CN111778360B - 一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针 - Google Patents

一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针，所述引物序列为：上游引物DuCV‑F：5’‑GAGTTCTGCACGCTCGACAA‑3’，下游引物DuCV‑R：5’‑CTCTTCCTCCCAGCGACTCT‑3’；所述探针序列为：探针DuCV‑probe：5’‑AAGYAAYGCGMGAGCTGCCGCCCTT‑3’；利用所述引物和探针进行鸭圆环病毒检测，灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于鸭圆环病毒特异性检测，为后续科学研究鸭圆环病毒致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

Description

一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针
技术领域
本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针。
背景技术
实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标(molecular Beacon)。TaqMan探针法是指Real-time PCR扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、Cy5、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着Real-time PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与Real-time PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，避免了SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判，被广泛应用于动物传染病学检测领域。此外，不同荧光报告基团(Reporter，R)标记，可同时对单一样本(尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本)开展多种病原学检测，具有高通量、成本低廉、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。
鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)最早由Hattermann等2003年在番鸭中首次发现。鸭感染DuCV的主要临床表现为感染鸭羽毛凌乱、生长发育不良及体重轻等，对感染鸭的组织病理学研究发现DuCV主要引起鸭法氏囊淋巴细胞减少、萎缩和组织细胞增生等，提示DuCV感染可引起病毒诱导性淋巴组织损伤，从而使感染宿主易并发或继发感染其它病原。DuCV为无囊膜、二十面体对称的病毒，其基因组为单股负链环状DNA，编码两个大的蛋白(ORF-V1和ORF-C1)。前期关于检测鸭圆环病毒实时荧光定量PCR方法已见相关研究报道(Fringuelli E,等.Diagnosis of duck circovirus infections by conventional andreal-time polymerase chain reaction tests.Avian Pathol.2005；刘玲凤，等.鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用.中国家禽，2017；许宗丽，等.鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立.中国畜牧兽医，2013)，但近年来由于鸭圆环病毒被发现存在基因变异和重组现象。前期建立的相关研究方法在检测鸭圆环病毒时经常出现假阴性(即由于基因变异后导致前期引物不匹配导致无法检测出荧光信号)。本发明建立的一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针，基于最新鸭圆环病毒流行病学数据和基因组学信息，利用先进的分子生物学分析手段，筛选出能对鸭圆环病毒新流行株和前期流行株均可检测增强型鸭圆环病毒检测引物和探针。本发明不仅可用于流行病学检测且可对当前鸭圆环病毒感染程度进行精确定量(比SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法敏感性更高)，可有效用于鸭圆环病毒致病机制差异研究，本发明可填补国内外相关研究领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针及其使用方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测22.9拷贝/μL，可用于流行病学检测且可对鸭圆环病毒感染程度进行精确定量，可有效用于鸭圆环病毒致病机制差异研究，可填补国内外相关研究领域的技术空白。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针，所述引物序列如下：
上游引物DuCV-F：5’-GAGTTCTGCACGCTCGACAA-3’，
下游引物DuCV-R：5’-CTCTTCCTCCCAGCGACTCT-3’；
所述探针序列为：
探针DuCV-probe：5’-AAGYAAYGCGMGAGCTGCCGCCCTT-3’，且其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。Y＝C/T，M＝A/C。
所述的引物和探针用于鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测的检测方法，以待检样品的核酸DNA为模板，用优化后的反应体系以及反应条件进行实时荧光定量PCR反应，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，特异性的对鸭圆环病毒进行检测；
其中，优化后的反应体系为：在20μL体系中含有以下成分：
组分名称 体积(μL)
Probe qPCR Mix(2×)混合液 10
上游引物DuCV-F(10μmol/L) 0.4
下游引物DuCV-R(10μmol/L) 0.4
探针DuCV-probe(10μmol/L) 0.8
DNA模板 1.0
Nuclease-free Water 7.4
优化后的反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、60℃30s，共45个循环。
所述的检测方法，它包括以下步骤：
(1)构建DuCV阳性标准品；
(2)建立TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测方法：将标准品进行倍比稀释；以倍比稀释所得的标准品分别作为模板，用优化后的反应体系以及反应条件进行扩增，获得相应的扩增动力学曲线，以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值为纵坐标，绘制出标准曲线并得到对应的标准线性回归方程；
(3)检测：以待检样品的核酸DNA为模板，用优化后的反应体系以及反应条件进行扩增，得扩增曲线，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，判定鸭圆环病毒阳性或阴性；未出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒阴性；出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒阳性，根据扩增曲线的Ct值并结合标准线性回归方程，计算出阳性样品中病毒DNA的拷贝数。
其中，步骤(1)构建DuCV阳性标准品的具体方法为：
以提取的鸭圆环病毒核酸DNA为模板，用上游引物DuCV-F1：5＇-GGCAACTACTCATACAAGA-3＇和下游引物DuCV-R1：5＇-TAATACTTGTTTTCGGCGG-3＇进行PCR扩增，预期扩增片段大小为548bp。上述引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的100μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液50μL、上/下游引物(DuCV-F1/DuCV-R1)(引物浓度为20μmol·L-1)各1μL、提取的鸭圆环病毒核酸DNA模板2μL，补充灭菌去离子水至终反应体系100μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(DuCV-F1/DuCV-R1)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-DuCV)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为2.29×109拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续10倍倍比稀释，将获得的浓度分别为2.29×107拷贝/μL至2.29×100拷贝/μL，均冻存于-20℃备用。
步骤(2)建立TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测方法具体操作为：
以倍比稀释后的标准品(P-DuCV)为模板，按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火与延伸温度下进行实时荧光定量PCR反应，优化出最佳反应体系以及反应条件。
反应体系的优化时，主要对引物浓度、探针浓度以及引物与探针的用量进行优化。
引物浓度优化：将上游引物DuCV-F与下游引物DuCV-R的浓度均倍比稀释为2.5μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L再分别进行检测，通过试验结果的分析比较，确定上游引物DuCV-F与下游引物DuCV-R的最佳浓度为10μmol/L。
探针浓度优化：将探针DuCV-probe的浓度倍比稀释为2.5μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L再分别进行检测，通过试验结果的分析比较，确定探针DuCV-probe的最佳浓度为10μmol/L。
退火与延伸温度进行优化时，所选的退火与延伸温度为54℃、56℃、58℃、60℃、62℃以及64℃，通过试验结果的分析比较，确定最优的退火与延伸温度均为60℃。
通过上述优化方法，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混合液10μL、上/下游引物(DuCV-F和DuCV-R)(10μmol/L)各0.4μL、探针DuCV-probe(10μmol/L)0.8μL、DNA模板1μL、水(Nuclease-free Water)补足至20μL。优化后的最佳反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、60℃退火与延伸共30s，共45个循环(扩增曲线见图1)。
