CN111910018A - 一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量pcr检测的引物和探针 - Google Patents

一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量pcr检测的引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物序列为：上游引物DuCV‑F：5’‑CAGTTTGTKGCTAARACVTTG‑3’，下游引物DuCV‑R：5’‑AGTTTATTGGRAASGGGAGG‑3’；所述探针的序列为：探针DuCV‑2‑probe：5’‑TTTGATTTGTCCGCCTTAT‑3’，且其5’‑端标记荧光报告基团FAM，3’‑端标记MGB。利用所述引物和探针进行鸭圆环病毒2型检测的方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于特异性检测鸭圆环病毒2型感染，为后续科学研究鸭圆环病毒致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

Description

一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的引物和探针
技术领域
本发明属于禽病学领域，具体涉及一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR 检测的引物和探针。
背景技术
实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以 荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧 光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。 由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。 荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量 PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、 FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标(molecular Beacon)。TaqMan探针法是指Real-time PCR扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入 一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引 物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、Cy5、JOE等， 3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ-1等。当探针完整的时候， 5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检 测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着Real-time PCR的进行，Taq酶在 链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性 的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体 系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就 可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实 现了荧光信号的累积与Real-time PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代 表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因 只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特 异性，避免了SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判，被广泛 应用于动物传染病学检测领域。
鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)最早由Hattermann等2003年在番鸭中 首次发现。鸭感染DuCV的主要临床表现为感染鸭羽毛凌乱、生长发育不良及体 重轻等，对感染鸭的组织病理学研究发现DuCV主要引起鸭法氏囊淋巴细胞减 少、萎缩和组织细胞增生等，经原位荧光检测证实DuCV感染鸭的脾脏、胸腺和 法氏囊中形成明显的病灶，提示DuCV感染可引起病毒诱导性淋巴组织损伤，从 而使感染宿主易并发或继发感染其它病原。DuCV为无囊膜、二十面体对称的病 毒，其基因组为单股负链环状DNA，编码两个大的蛋白(ORF-V1和ORF-C1)。
研究发现鸭群中流行的DuCV可划分为两大基因型：鸭圆环病毒1型 (DuCV-1)和鸭圆环病毒2型(DuCV-2)，其中DuCV-1分支包括DuCV欧洲株、 DuCV美洲株、国内部分浙江株、部分山东株和部分福建株，基因组长度为 1988bp-1996bp；而DuCV-2分支包括了所有台湾株和部分福建株，DuCV-2分支 内DuCV基因组全长均为1988bp。2015年，四川农业大学利用感染性克隆技术获 得DuCV-GH01株(属于DuCV-2)，病毒对非免疫雏樱桃谷鸭(10d)的致病性， 结果发现雏鸭感染GH01株后可见典型的DuCV临床感染症状(如消瘦、羽毛凌 乱和体重减轻等)，其胸腺、脾脏、法氏囊、肝脏和肺脏等多脏器出现不同程 度的病理损伤，显著引起宿主靶细胞凋亡，造成免疫器官损伤导致鸭免疫抑制。 2018年，韩国学者对D11-JW-008株(属于DuCV-1分支)对北京鸭(24d)致病 性研究发现，北京鸭感染后其法氏囊可检测到细胞凋亡，但实验组和对照组类 似，并未观察到典型的DuCV临床感染症状(如消瘦、羽毛凌乱和体重减轻等)。 上述研究表明，DuCV-1和DuCV-2对雏鸭存在致病力强弱差异。目前，尚未见特 异性用于检测鸭圆环病毒2型感染的荧光定量引物和MGB探针的研究报道，该方 法不仅可用于流行病学检测(达到常规PCR检测效果，但敏感度更高)且可对鸭 圆环病毒2型感染程度进行精确定量，为后续开展2型鸭圆环病毒分子流行病学 和致病机理奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的引物和 探针及其使用方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低 可检测39.5拷贝/μL，可用于流行病学检测且可对鸭圆环病毒2型感染程度进行精 确定量，为后续开展2型鸭圆环病毒分子流行病学和致病机理奠定基础，填补了 尚未见用于特异性检测鸭圆环病毒2型感染的荧光定量引物和MGB探针研究报 道的技术空白。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量 PCR检测的引物和探针，所述引物序列如下：
上游引物DuCV-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’，
