按6:10:5:19的体积比混合组成。

作为本发明的一种优选实施方式，所述引物对浓度为10μM，探针浓度为5μM，所述反应缓冲液为5×Tris-HCl(pH8.3)，dDTPs浓度为2.5mM。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括提取待测样品DNA模板的试剂。

作为本发明的一种优选实施方式，所述待测样品DNA模板浓度≥1×10^-7ng/μl。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒使用的PCR反应体系为50μl，由酶混合液5μl、PCR反应液40μl和待测DNA模板5μl组成。

本发明还提供一种猪圆环病毒多重实时荧光PCR扩增反应程序：95℃2min；40个循环，每个循环为95℃15sec，60℃30sec；每个循环的第二步(60℃60sec)收集荧光信号。

上述试剂盒的多种探针分别使用不同检测通道的荧光素标记，所述荧光素选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5中的一种。

本发明还涉及试剂盒在同时检测PCV1、PCV2和PCV3的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，且不同探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自FAM(羧基荧光素)、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

本发明还涉及一种利用上述引物对和探针同时检测PCV1、PCV2和PCV3的多重实时荧光PCR方法，包括：

针对猪圆环病毒ORF2基因设计的能鉴别PCV1、PCV2和PCV3的特异性引物和探针序列；用荧光素标记的PCV1的探针，通过不同检测通道检测的另一种荧光素标记的PCV2的探针，以及通过第三个检测通道检测的第三种荧光素标记的PCV3的探针；其中的探针用任意一种荧光素标记，且三种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5；将用于检测PCV1、PCV2或PCV3的引物和探针序列，或用于鉴别PCV1、PCV2与PCV3的引物和探针序列，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。

多重实验即在一个反应管中通过扩增多个靶标进行定量实验，在一个反应管中，任何一个靶标的扩增都能影响其他靶标的扩增，所以要进行周密的实验设计和反应条件的优化，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。多重荧光PCR实验普遍存在的问题是扩增样本中浓度明显差异的所有靶标，在同一反应管中扩增时，如果出现一种基因扩增效率高于另一种基因时，其中一种基因的扩增可能受到抑制，最终导致样本中两种基因的扩增效率不一致。本发明通过引物和探针的设计，反应条件的优化，使样本中三种基因的扩增效率一致，与每个单重反应的灵敏度是一致的。

本发明因充分运用了PCR技术的高效扩增性、核苷酸杂交技术的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对同一个样本进行一次检测操作即可完成PCV1、PCV2和PCV3的鉴别检测，可以确定样本是PCV1感染，或者是PCV2感染，或者是PCV3感染，或者是共同感染。具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、降低检测成本、提高检测效率的优点。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

荧光素介绍：

一般仪器FAM对应1通道，VIC、HEX、JOE对应2通道，NED、TAMRA对应3通道，CY3、ROX对应4通道，CY5对应5通道。

FAM：羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，广泛存在于荧光标记试剂盒，也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em＝492/518nm(pH＝9.0)，具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。

VIC：绿色荧光蛋白，Greenfluorescent protein，GFP，是源于海洋生物多管水母属(Aequoria Victoria)的一种发光蛋白。

HEX：六氯荧光素，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em＝535/556nm。

JOE：羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素，Carboxy-4',5'-dichloro-2'，JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。

TAMRA：全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的。

ROX：5-和6-羧基-X-罗丹明，校正染料。

Cy3或Cy5，Modification，是新的荧光分子，具有较好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率。它们的激发光谱和发射光谱峰值分别为548/562nm与646/664nm。Cy3和Cy5的分子结构和分子量都非常相似，但两者之间的光谱却分得很开，因此，Cy3和Cy5常被用于很多双色实验中，如被广泛应用于基因芯片和蛋白质芯片领域。

NED：2’-氯-5’-氟-7’，8’-苯-1,4-二氯-6-羧基荧光素。

以上荧光素检测时所对应的检测通道是本发明在实验过程中所用FTC-3000仪器所对应的检测通道，本领域技术人员在重复本发明的过程中，所用仪器不同有可能荧光素所对应的通道不同，同时两种或多种荧光素在使用第一种仪器时所对应的检测通道是不同的，在使用第二种仪器时所对应的检测通道有可能是相同的。本发明的宗旨是，无论使用哪种仪器来重复本发明，只要在使用同一种仪器时，用于标记猪圆环病毒1型、2型和3型的探针的荧光素在不同的检测通道就可以实现本发明。