分别以标准品(P-DuCV)含量为2.29×107拷贝/μL-2.29×103拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线，见图2)，获得实时荧光定量PCR标准曲线的线性方程的斜率为-3.359，Y轴截距为40.10，相关系数为1.000，扩增效率为98％，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。
分别以标准品(P-DuCV)含量为2.29×104拷贝/μL至2.29×100拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为22.9拷贝/μL(图3)。
本发明还提供一种所述的引物和探针在制备用于鸭圆环病毒特异性检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物和探针。
该试剂盒结果判定如下：当FAM通道出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒阳性；当FAM通道未出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒阴性。
有益效果
1.本发明利用所述增强型鸭圆环病毒检测引物和探针进行鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测，具有以下优点和效果：
①检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。
②定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中的Ct值，直接对鸭圆环病毒感染给出判定，并可对其感染程度进行准确定量。
③灵敏度高：最低可检测22.9拷贝/μL。
④特异性强：和鸭中的常见传染病[如鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)]均均无反应信号，仅对鸭圆环病毒感染检测出现荧光信号。
⑤重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行DuCV检测的组内变异系数为0.68％-1.79％，组间变异系数0.94％-2.31％。
2.本发明的引物和探针针对性更强：本发明的一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针，基于最新鸭圆环病毒流行病学数据和基因组学信息，筛选出能对鸭圆环病毒新流行株和前期流行株均可检测增强型鸭圆环病毒检测引物和探针，用于流行病学调查时可有效避免假阴性结果，特异性更强。
附图说明
图1是实时荧光定量PCR检测DuCV扩增曲线；1：DuCV扩增曲线；2阴性对照。
图2是实时荧光定量PCR检测DuCV标准曲线。
图3是实时荧光定量PCR检测DuCV敏感性试验结果图；1：模板浓度为2.29×104拷贝/μL的扩增曲线；2：模板浓度为2.29×103拷贝/μL的扩增曲线；3：模板浓度为2.29×102拷贝/μL的扩增曲线；4：模板浓度为2.29×101拷贝/μL的扩增曲线；5：模板浓度为2.29×100拷贝/μL的扩增曲线。
图4是实时荧光定量PCR检测DuCV的特异性试验结果图；1为DuCV；Controls为GPV、MDPV、DAdV-A、DEV、E.coli、R.A.和P.M.对照样品。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例1
1.相关试验病原
1.1试验用毒株
鸭圆环病毒(FQ201株)由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存。
1.2试验对照毒株和菌株
鸭群中常见核酸类型为DNA的病原，如鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
2.TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物设计
2.1引物和探针的设计与合成
根据最新鸭圆环病毒核苷酸序列分析比对结果，利用引物设计软件PrimerExpress设计特异性的引物和探针。所述引物序列为：
上游引物DuCV-F：5’-GAGTTCTGCACGCTCGACAA-3’，
下游引物DuCV-R：5’-CTCTTCCTCCCAGCGACTCT-3’；
所述探针序列为：探针DuCV-probe：5’-AAGYAAYGCGMGAGCTGCCGCCCTT-3’；其中，探针DuCV-probe其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse；所述引物和探针均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3.DuCV阳性标准品的构建
利用Oligo 7引物设计软件设计引物，上游引物DuCV-F1：5＇-GGCAACTACTCATACAAGA-3＇与下游引物DuCV-R1：5＇-TAATACTTGTTTTCGGCGG-3＇，预期扩增片段大小为548bp。使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的100μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液50μL、上/下游引物(DuCV-F1/DuCV-R1)(引物浓度为20μmol·L-1)各1μL、提取的(FQ201株)核酸DNA模板2μL，补充灭菌去离子水至终反应体系100μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(DuCV-F1/DuCV-R1)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-DuCV)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为2.29×109拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续10倍倍比稀释，将获得的浓度分别为2.29×107拷贝/μL至2.29×100拷贝/μL，均冻存于-20℃备用。
4.TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测方法的建立
4.1TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV反应条件优化
按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混合液10μL、上/下游引物(DuCV-F和DuCV-R)(10μmol/L)各0.4μL、探针(DuCV-probe)(10μmol/L)0.8μL、DNA模板1μL、水(Nuclease-freeWater)补足至20μL。优化后的最佳反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、60℃30s，共45个循环(扩增曲线见图1)。
分别以标准品(P-DuCV)含量为2.29×107拷贝/μL-2.29×103拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线，见图2)，获得实时荧光定量PCR标准曲线的线性方程的斜率为-3.359，Y轴截距为40.10，相关系数为1.000，扩增效率为98％，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。
分别以标准品(P-DuCV)含量为2.29×104拷贝/μL至2.29×100拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为22.9拷贝/μL(图3)。
4.2TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV的特异性试验
用优化后的实时荧光定量PCR条件，分别对DuCV、GPV、MDPV、DAdV-A、DAdV-3、DEV、E.coli、R.A.和P.M.进行检测。结果可见，仅对DuCV出现阳性扩增，对GPV、MDPV、DAdV-A、DEV、E.coli、R.A.和P.M.(图中的Controls)均未见阳性扩增信号(图4)。
4.3TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV重复性试验
用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为2.29×106拷贝/μL、2.29×104拷贝/μL、2.29×102拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内(intra-group)变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20℃保存，每隔7d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间(inter-group)变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行的组内变异系数为0.68％-1.79％，组间变异系数0.94％-2.31％，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。
6临床应用
使用建立的鸭圆环病毒特异性检测方法，对临床收集的87份生长不良鸭泄殖腔棉拭子进行鸭圆环病毒进行检测。结果显示，23份检测出现荧光信号(判为阳性样品)，阳性率为26.43％。对87份样品利用文献【赵光远,谢芝勋,谢丽基,庞耀珊,邓显文,刘加波,范晴.鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].畜牧与兽医,2013,45(01):60-63.】介绍的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法进行鸭圆环病毒检测，其中DuCV阳性19份，阳性率为21.84％，且该19份阳性样品经本发明建立的方法检测均为阳性，符合率为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gagttctgca cgctcgacaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ctcttcctcc cagcgactct 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aagyaaygcg mgagctgccg ccctt 25