下游引物DuCV-R：5’-AGTTTATTGGRAASGGGAGG-3’；
所述探针的序列为：
探针DuCV-2-probe：5’-TTTGATTTGTCCGCCTTAT-3’，且其5’-端标记荧 光报告基团FAM，3’-端标记MGB。其中，K＝G/T，R＝A/G，V＝A/C/G，S＝C/G。
所述的引物和探针用于鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的检测方法， 以待检样品的核酸DNA为模板，用优化后的反应体系以及反应条件进行实时荧 光定量PCR反应，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，特异性的对鸭圆环病 毒2型进行检测；
其中，优化后的反应体系为：在20μL体系中含有以下成分：
组分名称 体积(μL)
Probe qPCR Mix(2×)混合液 10
上游引物DuCV-F(10μmol/L) 0.4
下游引物DuCV-R(10μmol/L) 0.4
探针DuCV-2-probe(10μmol/L) 0.8
DNA模板 1.0
Nuclease-free Water 7.4
优化后的反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、56℃30s，共45个循 环。
所述的检测方法，它包括以下步骤：
(1)构建阳性标准品；
(2)建立TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2方法：将标准品进 行倍比稀释；以倍比稀释所得的标准品作为模板，用优化后的反应体系以及反 应条件分别进行扩增，获得相应的扩增动力学曲线，以标准品起始拷贝数的常 用对数为横坐标，以循环数阈值为纵坐标，绘制出标准曲线并得到对应的标准 线性回归方程；
(3)检测：以待检样品的核酸DNA为模板，用优化后的反应体系以及反应 条件进行扩增，得扩增曲线，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，判定鸭圆 环病毒2型阳性或阴性；未出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒2型阴性； 出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒2型阳性，根据扩增曲线的Ct值并结 合标准线性回归方程，计算出阳性样品中病毒DNA的拷贝数。
其中，步骤(1)构建阳性标准品的具体方法为：
以提取的鸭圆环病毒2型核酸DNA为模板，用鸭圆环病毒2型上游引物 DuCV-F2：5＇-TTACTCGGGAAATGACGTAGT-3＇，鸭圆环病毒2型下游引物 DuCV-R2：5＇-AGAAAACCAGATAATGCGACC-3＇进行PCR扩增，鸭圆环病 毒2型预期扩增片段大小为612bp。上述引物均在生工生物工程(上海)股份有限 公司合成。
使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的100μL体系进行扩增， 其中2×PCRMaster Mix反应液50μL、上/下游引物(DuCV-F2/DuCV-R2)(引 物浓度为20μmol·L-1)各1μL、提取的鸭圆环病毒2型核酸DNA模板2μL， 补充灭菌去离子水至终反应体系100μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为94℃ 预变性5min后进入循环，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸50s，35 个循环结束后，72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂 糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随 机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养 14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物 (DuCV-F2/DuCV-R2)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重 组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验 预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-DuCV-2)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为3.95×109拷贝/μL(P-DuCV-2)。经线性化酶切 后，进行连续10倍倍比稀释，将获得的浓度为3.95×108拷贝/μL至3.95×100拷贝 /μL均冻存于-20℃备用。
步骤(2)建立TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2方法的具体操 作为：
以倍比稀释后的标准品(P-DuCV-2)为模板，按照Probe qPCR Mix试剂盒 说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火和延伸温度下进行 实时荧光定量PCR反应，优化出最佳反应体系以及反应条件。
反应体系的优化时，主要对引物浓度、探针浓度以及引物与探针的用量进 行优化。
引物浓度优化：将上游引物DuCV-F与下游引物DuCV-R的浓度均倍比稀 释为2.5μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L再分别进行检测，通过试验 结果的分析比较，确定上游引物DuCV-F与下游引物DuCV-R的最佳浓度为 10μmol/L。
探针浓度优化：将探针DuCV-2-probe的浓度倍比稀释为2.5μmol/L、 5.0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L再分别进行检测，通过试验结果的分析比较， 确定探针DuCV-2-probe的最佳浓度为10μmol/L。
退火和延伸温度进行优化时，所选的退火和延伸温度为52℃、54℃、56℃、 58℃、60℃以及62℃，通过试验结果的分析比较，确定最优的退火和延伸温度 均为56℃。
通过上述优化方法，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混 合液10μL、上/下游引物(DuCV-F和DuCV-R)(10μmol/L)各0.4μL、探针 (DuCV-2-probe)(10μmol/L)0.8μL、DNA模板1μL、水(Nuclease-free Water) 补足至20μL。优化后的最佳反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、56℃ 退火和延伸共30s，共45个循环(扩增曲线见图1)。
分别以标准品(P-DuCV-2)含量为3.95×108拷贝/μL至3.95×103拷贝/μL的标 准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准 品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为 纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线，见图2)，获得实时荧光定量PCR 标准曲线的线性方程的斜率为-3.363，Y轴截距为43.56，相关系数为1.000，扩增 效率为98％，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关 系。