实施例1猪圆环病毒3型的分离鉴定

1、病料来源

在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加9.4％，受孕率降低了1.2％，木乃伊胎增加8.2％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现出厌食，呈多灶性丘疹，斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2感染引起流产的症状一致。虽然在母猪中观察到的总体临床表现以及流产症状与猪圆环病毒2型导致的繁殖障碍疾病一致，但所有母猪的不同组织，包括肾、淋巴结、肺、皮肤以及死胎，通过免疫组化和定量PCR对PCV2、PRRSV、PPV、CSFV、猪肺炎支原体检测均为阴性。为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。

2、病毒株的分离与培养

将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液，组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液，上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤，滤液在PK15细胞上传代，37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，置于37℃培养5日。收获病毒，经2次冻融后，收获含病毒的培养液。

3、PCR及测序分析鉴定病毒种属

取以上步骤的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用圆环病毒种属特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR扩增出2000bp目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列和氨基酸序列同已经报道过的其他圆环病毒的同源性都少于50％，而根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白具有＞70％的氨基酸序列的同源性，因此可以肯定，它是一种新的猪圆环病毒，也是目前猪体上发现的第三种圆环病毒。

实施例2猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法特异性引物和探针筛选

1、猪圆环病毒的引物与探针设计

猪圆环病毒PCV1、PCV2和PCV3的特异性引物，指的是：长度20个碱基左右的寡核苷酸链，猪圆环病毒ORF2基因高度保守的特异性核苷酸片段；

猪圆环病毒PCV1、PCV2和PCV3的特异性探针，指的是：长度为13到30个碱基之间的寡核苷酸链，其5’端标记FAM、HEX或NED等荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团。

发明人设计针对猪圆环病毒PCV1、PCV2和PCV3的多个实时荧光PCR扩增引物和TaqMan探针，引物对与探针的具体序列见序列表，各序列对应的名称、标号见表1：

表1用于猪圆环病毒1型、2型和3型三重实时荧光筛选的引物和探针

2、猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的反应体系及条件

猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的反应体系见表2，反应条件见表3。

表2猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的反应体系

组分	体积(μl)
		5U/μl Taq DNA聚合酶	2
5×反应缓冲液	10
		2.5mM dNTPs	5
上游引物10μΜ	2
		下游引物10μΜ	2
荧光探针5μΜ	2
		DNA模板	5
ddH<sub>2</sub>O	22

表3猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的反应条件

3、结果判定

(1)结果分析条件设定

(2)读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，以显示结果为准。

(3)结果描述及鉴定

对比不同引物对与探针组合的扩增情况，遵循特异性原则，敏感性原则和最高扩增原则，选定特异性好，敏感性高，可靠性好的猪圆环病毒1型、2型和3型检测用引物对与探针最佳组合。

4、筛选试验方法与结果

引物与探针的优化筛选方法如下：

任意选择一对引物与一条探针进行组合(如引物对PCV1-F1/PCV1-R1，加上探针PCV1-P；引物对PCV1-F2/PCV1-R2，加上探针PCV1-P；引物对PCV2-F1/PCV2-R1，加上探针PCV2-P；引物对PCV3-F1/PCV3-R1，加上探针PCV3-P；等等)，以能同时获得最小的Ct值和最高的扩增效率为筛选标准，选出最佳引物与探针组合。

通过多次重复、对比试验，选定猪圆环病毒1型、2型和3型检测用引物对与探针的最佳组合，具体序列见表4。

表4猪圆环病毒1型、2型和3型检测用引物对与探针的最佳组合物序列

实施例3猪圆环病毒多重实时荧光PCR检测方法的优化

1、猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的引物与探针设计

猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的引物与探针设计参见实施例2，具体序列见表4。

2、猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的反应体系

猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。

商品化5U/μl Taq酶在50μl反应体系中一般添加2μl，终浓度为0.2U/μl，本实施例在进一步降低Taq酶终浓度的条件下，通过制备特定的酶混合液，来实现试剂盒检测条件的进一步优化，大大提高了敏感性和特异性。经过优化，猪圆环病毒多重实时荧光PCR方法的反应体系见表5。酶混合液在50μl反应体系中一般添加5μl，终浓度为0.05U/μl。

