CN114015812A - 一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的lamp引物组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于ASFV核酸检测领域，公开了一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用。本发明所提供的LAMP引物可以很好的区分非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株，且具有灵敏度高、特异性好的特点，同时该方法中的保守基因B646L基因的引物可以检测中国现阶段流行的所有基因型的毒株，B646L基因、EP402R基因和MGF_360‑14L基因的最低检测限可达1 copies/μL。本方法简单快速高效，一小时左右即可完成检测。
Description
技术领域
本发明属于ASFV核酸检测领域，具体涉及到一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，简称ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)引起的临床表现为高热、出血、呼吸困难、内脏器官广泛性出血的高度接触性传染性疾病，主要在家猪和野猪之间传播，也可通过软蜱传播，其特点是病程快、传播广、死亡率高。
2020年5月，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所报道了一株人工缺失基因的非洲猪瘟弱毒活疫苗对家猪具有良好的安全性和有效性。该研究团队还证明，该疫苗完全具备大规模生产条件。该疫苗是目前最具实现产业化应用前景的疫苗，将为我国及有关国家非洲猪瘟疫情的有效防控提供重要技术手段。由于市面上对ASFV的检测大多是对保守基因B646L进行检测，加之该疫苗为弱毒活疫苗，因此该疫苗的使用会导致常规方法检测结果为阳性，无法确定是接种了疫苗导致的阳性还是感染了野毒导致的阳性，因此需要对它们进行区分。
B646L基因(p72)是包括野生型和基因缺失型株在内的所有ASFV的保守区域，选择该基因作为靶基因以区分ASFV与其他病毒。申请CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒基因缺失弱毒株，该弱毒株是缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物EP402R基因和三个多基因家族区段(MGF-360-12L、MGF-360-13L、MGF-360-14L)编码产物；中国专利CN110093324B公开了一种基因II型的非洲猪瘟病毒MGF-360-505R缺失和CD2v与MGF-360-505R联合缺失的基因缺失病毒。因此以B646L基因(p72)、MGF多基因家族区段(MGF-360-12L、MGF-360-13L、MGF-360-14L)和EP402R(CD2v)作为靶标，可以确定猪是感染了野生型ASFV还是基因缺失株。
关于非洲猪瘟病毒的检测，国内外研究人员建立了多种核酸检测方法，主要分为病原学检测和血清学检测。目前，已经报道的区分野生型和基因缺失型的检测方法大多是荧光定量PCR，该方法灵敏度虽好但是探针的合成价格昂贵，而且需要使用专业的荧光定量PCR仪器进行检测，各仪器之间性能差异大，实验结果的分析需要专业的培训。因此，本研究通过建立非洲猪瘟的环介导等温检测方法，研制出一种高效快速区分非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的方法，解决基层猪场非洲猪瘟检测成本高、操作复杂的问题。利用本发明提供的引物，比CN110885905A中公布的引物具有更强的灵敏性。
环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本研究人员Notomo等发明的一种新型的体外等温扩增特异性核酸片段的技术。该技术主要是利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。该技术克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，并避免了反复升降温的耗时过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。LAMP技术是一种崭新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。常规PCR仅需要一对引物即可完成扩增，而LAMP方法利用两对特殊引物即外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，保证了方法的特异性，同时还可再引入一对环引物LF、LB，可以进一步提高扩增效率。影响LAMP扩增效果的因素非常复杂，可以说实验中的各个参数，都会对最后的结果造成影响。比如，为了保证引物末端的稳定性，F2/B2、F3/B3和LF/LB的3'端和F1c/B1c的5'端的设计最好使自由能小于等于-4kcal/mol；引物设计原则还与GC含量有关，一般设置为GC含量在40％～60％，GC含量50％～60％时可以设计出更好的引物，但是引物组的数量会大大减少，因此调整到合适的GC含量非常重要。
申请号为2018109877089就提到：LAMP引物设计对靶基因的GC含量要求很高，并非所有的序列都适合设计LAMP引物，同时，在实际操作过程中也发现，并非设计出的6条LAMP引物就适合进行扩增。有时候环引物的加入反而会使扩增的特异性变差。因此，最终的LAMP扩增效果取决于目的片段的选取以及LAMP引物的有效设计。
