CN113073147B - 鸽腺病毒b型荧光定量检测引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测鸽腺病毒B型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，具有很高的特异性和灵敏度。建立的方法能够对鸽群中鸽腺病毒B型感染进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其扩增曲线结合Tm值即可直接对结果进行判断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

鸽腺病毒B型荧光定量检测引物及试剂盒
技术领域
本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一种用于检测鸽腺病毒B型的实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒。
背景技术
人类养鸽历史悠久，鸽经驯化成观赏鸽、赛鸽和肉鸽，拥有较强的免疫系统，加上鸽舍多采用开放式或半开放式，空气流通好，空气新鲜，相比较其他畜禽，鸽生病较少。然而，随着养鸽业规模化、集约化的迅速发展，饲养总量、饲养密度的增加，鸽的饲养方式发生了改变，由于饲养管理水平低，疫病防治意识差，加上鸽的贸易流通频繁(包括信鸽的比赛)，鸽病也越来越多，越来越严重，越来越复杂。近年来鸽病毒性传染病严重威胁着养鸽业，据国内外研究，已经报道的鸽病毒性传染病有鸽新城疫、鸽痘、鸽腺病毒感染、H9亚型低致病性禽流感、鸽Ⅰ型疱疹病毒感染、鸽轮状病毒感染和鸽圆环病毒感染等。腺病毒由于种类多，血清型复杂，宿主广泛，或作为主要的致病性病原或作为与其他致病性病原共感染的条件致病性病原，对养鸽业造成严重的威胁。禽腺病毒(Fowl aviadenovirus，FAdV)的血清2型、4型、5型、6型、8型、10型和12型均有在鸽群中检测到，有的血清型会引起鸽出现包涵体肝炎。鸽腺病毒A型(Pigeon aviadenovirus A，PiAdV-A)和鸽腺病毒B型(Pigeonaviadenovirus B，PiAdV-B)是不同于FAdV的腺病毒，虽然同属于禽腺病毒属(Aviadenovirus)，却是不同的病毒种。鸽腺病毒A型主要与幼鸽疾病综合征相关，幼鸽发病后出现呕吐，腹泻，食欲下降，甚至死亡。鸽腺病毒B型可以感染所有日龄的鸽子，其特征是引起鸽子猝死和广泛性肝炎坏死症。也有研究表明在出现呕吐、腹泻的鸽群的粪便中也能检测到鸽腺病毒B型。鸽腺病毒A型基因组大小为45480bp，鸽腺病毒B型的基因组大小为41981bp，两者的核苷酸同源性为54.9％，国际病毒分类委员会(The InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses，ICTV)已经将这两种病毒分类为不同的病毒种。虽然鸽腺病毒B型之前在国外有报道，但国内一直未见报道，近期我们从国内发病的鸽群中也检测到了该病毒的存在。
实时荧光定量PCR方法(Real time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。由于在PCR扩增的指数期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。实时荧光定量PCR技术在检测病原时不仅可以定性检测病原的有无，而且还可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸检测技术上被广泛使用。但是，当前国内外尚未见关于鸽腺病毒B型TB Green实时荧光定量PCR检测方法的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域研究空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测鸽腺病毒B型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，建立能够对鸽群中鸽腺病毒B型进行检测的实时荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测73个拷贝/μL，简化操作程序、节约成本。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种用于检测鸽腺病毒B型的实时荧光定量PCR检测引物，所述引物如下：
上游引物PiAdV-B-TBF：5’-AACTGGGAGTTCACCTCAATAC-3’，
下游引物PiAdV-B-TBR：5’-TCATTGGTCTGCACGGTAAG-3’，
目的片段大小为100bp。
一种包含所述引物(上游引物PiAdV-B-TBF和下游引物PiAdV-B-TBR)的鸽腺病毒B型实时荧光定量PCR检测试剂盒。
建立的实时荧光定量PCR检测方法，反应体系(20μL)为：TB Green Mix混合液10.0μL、上/下游引物(PiAdV-B-TBF和PiAdV-B-TBR)(10μmol/L)各0.6μL、模板1μL、用灭菌双蒸水补足至20μL。
反应条件为：95℃2min预变性；95℃10s、55℃30s、72℃30s，共40个循环。反应结束后，做出熔解曲线。
