CN111926116A

CN111926116A - 快速定量检测鸭腺病毒4型的引物和探针及其检测方法与应用

Info

Publication number: CN111926116A
Application number: CN202010805077.1A
Authority: CN
Inventors: 黄允真; 张俊勤; 孙敏华; 董嘉文; 李林林; 张建峰
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2020-11-13

Abstract

本发明公开了快速定量检测鸭腺病毒4型的引物和探针及其检测方法与应用。所述引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。本发明首次建立了一种可快速定量检测临床样品中鸭腺病毒4型的荧光PCR方法，该检测方法操作简单，全部操作过程不超过3小时，并且灵敏度高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行定量分析，有利于在临床实践中推广应用。

Description

快速定量检测鸭腺病毒4型的引物和探针及其检测方法与应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及快速定量检测鸭腺病毒4型的引物和探针及其检测方法与应用。

背景技术

近年来，随着水禽养殖业的迅速发展，鸭群中腺病毒的感染数量日益增多，而且随着商品肉蛋鸭呈规模化、集约化、密闭化的快速发展，鸭饲养管理水平却相对落后，饲养者生物安全意识低，许多养殖场距离较近以及存在混养现象，使得各种病原体在不同宿主之间出现了交叉传播，造成鸭的病情呈现复杂多样化。其中，鸭源禽腺病毒有较高的检出率，严重影响生产，引起社会的重视。

禽腺病毒感染主要以包涵体肝炎和心包积液为特征，据调查，鸭腺病毒分为4个基因型，包括鸭腺病毒1型(duck adenovirus 1)、鸭腺病毒2型(duck adenovirus 2)、鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3)和鸭腺病毒4型(duck adenovirus 4，DAdV-4)。其中，在2019年，研究人员从患有输卵管炎症的病死麻鸭中分离出了一株腺病毒，通过测序分析发现其为先前未见报道的新型鸭腺病毒，并将其暂命名为鸭腺病毒4型。

目前检测鸭腺病毒1、2、3型病原的方法主要有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、普通PCR以及荧光定量PCR等。但现仍未有针对鸭腺病毒4型的检测方法。且目前对于该病毒在田间的流行情况尚未有明确信息，因此，提供一种可有效、快速的检测临床样品中鸭腺病毒4型的方法对该新发疫病的监测预防具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的引物；

本发明的另一目的在于提供一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的探针；

本发明的另一目的在于提供一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的试剂盒；

本发明的另一目的在于提供一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的方法；

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒在制备检测鸭腺病毒4型制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的引物，该引物的核苷酸序列如下所示：

引物F：5’-GATGGTTTCGTAGGGTAC-3’(SEQ ID NO.1)；

引物R：5’-GGCTATTACTGGCTCAAC-3’(SEQ ID NO.2)。

根据鸭腺病毒4型基因序列(GenBank登录号：MN733730)进行引物设计。选择病毒的DNA polymerase基因作为引物设计目标基因，原因是DNA polymerase基因在腺病毒种内高度保守，保证了检测方法的灵敏度；选择的位点通过鸭腺病毒4型的DNApolymerase基因与同属其他腺病毒进行比对，选择鸭腺病毒4型特异性区域作为引物设计的位点，保证了检测方法的特异性。然后经过筛选后，筛选出灵敏度高和特异性强的引物F/R。

本专利具体到：

本发明的第二个方面，提供：

一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的探针，该探针的核苷酸序列如下所示：

探针P：5’-ATGACGACCTTCCAGTAGAGCCT-3’(SEQ ID NO.3)。

根据鸭腺病毒4型基因序列(GenBank登录号：MN733730)进行探针设计。经过筛选后，筛选出探针P。

进一步地，上述探针的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团。

更进一步地，上述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的至少一种，上述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中的至少一种。

更进一步地，上述荧光淬灭基团BHQ包括Eclipse。

当然，可以根据实际需求，合理的选择其他本领域可替代的荧光报告基团和荧光淬灭基团。

本发明的第三个方面，提供：

一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物和上述的探针。

进一步地，上述试剂盒还包括阳性标准品质粒。

所述阳性标准品质粒的制备方法为：

提取鸭腺病毒4型病毒液核酸，并以引物P1：5'-ACCATGAAGCGGACAAATAC-3'(SEQID NO.4)和引物P2：5'-GGCTATTACTGGCTCAAC-3'(SEQ ID NO.6)为扩增引物进行PCR扩增。回收并纯化扩增后的产物，克隆至PMD18T-Vector构建p-DAdV4质粒，即为阳性标准品质粒。