因此，在确定了检测靶基因后，具体选择靶基因的哪一个片段，如何设计LAMP引物可以达到最大的灵敏度，是目前新的面临的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合，所述的引物组合包括三组引物。
本发明的另一个目的在于提供了LAMP引物组合在制备非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株检测试剂盒中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合，包括下述引物对：
14-B646L-F3：CACACCAACAATAACCACC
14-B646L-B3：AGAGCTGTATCTCTATCCTGA
14-B646L-FIP：GAGGATTTTGATCGGAGATGTTCCGCTCTTAAATGGCCCATTGA
14-B646L-BIP：ATCAACACCGAGATTGGCACAAGCTTATCTCTGCGTGG
14-B646L-LF：GGTAGGTTTTAATCCTA
14-B646L-LB：AACGCCATTATGCAGCC；
15-CD2v-F3：AGAAATAGAAAGTCCACCACC
15-CD2v-B3：GGAGGACACGGTTTAGGT
15-CD2v-FIP：GGTTCTCTGGGAGATGGTTCAGAAGAAGAACAATGTCAGCATG
15-CD2v-BIP：CCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGAGGGAAATGGGTTGAGTG
15-CD2v-LF：TATGGAAGTGGTGTCATC
15-CD2v-LB：ACACCTATTTACTACATGCGTCCC；和
13-MGF360-14L-F3：ACAGGTGTACGTAACTGTGTC
13-MGF360-14L-B3：CGCAAATCCTGAATATGGGCT
13-MGF360-14L-FIP：TGCAGGAGTTCTGCTGGGTTATGCTAGTTACGGTTTCCAAGAGTGG
13-MGF360-14L-BIP：TTCCAGAAGACGGGGTTCGGATGTATCTAAAGCGGCTGTGTG
13-MGF360-14L-LF：GTGGATTATGACAAAACATG
13-MGF360-14L-LB:TACAGGCGTTAAGCCTCCC。
本发明的保护范围还包括：上述LAMP引物组合在制备非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所提供的LAMP引物可以很好的区分非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株，且具有灵敏度高、特异性好的特点，同时该方法中的保守基因B646L基因的引物可以检测中国现阶段流行的所有基因型的毒株，B646L基因、EP402R基因和MGF_360-14L基因的最低检测限可达1copies/μL。本方法简单快速高效，一小时左右即可完成检测，既适用于基层猪场的快速检验，也适用于实验室的确诊诊断，同时作为荧光定量PCR的平行检测方法，可以进行复核实验。
附图说明
图1为检测B646L基因的灵敏度的扩增曲线图，扩增曲线从左至右分别为108～100copies/μL和水。
图2为检测EP402R基因的灵敏度的扩增曲线图，扩增曲线从左至右分别为108～100copies/μL和水。
图3为检测MGF_360-14L基因的灵敏度的扩增曲线图，扩增曲线从左至右分别为108～100copies/μL和水。
图4为检测B646L基因的特异性的扩增曲线图，只有ASFV阳性样品出现扩增曲线。
图5为检测EP402R基因的特异性的扩增曲线图，只有ASFV阳性样品出现扩增曲线。
图6为检测MGF_360-14L基因的特异性的扩增曲线图，只有ASFV阳性样品出现扩增曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方式对本发明内容进行清晰、完整地描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例。
实施例1：
标准品的制备
PCR扩增B646L、EP402R、MGF360-505R，使用PCR产物制备标准品，其中MGF360-505R为多基因片段，因此分三段扩增。根据NCBI Pig/HLJ/2018(GenBank:MK333180)，使用Primer5.0软件设计引物B646L-F和B646L-R(扩增出的序列为SEQ ID NO.246所示)、EP402R-F和EP402R-R(扩增出的序列为SEQ ID NO.247所示)、MGF-1-F和MGF-1-R(扩增出的序列为SEQ ID NO.248所示)、MGF-2-F和MGF-2-R(扩增出的序列为SEQ ID NO.249所示)、MGF-3-F和MGF-3-R(扩增出的序列为SEQ ID NO.250所示)。引物序列见表1，引物由上海生工生物科技有限公司合成。
表1.PCR引物序列
引物使用前，高速离心1分钟，加无菌蒸馏水稀释至10μM，取20μL 4℃保存备用，其余-20℃冻存。PCR扩增反应体系见表2，模板为ASFV临床阳性核酸样品。
表2.PCR扩增体系
反应程序为：预变性95℃7min；95℃30s，55℃30s，72℃60s/kb，35cycles；72℃10min。扩增完成后，取PCR产物送至上海生工生物科技有限公司测序，测序结果正确。使用杭州博日科技有限公司的Biospin胶回收试剂盒按照说明书对PCR产物进行胶回收，回收后使用分光光度计对回收产物进行测量，得到浓度，换算得到回收产物的拷贝数，换算公式为：
copies/μL＝(6.02x1023)x(ng/μL x 10-9)/(DNA length x 660)
