CN107385111B - 一种鹅星状病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见可基于饱和荧光染料Eva Green检测一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒

技术领域

本发明提供一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术

星状病毒属于星状病毒科(astroviridae)星状病毒属(astrovirus)，根据宿主不同分为两个属：哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽类星状病毒属(Avastrovirus)。禽星状病毒属现有3个属（Avastrovirus 1-3），包括鸭星状病毒(Duck astrovirus)、鸟肾炎病毒(Avian nephritisa strovirus)、火鸡星状病毒(Turkey astrovirus)等，火鸡星状病毒其代表种。近年来，随着检测技术的不断优化和检测领域的扩展，从人和动物中获得的新毒株序列与已知的星状病毒毒株序列的进化距离较远，发现其可能还会有更多新亚型和基因型。星状病毒是单股正链、无囊膜的小RNA病毒，其基因组长度大约6.8kb，从5′端至3′端共包含4部分：1个85个核苷酸的5′端非编码区、3个开放阅读框(Open reading frames,ORFs)（包括ORF1a、ORF1b、ORF2）、1个80 个核苷酸的3′端非编码区、1个30个核苷酸的多聚腺苷酸尾巴。

鸭星状病毒是鸭病毒性肝炎（DHV）的主要致病原之一，DHV是危害养鸭业的重要传染病因其可导致雏鸭出现高死亡率，其发生常给养鸭业造成重大经济损失。DHV分为鸭甲肝病毒（DHAV）、鸭星状病毒1 型（DAst V-1）、鸭星状病毒 2 型（DAst V-2）三个血清型，三个血清型之间均没有明显的抗原交叉保护。近几年，随着鸭养殖业的不断扩大与发展，鸭病毒性肝炎的危害也越来越多的引起人们的关注。1965年，在英国的Norfolk 首次报道发现DHV-II（即现在所说的 DAst V-1）以来，DAst V-1在各国均未被报道，因此DAst V-1被认为仅限于在英国流行。2008 年，Fu等报道在我国发现DAstV-1，并完成了第一株DAstV-1中国分离株（C-NGB）的全基因组测序。2014 年刘宁等中国南部发现了DAst V-2。

但是关于鹅群中星状病毒感染情况及其类型，之前尚未见相关研究报道。2017年，本研究团队从福建某鹅养殖场送检的病料中，检测到鹅群中存在星状病毒感染（鹅星状病毒GsFJ2017株，GenBank登录号为MF576430），该片段和禽星状病毒代表株（火鸡星状病毒2型）的核苷酸同源性为69.1%，和赤颈鸭（Anas penelope）星状病毒的核苷酸同源性仅为60.6%，为一种新发现的水禽星状病毒。

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。当前国内外尚未见利用Eva Green实时荧光定量PCR检测鹅星状病毒的试剂盒相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是填补现有国内外尚未见利用Eva Green实时荧光定量PCR检测鹅星状病毒的试剂盒相关研究报道，提供一种鹅星状病毒的Eva Green实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测13.8个拷贝，可用于对临床样本中鹅星状病毒的分子流行病学调查及其感染程度分析，为明确鹅星状病毒的分子流行病学特点及其致病机理提供检测方法和手段。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物，所述引物序列如下：

上游引物GoAst-F1：5’- TCCAACCATCATAAGACA -3’，

下游引物GoAst-R1：5’- AGCCAGACATTACACATA -3’，

目的片段大小为170 bp；

一种用于检测鹅星状病毒的实时荧光定量PCR的试剂盒，所述试剂盒包括一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测的引物（上游引物GoAst-F1和下游引物GoAst-R1）。