对于上述阳性标准品质粒可进一步测序以确认片段已正确插入载体。

本发明的第四个方面，提供：

一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的方法，包括以下步骤：

(1)从样品中提取病毒DNA；

(2)以步骤(1)提取的病毒DNA为模板，以阳性标准品质粒作为阳性对照，采用如权利要求1所述的引物和权利要求2-4任一所述的探针进行PCR扩增反应获得扩增产物；

(3)PCR反应结束后，将样品的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到样品中鸭腺病毒4型DNA拷贝数。

进一步地，上述步骤(2)中的PCR扩增反应体系为：

进一步地，上述步骤(2)中的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸20s；循环45次。

本发明的第五个方面，提供：

上述试剂盒在制备检测鸭腺病毒4型制剂中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明针对鸭腺病毒4型基因序列进行引物和探针设计，设计得到的引物和探针灵敏度高，以不同拷贝数的标准品质粒pDAdV-4为模板进行荧光PCR，最低可检测到的重组质粒的最低拷贝数为5.96个拷贝；

2.本发明设计得到的引物和探针特异性强，对于鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭腺病毒1型(DAdV-1)、鸭腺病毒3型(DAdV-3)核酸都未有扩增现象，不会出现假阳性；

3.本发明中的检测方法操作简单，全部操作过程不超过3小时，并且灵敏度高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行定量分析，有利于在临床实践中推广应用。

附图说明

图1为标准品质粒pDAdV-4在稀释为5.96×100-5.96×10⁷copies/μL在本发明的荧光定量PCR反应体系中的扩增曲线图；

图2为阳性标准品质粒pDAdV-4在稀释为5.96×100-5.96×10⁷copies/μL在本发明的荧光定量PCR反应体系中的标准曲线；

图3为DAdV-4、鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭腺病毒1型(DAdV-1)、鸭腺病毒3型(DAdV-3)本发明的荧光定量PCR反应体系中的扩增曲线图(仅存在DAdV-4的扩增曲线，其他未出现扩增，因此无扩增曲线)；

图4为10份疑似感染鸭腺病毒的鸭肝脏样品的扩增曲线。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

试剂与仪器

qPCR Probe Master Mix(购自南京诺唯赞，Cat No.Q112-02)。

本申请中所用的试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均为无DNA酶污染的容器分装。

荧光定量PCR仪为LightCycler96，紫外分光光度计为BioTek。

引物设计

根据鸭腺病毒4型基因序列(GenBank登录号：MN733730)进行引物设计。选择病毒的DNA polymerase基因作为引物设计目标基因，原因是DNA polymerase基因在腺病毒种内高度保守，保证了检测方法的灵敏度；选择的位点通过鸭腺病毒4型的DNA polymerase基因与同属其他腺病毒进行比对，选择鸭腺病毒4型特异性区域作为引物设计的位点，保证了检测方法的特异性。然后经过筛选后，筛选了灵敏度高和特异性强的引物F/R及探针P，其碱基序列如下所示。

引物F：5'-GATGGTTTCGTAGGGTAC-3'(SEQ ID NO.1)；

引物R：5'-GGCTATTACTGGCTCAAC-3'(SEQ ID NO.2)；

所述探针P的核苷酸序列：5'-ATGACGACCTTCCAGTAGAGCCT-3'(SEQ ID NO.3)，其中，所述探针的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团。

荧光报告基团可以为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的至少一种，荧光淬灭基团可以为TAMRA、MGB、BHQ中的至少一种。其中，荧光淬灭基团BHQ包括Eclipse。

本发明实施例试验中所采用的荧光报告基团为FAM；所采用的荧光淬灭基团为Eclipse。

标准阳性样品的制备

用测序确定鸭腺病毒4型的病毒液提取核酸，并以引物P1：5'-ACCATGAAGCGGACAAATAC-3'(SEQ ID NO.4)和引物P2：5'-GGCTATTACTGGCTCAAC-3'(SEQ ID NO.5)为扩增引物进行PCR扩增。回收纯化扩增的产物，克隆至PMD18T-Vector构建阳性标准品质粒p-DAdV4，再进一步测序确认片段已正确插入载体，提取质粒并测定浓度和纯度。

PCR检测

荧光定量PCR反应体系和反应条件

反应体系如表1所示，反应条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸20s；循环45次。

表1 荧光定量PCR反应体系

标准曲线的建立和灵敏度试验

将上述标准阳性样品的制备步骤中测定浓度后的阳性标准品质粒pDAdV-4分别做10倍的倍比稀释，得到5.96×100至5.96×10⁷copies/μL共8个稀释度的标准品质粒作为模板，每个模板浓度做2个平行样。