将换算后的回收产物以10倍倍比稀释，从5×108copies/μL稀释至5×100copies/μL，建立浓度梯度，-20℃冻存。
实施例2：
引物的筛选和优化：
2.1基于B646L基因设计的引物的筛选及优化：
根据NCBI Pig/HLJ/2018(GenBank：MK333180)中B646L基因的序列(SEQ IDNO.243)合成1～14(SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.90)引物组，虽然属于同一个基因，但不同的靶序列设计的引物及数量不同，对最终检测结果带来较大影响，同时引入的环引物之间的不同碱基数也会对特异性造成影响。具体引物组序列如下：
表3.B646L引物序列
反应体系：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO41.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，引物组mix 3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，模板5μL，ddH2O至25μL。模板为5×103copies/μL的B646L基因的标准品。(ThermoPol Buffer、100mM MgSO4、10mM dNTPMix、Bst DNA聚合酶来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，Eva Green 20x来自北京美莱博医学科技有限公司。)
反应条件：置荧光采集仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，40s/cycle，60cycles。如使用荧光PCR仪则于SYBR或者FAM通道收集荧光。80℃灭活2分钟。
筛选出的最适引物组情况如表4，引物组14的扩增效率最好，且未出现非特异的扩增。对引物组14与中国目前出现的ASFV-SY18(GenBank：MH766894)、CAS19-01/2019(GenBank：MN172368)、2018/AnhuiXCGQ(GenBank：MK128995)、GZ201801(GenBank：MT496893)、Heilongjiang/HRB1/2020(GenBank：MW656282)、DB/LN/2018(GenBank：MK333181)、Wuhan/2019-1(GenBank：MN393476)、Wuhan/2019-2(GenBank：MN393477)、ASFV-wbBS01(GenBank：MK645909)、China/GD/2019(GenBank：MW361944)、CN/2019/AES01(GenBank：MK940252)、HeN/ZZ-P1/21(GenBank：MZ945536)、SD/DY-I/21(GenBank：MZ945537)几种毒株进行序列比对，引物序列在各个基因型之间保守，可以扩增出中国现阶段流行的所有非洲猪瘟病毒毒株。(注：HeN/ZZ-P1/21、SD/DY-I/21这两株是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所最新检测到的Ⅰ型毒株，目前它们的基因组序列还在审查阶段，尚未在NCBI上公布，序列由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所赵东明博士提供)。
表4.B646L基因最适引物序列的筛选
2.2基于EP402R(CD2v)基因设计的引物的筛选及优化：
根据NCBI Pig/HLJ/2018(GenBank：MK333180)中EP402R(CD2v)基因的序列(SEQID NO.244)合成1～15(SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.174)引物组。引物组序列如下：
表5.CD2v引物序列
反应体系：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO41.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，引物组mix 3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，模板5μL，ddH2O至25μL。模板为5×103copies/μL的EP402R基因的标准品。
反应条件：置荧光采集仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，40s/cycle，60cycles。如使用荧光PCR仪则于SYBR或者FAM通道收集荧光。80℃灭活2分钟。
筛选出的最适引物组如表6。引物组15的扩增效率最好，且未出现非特异的扩增。
表6.EP402R基因最适引物序列的筛选
2.3基于MGF_360-505R设计的引物的筛选及优化：
根据NCBI Pig/HLJ/2018(GenBank：MK333180)中MGF_360-505R基因片段的序列(SEQ ID NO.245)合成1～13(SEQ ID NO.175～SEQ ID NO.242)引物组。引物组序列如下：
表7.MGF_360-505R引物序列
反应体系：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO41.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，引物组mix 3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，模板5μL，ddH2O至25μL。模板为5×103copies/μL的标准品。