一种检测鹅星状病毒的实时荧光定量PCR方法的建立：

1、鹅星状病毒阳性标准品的构建

根据本团队前期鉴定的鹅星状病毒（鹅星状病毒GsFJ2017株，GenBank登录号为MF576430）聚合酶1b蛋白编码的基因（ORF1b基因）序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：GoAst-F2：5′- TGGACGAGGTACGACGGGAC -3′和GoAst-R2：5′- TGACCCACTGCCGAAAATA -3′，用于扩增约432 bp的ORF1b基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鹅星状病毒（GsFJ2017株）核酸RNA，按照PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)推荐的50μL体系进行RT-PCR反应，其中PrimeScript 1 Step Enzyme Mix反应液2μL、2×1 Step Buffer（Dye Plus）反应液25μL、上下游引物（GoAst-F2和GoAst-R2，10μM）各2μL、提取的核酸RNA 2μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：50 ℃ 反转录30 min后进行PCR扩增程序；94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；循环结束后72℃延伸 10 min。

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将RT-PCR扩增的特异性ORF1b基因片段克隆到pEASY-T1克隆载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用RT-PCR扩增时的引物（GoAst-F2和GoAst-R2）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- GoAst），分装后置于-20 ℃保存备用。

鹅星状病毒实时荧光定量PCR方法的建立

按照SsoFast™Eva Green 试剂盒（BIO-RAD公司产品）推荐的20 μL反应体系配置反应液，其中SsoFas Eva Green Supermix为10 μL，上下游引物（GoAst-F1和GoAst-R1）分别为0.2 μL，系列稀释的阳性标准品模板2μL，补充灭菌去离子水终体积20μL。

以鹅星状病毒阳性标准品（T- GoAst）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为1.38×10⁶，1.38×10⁵，1.38×10⁴，1.38×10³，1.38×10²和1.38×10¹拷贝/μL），在不同退火温度（54，56，58，60，62和64 ℃）、引物浓度（2.5，5.0，10和20 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。

优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为：95 ℃预变性60 s；95 ℃10s，58℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。优化后的上下游引物（GoAst-F1和GoAst-R1）浓度为10 μmol/L。

用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

有益效果：

本发明提供的一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，具有以下优点和效果：

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需3h，且一次可以同时进行96个样品检测。对临床收集的75份鹅源病料进行检测后发现，检测到4份鹅星状病毒感染阳性，阳性率为5.33%。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据实时荧光定量试验检测的待检样品中的Ct值，直接计算出待见样品（检测结果为阳性）的拷贝数，可直接对其鹅星状病毒感染程度进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测13.8个拷贝，较常规PCR检测灵敏度提高100倍。

4、特异性强：和鹅群中的常见传染病（如鹅大肠杆菌病、鹅细小病毒病、鹅呼肠孤病毒病和鹅多瘤病毒病）均无反应信号，仅对鹅星状病毒检测出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物。

5、重复性好：建立的Eva Green实时荧光定量PCR方法进行鹅星状病毒检测的组内变异系数为0.37-1.89%，组间变异系数0.59-1.96%，重复性好。

附图说明

图1 实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的扩增曲线。1：1.38×10⁶ 拷贝/μL；2：1.38×10⁵ 拷贝/μL；3：1.38×10⁴ 拷贝/μL；4：1.38×10³ 拷贝/μL；5：1.38×10² 拷贝/μL；6：1.38×10¹ 拷贝/μL。

图2 实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的标准曲线。

图3实时荧光定量检测鹅星状病毒的PCR方法的特异性试验。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、相关试验病原

试验用病原鹅星状病毒、鹅大肠杆菌、鹅细小病毒、鹅呼肠孤病毒和鹅多瘤病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

、引物和设计

根据本团队前期鉴定的鹅星状病毒（鹅星状病毒GsFJ2017株，GenBank登录号为MF576430）聚合酶1b蛋白（ORF1b基因）编码的基因序列片段，设计特异性的针对鹅星状病毒的引物，其序列如下：