表5优化后的猪圆环病毒多重实时荧光PCR反应体系

3、结果判定

(1)结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。

(2)质控标准

阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；

阳性对照的Ct值应≤30，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。

(3)结果描述及判定

阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无猪圆环病毒1型、2型或3型。

阳性样本Ct值≤30，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有猪圆环病毒1型、2型或3型。

有效原则：样本Ct值在30＜Ct＜37之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct＜37时样品为阳性，否则为阴性。

(4)样品检测试验及结果

试验对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)进行扩增，结果只有猪圆环病毒1型、2型和3型得到特异性的荧光扩增曲线。

实施例4PCR检测试剂盒敏感性和特异性比较试验

以实施例2筛选的PCV1、PCV2、PCV3最佳引物对、探针组合，按照实施例2条件优化前组分组装PCV1、PCV2、PCV3三重实时荧光PCR试剂盒1，实施例3条件优化后组分组装PCV1、PCV2、PCV3三重实时荧光PCR试剂盒2。比较两个试剂盒的敏感性和特异性。

将实施例1提取的PCV3DNA连续10倍稀释后，试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件进行PCR敏感性试验,同时用核酸蛋白测定仪测定所有的DNA模板量。

DNA模板浓度分别为1×10^-10ng/μl、1×10^-9ng/μl、1×10^-8ng/μl、1×10^-7ng/μl、1×10^-6ng/μl、1×10^-5ng/μl、1×10^-4ng/μl、1×10^-3ng/μl、1×10^-2ng/μl、1×10^-1ng/μl。结果显示，试剂盒1敏感度最低可达1×10^-7ng/μl，试剂盒2敏感度最低可达1×10^-8ng/μl。表明，本发明筛选的引物具有很高的敏感性，条件优化后进一步提高了试剂盒的敏感性。

将PCV1DNA连续10倍稀释后，试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件进行PCR敏感性试验,同时用核酸蛋白测定仪测定所有的DNA模板量。

DNA模板浓度分别为1×10^-10ng/μl、1×10^-9ng/μl、1×10^-8ng/μl、1×10^-7ng/μl、1×10^-6ng/μl、1×10^-5ng/μl、1×10^-4ng/μl、1×10^-3ng/μl、1×10^-2ng/μl、1×10^-1ng/μl。结果显示，试剂盒1敏感度最低可达1×10^-6ng/μl，试剂盒2敏感度最低可达1×10^-7ng/μl。表明，本发明筛选的引物具有很高的敏感性，条件优化后进一步提高了试剂盒的敏感性。

将PCV2DNA连续10倍稀释后，试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件进行PCR敏感性试验,同时用核酸蛋白测定仪测定所有的DNA模板量。

使用试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件对猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪副流感病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪圆环病毒阴性猪肺脏、淋巴结、扁桃体进行特异性试验，结果显示，猪圆环病毒1型检测结果为阴性，猪圆环病毒2型检测结果为阴性、猪圆环病毒3型检测结果为阴性。实验结果证实，本申请的试剂盒具有相当高的特异性。

实施例5疑似PCV病料样品检测比较

取采自不同地区临床发病猪场的疑似病猪的组织样品，包括猪脑组织5份、扁桃体6份、肺脏12份、肾脏5份、淋巴结6份、脾脏6份、流产胎儿5份，使用试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件进行PCV野毒检测。检测结果见表6。

表6临床疑似PCV感染猪样品的检测

结果表明，在45份病料中，试剂盒1检出5份PCV1阳性病料，检出率为11.1％；试剂盒1检出17份PCV2阳性病料，检出率为37.8％；试剂盒1检出22份PCV3阳性病料，检出率为48.9％；试剂盒2同样能检出试剂盒1所检出的阳性病料，二者符合率达100％；试剂盒2检出15份PCV1阳性病料，检出率为33.3％，比试剂盒1的检出率高22.2％；试剂盒2检出27份PCV2阳性病料，检出率为60.0％，比试剂盒1的检出率高22.2％；试剂盒2检出33份PCV3阳性病料，检出率为73.3％，比试剂盒1的检出率高24.4％；试剂盒2检出阳性而试剂盒1未检出的病料多为脑、脾脏和肾脏等病毒含量较少的组织。条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1，能检测出病毒含量较低的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。