反应条件：置荧光采集仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，40s/cycle，60cycles。如使用荧光PCR仪则于SYBR或者FAM通道收集荧光。80℃灭活2分钟。
筛选出的最适引物组如表8。引物组13的扩增效率最好，且未出现非特异的扩增。
表8.MGF基因最适引物序列的筛选
实施例3：
Mg2+浓度的优化
反应体系：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，dNTP Mix(10mM)3.5μL，Eva Green 20x1.25μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板5μL，实施例2.1中筛选到的最优引物组mix3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，镁离子添加量随表9浓度变化，ddH2O至25μL。模板为5×103copies/μL的B646L标准品。
反应条件：置荧光采集仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，40s/cycle，60cycles。如使用荧光PCR仪则于SYBR或者FAM通道收集荧光。80℃灭活2分钟。
镁离子浓度分别2mM、4mM、6mM、8mM、10mM。结果如表9所示，最适镁离子浓度为8mM。
表9.最适镁离子浓度
实施例4：
dNTP浓度的优化
反应体系：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，MgSO4(100mM)1.5μL，Eva Green 20x1.25μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板5μL，实施例2.1中筛选到的最优引物组mix 3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，dNTP Mix添加量随表10浓度变化，ddH2O至25μL。模板为5×103copies/μL的B646L标准品。
反应条件同实施例3。
dNTP浓度分别1mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM。结果如表10所示，最适dNTP浓度为1.6mM.
表10.最适dNTP浓度
实施例5：
反应温度的优化
反应体系：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，MgSO4(100mM)1.5μL，dNTP Mix(10mM)3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板5μL，实施例2.1中筛选到的最优引物组mix 3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，ddH2O至25μL。模板为5×103copies/μL的B646L标准品。
反应条件同实施例3。
反应温度分别为59℃、61℃、63℃、65℃、67℃、69℃。结果如表11所示，最适温度在63℃左右。
表11.最适反应温度
实施例6：
LAMP检测方法的灵敏性
6.1 B646L基因的灵敏性
反应体系：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO41.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，实施例2.1筛选得到的最优引物组mix3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，模板5μL，ddH2O至25μL。模板为5×108copies/μL至5×100copies/μL的梯度标准品。
反应条件：置荧光采集仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，40s/cycle，60cycles。如使用荧光PCR仪则于SYBR或者FAM通道收集荧光。80℃灭活2分钟。
结果如图1所示，该检测方法检测B646L基因的最低检测限可达1copies/μL。
6.2 EP402R基因的灵敏性
反应体系：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO41.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，实施例2.2筛选得到的最优引物组mix3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，模板5μL，ddH2O至25μL。模板为5×108copies/μL至5×100copies/μL的梯度标准品。
反应条件：置荧光采集仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，40s/cycle，60cycles。如使用荧光PCR仪则于SYBR或者FAM通道收集荧光。80℃灭活2分钟。
结果如图2所示，该检测方法检测EP402R基因的最低检测限可达1copies/μL。
6.3 MGF_360-14L的灵敏性
反应体系：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO41.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，实施例2.3筛选得到的最优引物组mix3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，模板5μL，ddH2O至25μL。模板为5×108copies/μL至5×100copies/μL的梯度标准品。