分别以标准品(P-DuCV-2)含量为3.95×105拷贝/μL至3.95×100拷贝/μL的 标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为 39.5拷贝/μL(图3)。
本发明的目的还在于提供一种所述的引物和探针在制备用于特异性检测鸭 圆环病毒2型感染的试剂盒中的应用。
本发明的目的还在于提供一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测试剂 盒，所述试剂盒包括所述的引物和探针。
有益效果
本发明利用鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的引物和探针进行鸭圆 环病毒2型检测，具有以下优点和效果：
1.检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结 束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。
2.定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中的Ct 值，直接对鸭圆环病毒2型(DuCV-2)感染给出判定，并可对其感染程度进行 准确定量。
3.灵敏度高：最低可检测39.5拷贝/μL。
4.特异性强：和鸭中的常见传染病[如鸭圆环病毒1型(DuCV-1)、鹅细小 病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭腺病毒 3型(DAdV-3)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、 鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)]均无反应信号，仅对鸭圆环病毒2型(DuCV-2) 感染检测出现荧光信号。
5.重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行DuCV-2检测的组内 变异系数为0.48％-1.63％，组间变异系数0.61％-2.34％。
附图说明
图1是实时荧光定量PCR检测DuCV-2扩增曲线；1：DuCV-2扩增曲线， 2：阴性对照。
图2是实时荧光定量PCR检测DuCV-2标准曲线。
图3是实时荧光定量PCR检测DuCV-2敏感性试验的结果图；1：模板浓度 3.95×105拷贝/μL的扩增曲线；2：模板浓度3.95×104拷贝/μL的扩增曲线；3： 模板浓度3.95×103拷贝/μL的扩增曲线；4：模板浓度3.95×102拷贝/μL的扩增 曲线；5：模板浓度3.95×101拷贝/μL的扩增曲线；6：模板浓度3.95×100拷贝/μL 的扩增曲线。
图4是实时荧光定量PCR检测DuCV-2特异性试验的结果图；1：DuCV-2； Controls：DuCV-1、GPV、MDPV、DAdV-A、DAdV-3、DEV、E.coli、R.A.和 P.M.对照样品。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例1
1.相关试验病原
1.1试验用毒株
鸭圆环病毒2型(DuCV-2，FJ1815株)由福建省农业科学院畜牧兽医研究 所分离、鉴定和保存。
1.2试验对照毒株和菌株
鸭群中常见核酸类型为DNA的病原，如鸭圆环病毒1型(DuCV-1，MH25 株)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、 鸭腺病毒3型(DAdV-3)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里氏杆 菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所 鉴定和保存。
2.TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
2.1引物和探针的设计
根据鸭圆环病毒基因2型(DuCV-2)核苷酸序列分析比对结果，设计针对 鸭圆环病毒基因2型的特异性引物和探针：所述引物序列如下：
上游引物DuCV-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’，
下游引物DuCV-R：5’-AGTTTATTGGRAASGGGAGG-3’；
所述探针的序列为：
探针DuCV-2-probe：5’-TTTGATTTGTCCGCCTTAT-3’
其中探针DuCV-2-probe其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记MGB； 所述引物和探针均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.2阳性标准品的构建
利用Oligo 7引物设计软件设计引物，鸭圆环病毒2型上游引物DuCV-F2：5＇-TTACTCGGGAAATGACGTAGT-3＇，鸭圆环病毒2型下游引物DuCV-R2： 5＇-AGAAAACCAGATAATGCGACC-3＇，鸭圆环病毒2型预期扩增片段大小 为612bp。使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的100μL体系进行扩 增，其中2×PCR Master Mix反应液50μL、上/下游引物(DuCV-F2/DuCV-R2) (引物浓度为20μmol·L-1)各1μL、提取的DuCV-2(FJ1815株)核酸DNA模 板2μL，补充灭菌去离子水至终反应体系100μL。混匀后进行PCR扩增，扩增 条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延 伸50s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂 糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随 机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养 14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物 (DuCV-F2/DuCV-R2)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重 组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验 预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-DuCV-2)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为3.95×109拷贝/μL(P-DuCV-2)。经线性化酶切 后，进行连续10倍倍比稀释，将获得的浓度为3.95×108拷贝/μL至3.95×100拷贝 /μL均冻存于-20℃备用。
3.TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2方法的建立
3.1 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2反应条件优化