实施例6试剂盒的临床应用

以实施例2设计的部分引物对与探针组合(PCV1-F1/PCV1-R1，加上PCV1-P；PCV2-F2/PCV2-R2，加上PCV2-P；PCV3-F3/PCV3-R3，加上PCV3-P)，按照实施例2条件优化前组分组装PCV1、PCV2、PCV3三重实时荧光PCR试剂盒3、试剂盒4。

抽样采自不同地区未发生临床症状猪场的样品，包括鼻拭子16份、血清28份，使用试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4分别按照优化前条件进行PCV野毒检测，同时，使用试剂盒2按照优化后条件进行PCV野毒检测复核。检测结果见表7、8、9。

表7试剂盒临床应用PCV1检测结果

结果表明，在44份病料中，试剂盒1检出20份PCV1阳性样品，检出率为45.5％；试剂盒3检出6份PCV1阳性样品，检出率为13.6％；试剂盒4检出11份PCV1阳性样品，检出率为25.0％；试剂盒2同样能检出试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4所检出的阳性病料，符合率达100％；试剂盒2检出29份PCV1阳性病料，检出率为65.9％，比试剂盒1的检出率高20.4％，比试剂盒3的检出率高52.3％，比试剂盒4的检出率高40.9％，。条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4，能检测出病毒含量较低的样品，而同样对于阴性样品均不能检测出。

表8试剂盒临床应用PCV2检测结果

结果表明，在44份病料中，试剂盒1检出20份PCV2阳性样品，检出率为45.5％；试剂盒3检出5份PCV2阳性样品，检出率为11.4％；试剂盒4检出11份PCV2阳性样品，检出率为25.0％；试剂盒2同样能检出试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4所检出的阳性病料，符合率达100％；试剂盒2检出29份PCV2阳性病料，检出率为65.9％，比试剂盒1的检出率高20.4％，比试剂盒3的检出率高54.5％，比试剂盒4的检出率高40.9％，。条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4，能检测出病毒含量较低的样品，而同样对于阴性样品均不能检测出。

表9试剂盒临床应用PCV3检测结果

结果表明，在44份病料中，试剂盒1检出25份PCV3阳性样品，检出率为56.8％；试剂盒3检出9份PCV3阳性样品，检出率为20.5％；试剂盒4检出14份PCV3阳性样品，检出率为31.8％；试剂盒2同样能检出试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4所检出的阳性病料，符合率达100％；试剂盒2检出35份PCV3阳性病料，检出率为79.5％，比试剂盒1的检出率高22.7％，比试剂盒3的检出率高59.0％，比试剂盒4的检出率高47.7％，。条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4，能检测出病毒含量较低的样品，而同样对于阴性样品均不能检测出。

实施例7早期感染检测试验

用28～30日龄经ELISA检测PCV1、PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪25头随机分成五组，5头/组，第1组用PCV3SG株(含10^3.0TCID₅₀/头)攻毒，第2组用PCV3SG株(含10^5.0TCID₅₀/头)攻毒，第3组用PCV2HH3株(含10^3.0TCID₅₀/头)攻毒，第4组用PCV2HH3株(含10^5.0TCID₅₀/头)攻毒，肌肉注射，第5组空白对照组接种DMEM培养基，各仔猪隔离饲养。攻毒后连续观察各组仔猪临床症状，功毒后第2天开始每天进行采血进行病毒检测，具体结果见表10、表11。

表10早期感染试验临床症状

结果显示，第1组、第3组低剂量攻毒组所有猪只无异常临床症状，第2组、第4组高剂量攻毒组所有猪只均出现3～5日持续性40.5℃以上高温，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓，而第5组空白对照组无异常。

表11早期感染试验病毒检测阳性时间

结果显示，第2组、第4组高剂量攻毒组全组猪只呈发病状态，所有试剂盒在第2天或第3天均能检测到阳性；第1组低剂量攻毒组虽然无异常临床症状，但本发明条件优化后试剂盒2在第3天即能检测到阳性，而条件优化前试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4则分别在第5天到第11天不等时间点检测到阳性；第3组低剂量攻毒组虽然无异常临床症状，但本发明条件优化后试剂盒2在第3天即能检测到阳性，而条件优化前试剂盒1、试剂盒3、试剂盒4则分别在第6天到第12天不等时间点检测到阳性；第5组空白对照组所有试剂盒检测均呈阴性；第1组、第2组所有阳性检测结果进一步测序显示与本发明攻毒用毒株SG株基因序列一致；第3组、第4组所有阳性检测结果进一步测序显示与本发明攻毒用毒株HH3株基因序列一致。