在上述荧光定量PCR反应体系和反应条件下进行TaqMan探针荧光定量PCR扩增，获得荧光扩增曲线。通过扩增曲线来确定能检测到重组质粒的最低拷贝数，并以Ct值为横坐标，拷贝数对数为纵坐标，建立标准曲线，对整个荧光定量PCR体系的灵敏度进行评价，扩增曲线图1所示，标准曲线如图4所示。

结果显示，阳性标准品质粒pDAdV-4在稀释为5.96×100至5.96×10⁷copies/μL和在上述荧光定量PCR反应体系中能获得扩增曲线，如图1所示，并且标准曲线在5.96×100至5.96×10⁷copies/μL范围内具有良好的线性关系，线性方程为：

y＝-0.3006x+12.303

R²＝0.9993，绘制标准曲线(图2)。

以不同拷贝数的阳性标准品质粒pDAdV-4为模板进行荧光PCR结果显示该反应体系的扩增曲线呈现典型的S型，且分布均匀，重复性好。最低可检测到的重组质粒的最低拷贝数为5.96个拷贝。表明本发明检测方法所建立的标准曲线线性好、检测的重复性好、灵敏度高。

特异性检测

分别提取鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭腺病毒1型(DAdV-1)、鸭腺病毒3型(DAdV-3)的核酸，将上述病毒的核酸作为PCR模板，水作阴性对照，DAdV-4的核酸作为阳性对照，在上述荧光定量PCR反应体系和反应条件下进行TaqMan探针荧光PCR扩增。

结果显示，只有以DAdV-4的核酸为模板才能获得扩增曲线，扩增曲线如图3所示，而MPV、GPV、DPV、DuCV、DAdV-1、DAdV-3核酸都没有获得扩增曲线。实验结果表明，本发明检测方法有良好的特异性。

临床样品检测

取10份疑似感染鸭腺病毒的鸭肝脏提取核酸，以提取的样品DNA为模板，DAdV-4的核酸作为阳性对照，健康鸭肝脏组织提取的核酸作为阴性对照，在上述荧光定量PCR反应体系和反应条件下进行TaqMan探针荧光PCR扩增。扩增曲线如图3所示，检测结果如表2所示。

表2 10份疑似感染鸭腺病毒的鸭肝脏样品的检测结果

样品编号	使用本发明方法检测结果	双向测序验证结果
			1	无扩增	DAdV-4阴性
2	无扩增	DAdV-4阴性
			3	扩增	DAdV-4阳性
4	无扩增	DAdV-4阴性
			5	无扩增	DAdV-4阴性
6	扩增	DAdV-4阳性
			7	扩增	DAdV-4阳性
8	无扩增	DAdV-4阴性
			9	无扩增	DAdV-4阴性
10	无扩增	DAdV-4阴性

结果显示，10份临床样品中共有3份检测出DAdV-4核酸阳性。

将3份阳性以P1和P2为引物进行普通PCR扩增，并将PCR产物送至上海生物技术工程有限公司进行双向测序，测序结果表明3份样品均为DAdV-4阳性，与本发明的检测方法结果一致。说明本发明的检测准确度高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 快速定量检测鸭腺病毒4型的引物和探针及其检测方法与应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatggtttcg tagggtac 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggctattact ggctcaac 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgacgacct tccagtagag cct 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accatgaagc ggacaaatac 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggctattact ggctcaac 18

Claims

1.一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下所示：

引物F：5’-GATGGTTTCGTAGGGTAC-3’；

引物R：5’-GGCTATTACTGGCTCAAC-3’。

2.一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如下所示：

探针P：5’-ATGACGACCTTCCAGTAGAGCCT-3’。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的至少一种，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中的至少一种。

5.一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和权利要求2至4任一所述的探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准品质粒。

7.一种用于快速定量检测鸭腺病毒4型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从样品中提取病毒DNA；

(2)以步骤(1)提取的病毒DNA为模板，以阳性标准品质粒作为阳性对照，采用如权利要求1所述的引物和权利要求2至4任一所述的探针进行PCR扩增反应获得扩增产物；

(3)PCR扩增反应结束后，将样品的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到样品中鸭腺病毒4型DNA拷贝数。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的PCR扩增反应体系为：

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸20s；循环45次。

10.权利要求5或6所述的试剂盒在制备检测鸭腺病毒4型的制剂中的应用。