Claims (4)

1.一种增强型鸭圆环病毒检测引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：
上游引物DuCV-F：5’-GAGTTCTGCACGCTCGACAA -3’，
下游引物DuCV-R：5’-CTCTTCCTCCCAGCGACTCT -3’；
所述探针序列为：
探针DuCV-probe：5’- AAGYAAYGCGMGAGCTGCCGCCCTT-3’， 且其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse，Y=C/T，M= A/C。
2.一种如权利要求1所述的引物和探针在制备用于鸭圆环病毒特异性检测试剂盒中的应用。
3.一种鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
4.如权利要求3所述的鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：其反应体系为：在20 μL体系中含有以下成分：Probe qPCR Mix（2×）混合液 10μL，10 μmol/L的上游引物DuCV-F 0.4μL，10 μmol/L的下游引物DuCV-R 0.4μL，10 μmol/L的探针DuCV-probe0.8μL，DNA模板 1.0μL，Nuclease-free Water 7.4μL；
反应条件为：95℃ 600s 预变性；95℃ 10s、60℃ 30s，共45个循环。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586487B (zh) * 2012-03-15 2013-10-02 广西壮族自治区兽医研究所 鸭i型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN103773899B (zh) * 2014-01-26 2015-08-26 广西壮族自治区兽医研究所 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒
CN104059998B (zh) * 2014-07-08 2016-06-01 山东农业大学 一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重pcr方法
CN104561381A (zh) * 2015-01-10 2015-04-29 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于检测鸽圆环病毒的引物和探针
CN105886666A (zh) * 2016-05-13 2016-08-24 佛山科学技术学院 鸭圆环病毒的实时荧光定量pcr检测方法
CN110628765B (zh) * 2019-09-10 2020-07-31 临沂大学 一种鸭圆环病毒串联重复序列及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PCR最新技术原理、方法及应用;黄留玉，等;《PCR最新技术原理、方法及应用》;20110131;第54页最后1段-第55页倒数第2段 *
生物检测技术;李自刚，等;《生物检测技术》;20160831;第266页 *

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