说明，本发明检测试剂盒具有较高的敏感性，在早期感染情况下能较早进行检测，为猪圆环病毒感染进行早期预防。

实施例8猪圆环病毒双重实时荧光PCR试剂盒的临床应用

以实施例2筛选的PCV1、PCV2、PCV3最佳引物对、探针组合，按照实施例3条件优化后组分组装PCV1、PCV3双重实时荧光PCR试剂盒5、PCV2、PCV3双重实时荧光PCR试剂盒6。

将实施例6临床应用样品用试剂盒5、试剂盒6进行符合。检测结果见表12。

表12猪圆环病毒双重实时荧光PCR试剂盒的临床应用结果

结果表明，在44份病料中，试剂盒5检出29份PCV1阳性样品，检出率为65.9％；试剂盒5检出35份PCV3阳性样品，检出率为79.5％；试剂盒6检出29份PCV2阳性样品，检出率为65.9％；试剂盒6检出35份PCV3阳性样品，检出率为79.5％；试剂盒5和试剂盒6检测的PCV3阳性样品一致，符合率达100％；试剂盒5和试剂盒6检测结果与试剂盒2检测结果一致，符合率达100％。

实施例9猪圆环病毒3型实时荧光PCR试剂盒的临床应用

以实施例2筛选的PCV3最佳引物对、探针组合，按照实施例3条件优化后组分组装PCV3实时荧光PCR试剂盒7。

将实施例6临床样品用试剂盒7进行复核。检测结果见表13。

表13猪圆环病毒3型实时荧光PCR试剂盒的临床应用结果

结果表明，在44份病料中，试剂盒7检出35份PCV3阳性样品，检出率为79.5％；试剂盒7检测结果与试剂盒2、试剂盒5、试剂盒6检测结果一致，符合率达100％。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司

<120> 猪圆环病毒多重实时荧光PCR检测引物对、探针、及制备的试剂盒

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> PCV1

<400> 1

tgaagtacct ggagtggtag gtaaa 25

<210> 2

<211> 20

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<211> 20

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<211> 25

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

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<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> PCV1

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<210> 7

<211> 20

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<213> PCV2

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<211> 22

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

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<400> 11

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<210> 12

<211> 22

<212> DNA

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<400> 12

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<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> PCV3

<400> 13

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<211> 20

<212> DNA

<213> PCV3

<400> 14

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<210> 15

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<212> DNA

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<400> 15

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<210> 16

<211> 25

<212> DNA

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<400> 16

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<210> 17

<211> 20

<212> DNA

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<400> 17

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<210> 18

<211> 20

<212> DNA

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<210> 19

<211> 20

<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 20

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<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> PCV3

<400> 21

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Claims

1.一种猪圆环病毒实时荧光PCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括猪圆环病毒3型、1型和2型的实时荧光PCR检测引物对和探针；

所述猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测引物对为如SEQ ID NO.14所示的上游引物和如SEQ ID NO.17所示的下游引物，所述猪圆环病毒3型实时荧光PCR探针如SEQ ID NO.21所示；

所述猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测引物对为如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.6所示的下游引物，所述猪圆环病毒1型实时荧光PCR探针如SEQ ID NO.19所示；

所述猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测引物对为如SEQ ID NO.7所示的上游引物和如SEQ ID NO.10所示的下游引物，所述猪圆环病毒2型实时荧光PCR探针如SEQ ID NO.20所示；

三种探针分别使用不同检测通道的荧光素标记；

其中，所述试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液由Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT和甘油组成，Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT和甘油含量分别为0.5U/μl、20mM、0.1mM、50%V/V；

所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由所述猪圆环病毒3型、1型和2型的实时荧光PCR检测引物对和探针、反应缓冲液、dNTPs和ddH2O按6:10:5:19的体积比混合组成；

所述试剂盒使用的PCR反应体系为50μl，由酶混合液5μl、PCR反应液40μl和待测DNA模板5μl组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述引物对浓度为10μM，探针浓度为5μM，所述反应缓冲液为pH8.3的5×Tris-HCl，所述dNTPs浓度为2.5mM。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求1 所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括提取待测样品DNA模板的试剂。