反应条件：置荧光采集仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，40s/cycle，60cycles。如使用荧光PCR仪则于SYBR或者FAM通道收集荧光。80℃灭活2分钟。
结果如图3所示，该检测方法检测MGF_360-14L基因的最低检测限可达1copies/μL。
实施例7：
LAMP检测方法的特异性
7.1提取待检样品核酸
使用天根生化科技(北京)有限公司的核酸提取仪Tguide S32与济凡生物科技(北京)有限公司的核酸提取试剂盒FMY502T5-TT，分别提取高致病性猪繁殖和呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)、猪瘟活疫苗(细胞源)、猪伪狂犬病活疫苗(HB-98株)、小反刍兽疫活疫苗(Clong 9株)、猪乙型脑炎活疫苗(SA14-14-2株)、猪瘟和伪狂犬病二联活疫苗(CSFV C株+PRV HB 2000株)、猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联活疫苗(TGE WH-1R株+PED AJ1102-R株)的核酸，提取后的核酸置于-20℃冰箱备用。其中小反刍兽疫活疫苗(Clong 9株)来自天康生物股份有限公司，其余疫苗来自武汉科前生物股份有限公司。
7.2 B646L基因的特异性
用确立好的反应体系和反应条件(见实施例6中的6.1)对实施例7.1提取的核酸和非洲猪瘟病毒流行株阳性核酸样品进行检测，同时设立阴性对照。
结果如图4所示，只有非洲猪瘟病毒流行株核酸阳性样品出现扩增，其他样品未出现扩增，证明该检测方法具有很高的特异性。
7.3 EP402R基因的特异性
用确立好的反应体系和反应条件(见实施例6中的6.2)对实施例7.1提取的核酸和非洲猪瘟病毒流行株阳性核酸样品进行检测，同时设立阴性对照。
结果如图5所示，只有非洲猪瘟病毒流行株核酸阳性样品出现扩增，其他样品未出现扩增，证明该检测方法具有很高的特异性。
7.4 MGF_360-14L基因的特异性
用确立好的反应体系和反应条件(见实施例6中的6.3)对实施例7.1提取的核酸和非洲猪瘟病毒流行株阳性核酸样品进行检测，同时设立阴性对照。
结果如图6所示，只有非洲猪瘟病毒流行株核酸阳性样品出现扩增，其他样品未出现扩增，证明该检测方法具有很高的特异性。
实施例8：
综合判定：
结合P72、CD2v、MGF_360-14L等3个基因的检测结果进行综合判定，参考2020年8月24日农业农村部办公厅(农办牧〔2020〕39号)文件。
具体判定标准见表12。
表12.综合判定结果
注：“+”代表检测阳性；“－”代表检测阴性。
针对一个待测病原，具体使用方法：
A反应液：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，B646L引物组mix 3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，待测核酸样品5μL，ddH2O至25μL。
B反应液：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，EP402R引物组mix 3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，待测核酸样品5μL，ddH2O至25μL。
C反应液：LAMP反应液8.75μL(含10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，10mM dNTP Mix 3.5μL，Eva Green 20x 1.25μL)，MGF引物组mix 3.5μL(含10μM外引物0.5μL，20μM内引物2μL，20μM环引物1μL)，Bst DNA聚合酶1μL，待测核酸样品5μL，ddH2O至25μL。
反应条件：将ABC三个反应液置荧光采集仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号。反应程序为：63℃，40s/cycle，60cycles。如使用荧光PCR仪则SYBR或者FAM通道收集荧光。80℃灭活2分钟。
A、B、C反应液都出现扩增曲线，即待测样品为AFSV流行株；
A、C反应液出现扩增曲线，B反应液未出现扩增，即待测样品为ASFV CD2v缺失株；
A、B反应液出现扩增曲线，C反应液未出现扩增，即待测样品为ASFV MGF缺失株；
A反应液出现扩增曲线，B、C反应液未出现扩增，即待测样品为ASFV CD2v与MGF基因双缺失株；
A、B、C反应液都未出现扩增曲线，即待测样品为AFSV阴性样品。
实施例9：
临床样品的验证
对60份临床样品(包括40份ASFV阳性样品20份阴性样品)进行检测，B646L基因的临床样品适用性检测结果如表13所示，阳性符合率为97.5％，阴性符合率为100％；EP402R基因的临床样品适用性结果如表14所示，阳性符合率为92.5％，阴性符合率为100％；MGF_360-14L基因的临床样品适用性结果如表15所示，阳性符合率为92.5％，阴性符合率为100％。
表13.B646L的临床样品适用性
注：“+”代表阳性；“－”代表阴性。
表14.EP402R的临床样品适用性
注：“+”代表阳性；“－”代表阴性。
表15.MGF_360-14L的临床样品适用性
注：“+”代表阳性；“－”代表阴性。
Claims (2)
1.一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合，包括下述引物对：
14-B646L-F3：CACACCAACAATAACCACC
14-B646L-B3：AGAGCTGTATCTCTATCCTGA