结果判定：当检测到阳性扩增信号，且熔解曲线Tm＝(81.47±0.14)℃出现单一的特异性峰判为鸽腺病毒B型阳性。
有益效果：
本发明提供检测鸽腺病毒B型实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，具有以下优点和效果：
1.检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。
2.定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中鸽腺病毒B型的Ct值，直接对其感染鸽腺病毒B型进行准确定量。
3.灵敏度高：鸽腺病毒B型(PiAdV-B)最低可检测73个拷贝/μL。
4.特异性强：对鸽群中的常见传染病病原(如PiCoV、PiNDV、PiRoTV、H9 AIV)检测均无反应信号，仅对鸽腺病毒B型检测出现荧光信号。
5.重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行PiAdV-B检测的组内变异系数为0.21-1.28％，组间变异系数0.30-1.75％，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。
附图说明
图1实时荧光定量PCR的标准曲线。
图2实时荧光定量PCR的敏感性检测结果图，其中，1：模板浓度7.3×104拷贝/μL；2：模板浓度7.3×103拷贝/μL；3：模板浓度7.3×102拷贝/μL；4：模板浓度7.3×101拷贝/μL；5：模板浓度7.3×100拷贝/μL。
图3实时荧光定量PCR的特异性检测结果图，其中：1为PiAdV-B；C为试验对照(如PiCoV、PiNDV、PiRoTV、H9 AIV)，由于均无荧光信号，肉眼无法区分。
图4实时荧光定量PCR的熔解曲线分析，其中：1为PiAdV-B；C为试验对照(如PiCoV、PiNDV、PiRoTV、H9 AIV)，由于均无荧光信号，肉眼无法区分。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例1
1.试验毒株
试验用病原鸽腺病毒B型(PiAdV-B)、鸽圆环病毒(PiCoV)、鸽副黏病毒(PiNDV)、鸽轮状病毒(PiRoTV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
2.核酸的制备
用北京全式金生物技术有限公司核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNAKit)按照说明书方法进行操作提取鸽腺病毒B型DNA。并按照试剂盒的方法同时提取试验对照的核酸DNA(PiCoV，无需进行反转录)或核酸RNA(PiNDV、PiRoTV、H9 AIV，需要反转录成cDNA)，均放置-20℃保存备用。
3.鸽腺病毒B型TB Green实时荧光定量PCR检测方法的建立
3.1引物设计
参考鸽腺病毒B型fiber2基因序列特征，设计实时荧光定量检测鸽腺病毒B型的PCR方法的特异性引物(PiAdV-B-TBF和PiAdV-B-TBR)，其中所述引物序列为：
上游引物PiAdV-B-TBF：5’-AACTGGGAGTTCACCTCAATAC-3’，
下游引物PiAdV-B-TBR：5’-TCATTGGTCTGCACGGTAAG-3’，
目的片段大小为100bp。
上述引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3.2标准品的构建
根据鉴定的鸽腺病毒B型fiber2序列特点，利用引物设计软件Oligo7设计特异性引物，引物序列为：PiAdV-B-F2：5′-GGGATCGGTCTCAACGTGGAT-3′和PiAdV-B-R2：5′-AGTCCACCGTTCGCTTTGAGA-3′，用于扩增约215bp的鸽腺病毒B型fiber2基因片段，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
以提取制备的鸽腺病毒B型DNA为模板进行PCR扩增，使用PCR扩增试剂(2×PCRMaster MIX)推荐的50μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液25μL、上下游引物(PiAdV-B-F2和PiAdV-B-R2)(引物浓度为10μmol·L-1)各1μL、DNA 1μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5min后进入循环，94℃变性35s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鸽腺病毒B型基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取7个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(PiAdV-B-F2和PiAdV-B-R2)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品(T-PiAdV-B)。