按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体 系，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混合液10μL、上/下游引 物(DuCV-F和DuCV-R)(10μmol/L)各0.4μL、探针(DuCV-2-probe)(10μmol/L) 0.8μL、DNA模板1μL、水(Nuclease-free Water)补足至20μL。优化后的最佳 反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、56℃30s，共45个循环(扩增曲线见 图1)。
分别以标准品(P-DuCV-2)含量为3.95×108拷贝/μL至3.95×103拷贝/μL的标 准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准 品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为 纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线，见图2)，获得实时荧光定量PCR 标准曲线的线性方程的斜率为-3.363，Y轴截距为43.56，相关系数为1.000，扩增 效率为98％，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关 系。
分别以标准品(P-DuCV-2)含量为3.95×105拷贝/μL至3.95×100拷贝/μL的 标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为 39.5拷贝/μL(图3)。
3.2 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2特异性试验
用优化后的实时荧光定量PCR条件，分别对DuCV-1、DuCV-2、GPV、MDPV、 DAdV-A、DAdV-3、DEV、E.coli、R.A.和P.M.进行检测。结果可见，仅对DuCV-2 出现阳性扩增，对DuCV-1、GPV、MDPV、DAdV-A、DEV、E.coli、R.A.和P.M. (图中的Controls)均未见阳性扩增信号(图4)。
3.3 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2重复性试验
用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为3.95×106、3.95×104、 3.95×102的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内(intra-group) 变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20℃保存，每隔7d 取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间 (inter-group)变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行的组内变异系 数为0.48％-1.63％，组间变异系数0.61％-2.34％，表明建立的实时荧光定量PCR 检测方法重复性好。
4.临床应用
使用建立的检测鸭圆环病毒2型的TaqMan实时荧光定量PCR方法，对临 床收集的75份生长不良鸭泄殖腔棉拭子进行DuCV-2检测，结果显示FAM通 道出现阳性样品16份，为DuCV-2阳性，阳性率为21.33％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等 变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的引物和探针
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cagtttgtkg ctaaracvtt g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
agtttattgg raasgggagg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tttgatttgt ccgccttat 19

Claims (5)

1.一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：
上游引物DuCV-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’，
下游引物DuCV-R：5’-AGTTTATTGGRAASGGGAGG-3’；
所述探针的序列为：
探针DuCV-2-probe：5’-TTTGATTTGTCCGCCTTAT-3’，且其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记MGB。
2.如权利要求1所述的引物和探针用于鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的检测方法，其特征在于：以待检样品的核酸DNA为模板，用优化后的反应体系以及反应条件进行实时荧光定量PCR反应，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，特异性的对鸭圆环病毒2型进行检测；
其中，优化后的反应体系为：在20μL体系中含有以下成分：
组分名称 体积(μL) Probe qPCR Mix(2×)混合液 10 上游引物DuCV-F(10μmol/L) 0.4 下游引物DuCV-R(10μmol/L) 0.4 探针DuCV-2-probe(10μmol/L) 0.8 DNA模板 1.0 Nuclease-free Water 7.4
优化后的反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、56℃30s，共45个循环。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)构建阳性标准品；
(2)建立TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2方法：将标准品进行倍比稀释；以倍比稀释所得的标准品作为模板，用优化后的反应体系以及反应条件分别进行扩增，获得相应的扩增动力学曲线，以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值为纵坐标，绘制出标准曲线并得到对应的标准线性回归方程；
(3)检测：以待检样品的核酸DNA为模板，用优化后的反应体系以及反应条件进行扩增，得扩增曲线，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，判定鸭圆环病毒2型阳性或阴性；未出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒2型阴性；出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒2型阳性，根据扩增曲线的Ct值并结合标准线性回归方程，计算出阳性样品中病毒DNA的拷贝数。
4.一种如权利要求1所述的引物和探针在制备用于特异性检测鸭圆环病毒2型感染的试剂盒中的应用。
5.一种鸭圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
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