14-B646L-FIP：GAGGATTTTGATCGGAGATGTTCCGCTCTTAAATGGCCCATTGA
14-B646L-BIP：ATCAACACCGAGATTGGCACAAGCTTATCTCTGCGTGG
14-B646L-LF：GGTAGGTTTTAATCCTA
14-B646L-LB：AACGCCATTATGCAGCC；
15-CD2v-F3 ：AGAAATAGAAAGTCCACCACC
15-CD2v-B3：GGAGGACACGGTTTAGGT
15-CD2v-FIP：GGTTCTCTGGGAGATGGTTCAGAAGAAGAACAATGTCAGCATG
15-CD2v-BIP：CCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGAGGGAAATGGGTTGAGTG
15-CD2v-LF：TATGGAAGTGGTGTCATC
15-CD2v-LB：ACACCTATTTACTACATGCGTCCC；和
13-MGF360-14L-F3：ACAGGTGTACGTAACTGTGTC
13-MGF360-14L-B3：CGCAAATCCTGAATATGGGCT
13-MGF360-14L-FIP：TGCAGGAGTTCTGCTGGGTTATGCTAGTTACGGTTTCCAAGAGTGG
13-MGF360-14L-BIP ：TTCCAGAAGACGGGGTTCGGATGTATCTAAAGCGGCTGTGTG
13-MGF360-14L-LF：GTGGATTATGACAAAACATG
13-MGF360-14L-LB: TACAGGCGTTAAGCCTCCC。
2.权利要求1所述的LAMP引物组合在制备非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株检测试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202111530573.1A CN114015812A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的lamp引物组合及应用 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116814862A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-29 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 非洲猪瘟基因i型强毒、i型弱毒和ii型病毒鉴别检测 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110885905A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-03-17 | 华南农业大学 | 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的lamp检测引物及试剂盒 |
| CN111020062A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-04-17 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒 |
| CN112646934A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-04-13 | 华南农业大学 | 一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量pcr检测引物及试剂盒 |
-
2021
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110885905A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-03-17 | 华南农业大学 | 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的lamp检测引物及试剂盒 |
| CN111020062A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-04-17 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒 |
| CN112646934A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-04-13 | 华南农业大学 | 一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量pcr检测引物及试剂盒 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116814862A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-29 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 非洲猪瘟基因i型强毒、i型弱毒和ii型病毒鉴别检测 |
| CN116814862B (zh) * | 2023-08-09 | 2024-01-26 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 非洲猪瘟基因i型强毒、i型弱毒和ii型病毒鉴别检测 |
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