利用微量核酸测定仪测定阳性标准品(T-PiAdV-B)的浓度，计算其拷贝数为7.3×108拷贝/μL，对其进行10倍连续稀释，质粒含量分别为7.3×107～7.3×100拷贝/μL，分装后置于-20℃保存备用。
3.3实时荧光定量PCR反应条件优化
以阳性标准品(T-PiAdV-B)为模板，在不同退火温度(54～63℃)、引物(PiAdV-B-TBF、PiAdV-B-TBR)浓度(2.5～20μmol/L)下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。
优化出最佳反应体系(20μL)为：TB Green Mix混合液10.0μL、上/下游引物(PiAdV-B-TBF和PiAdV-B-TBF)(10μmol/L)各0.6μL、模板1μL、用灭菌双蒸水补足至20μL。
优化后的最佳反应条件为：95℃2min预变性；95℃10s、55℃30s、72℃30s，共40个循环。反应结束后，做出熔解曲线。
结果判定：当检测到阳性扩增信号，且熔解曲线Tm＝(81.47±0.14)℃出现单一的特异性峰判为PiAdV-B阳性。
用优化后的反应条件，以7.3×107～7.3×102拷贝/μL为模板，获得扩增动力学曲线。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(Ct值)为纵坐标，获得鸽腺病毒B型实时荧光定量PCR标准曲线(见图1)的线性方程为y＝－3.25x+38.96，相关系数为1.00，扩增效率为103％，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。
3.4敏感性检测
用优化后的反应条件，以7.3×104～7.3×100拷贝/μL为模板，获得实时荧光定量PCR的最低检测限。从图2可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为7.3×101拷贝/μL(即73拷贝/μL)。
3.5特异性检测
用优化后的实时荧光定量PCR条件，对鸽群中的常见传染病病原(如PiCoV、PiNDV、PiRoTV、H9 AIV)检测均无反应信号，仅对鸽腺病毒B型检测出现荧光信号(图3)。
从图4可以看出，在Tm＝(81.47±0.14)℃出现单一的特异性峰判为鸽腺病毒B型阳性。对其他病原(如PiCoV、PiNDV、PiRoTV、H9 AIV)均未见特异性熔解曲线峰值，表明建立的实时荧光定量PCR方法特异性强。
3.6重复性试验
用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为7.3×106、7.3×104、7.3×102的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内(intra-group)变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20℃保存，每隔一周取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间(inter-group)变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行鸽腺病毒B型检测的组内变异系数为0.21-1.28％，组间变异系数0.30-1.75％，，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。
4临床应用
对43份临床送检鸽源病料进行鸽腺病毒B型感染的实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取DNA，按照建立实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，有5份样品阳性扩增信号，且在Tm＝(81.47±0.14)℃出现单一的特异性峰，表明5份检测样品中存在鸽腺病毒B型感染(浓度分别为7.1×103拷贝/μL、3.5×103拷贝/μL、5.2×105拷贝/μL、2.6×103拷贝/μL和1.8×104拷贝/μL)，阳性率为11.63％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 鸽腺病毒B型荧光定量检测引物及试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
aactgggagt tcacctcaat ac 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tcattggtct gcacggtaag 20

Claims (2)

1.一种用于检测鸽腺病毒B型的实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述引物如下：
上游引物PiAdV-B-TBF：5’-AACTGGGAGTTCACCTCAATAC-3’，
下游引物PiAdV-B-TBR：5’-TCATTGGTCTGCACGGTAAG-3’，
目的片段大小为100bp。
2.一种包含权利要求1所述引物的鸽腺病毒B型实时荧光定量PCR检测试剂盒。
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