上游引物GoAst-F1：5’- TCCAACCATCATAAGACA -3’，

下游引物GoAst-R1：5’- AGCCAGACATTACACATA -3’，

目的片段大小为170 bp；

并在NCBI数据库进行引物Blast分析，验证设计引物的特异性。

上述引物均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

、鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

3.1 鹅星状病毒阳性标准品的构建

根据本团队前期鉴定的鹅星状病毒（鹅星状病毒GsFJ2017株）聚合酶1b蛋白编码的基因序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：GoAst-F2：5′- TGGACGAGGTACGACGGGAC -3′和GoAst-R2：5′- TGACCCACTGCCGAAAATA -3′，用于扩增约432 bp的聚合酶1b蛋白基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鹅星状病毒（GsFJ2017株）核酸RNA，按照PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)推荐的50μL体系进行RT-PCR反应，其中PrimeScript 1 Step Enzyme Mix反应液2μL、2×1 Step Buffer（Dye Plus）反应液25μL、上下游引物（GoAst-F2和GoAst-R2，10μM）各2μL、提取的核酸RNA 2μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：50℃ 反转录30 min后进行PCR扩增程序；94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；循环结束后72℃延伸 10 min。

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将RT-PCR扩增的特异性聚合酶1b蛋白基因片段克隆到pEASY-T1克隆载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用RT-PCR扩增时的引物（GoAst-F2和GoAst-R2）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- GoAst），分装后置于-20 ℃保存备用。

鹅星状病毒实时荧光定量PCR方法的建立

按照SsoFast™Eva Green 试剂盒（BIO-RAD公司产品）推荐的20 μL反应体系配置反应液，其中SsoFas Eva Green Supermix为10 μL，上下游引物（GoAst-F1和GoAst-R1）分别为0.2 μL，系列稀释的阳性标准品模板2μL，补充灭菌去离子水终体积20μL。

以鹅星状病毒阳性标准品（T- GoAst）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为1.38×10⁶、1.38×10⁵、1.38×10⁴、1.38×10³、1.38×10²和1.38×10¹拷贝/μL），在不同退火温度（54、56、58、60、62和64 ℃）、引物浓度（2.5、5.0、10和20 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。

优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为：95 ℃预变性60 s；95 ℃10s，58℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。优化后的上下游引物（GoAst-F1和GoAst-R1）浓度为10 μmol/L。

用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

从图1可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为13.8拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鹅星状病毒实时荧光定量PCR标准曲线（图2），所获得标准曲线斜率为-3.514，Y轴截距为37.72，相关系数为0.999，扩增效率为100.0%，符合实验预期。

观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：在Tm=（80.18±0.13）℃出现单一的特异性峰判为鹅星状病毒阳性（图3）。对其他病原（如鹅大肠杆菌、鹅细小病毒、鹅呼肠孤病毒和鹅多瘤病毒）均未见特异性溶解曲线峰值（图3）。

3.3重复性试验

实时荧光定量PCR 方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.37-1.89%，组间变异系数0.59-1.96%，结果见表1，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

表1实时荧光定量PCR变异系数

3.4 临床样品的检测

对75份临床送检鹅源病料进行鹅星状病毒感染的实时荧光定量RT-PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的RNA，按照建立实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm=（80.18±0.13）℃出现单一的特异性峰的样品有4份（Tm值分别为80.1℃、80.3℃、80.3℃、80.2℃），即存在鹅星状病毒感染阳性样品4份，阳性率为5.33%。

将相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用实时荧光定量PCR扩增时的引物对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鹅星状病毒基因片段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccaaccatc ataagaca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agccagacat tacacata 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggacgaggt acgacgggac 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgacccactg ccgaaaata 19

Claims (2)

1.一种鹅星状病毒的实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述引物包括如下：

上游引物GoAst-F1：5’- TCCAACCATCATAAGACA -3’，

下游引物GoAst-R1：5’- AGCCAGACATTACACATA -3’，

目的片段大小为170 bp。

2.一种用于检测鹅星状病毒的实时荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。

Images