CN113046482B

CN113046482B - 鸽腺病毒b型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN113046482B
Application number: CN202110343027.0A
Authority: CN
Inventors: 陈翠腾; 刘斌琼; 陈珍; 朱春华; 蔡国漳; 万春和; 黄瑜; 江斌; 林琳; 张世忠
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113046482A

Abstract

本发明属禽病学检测领域，本发明公开了一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该方法根据鸽腺病毒B型Fiber2基因组保守序列设计引物组：外引物(GXB‑F3和GXB‑B3)、内引物(GXB‑FIP和GXB‑BIP)和环引物(GXB‑LF和GXB‑LB)。具体序列分别见SEQ ID NO.1‑6。根据所设计的引物组建立一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该试剂盒检测方法与鸽常见传染病病原不发生交叉反应。本发明的检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高，无需昂贵仪器设备，便于基层临床现场使用，方便快速。

Description

鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于禽病学检测领域，具体涉及一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。

背景技术

人类养鸽历史悠久，鸽经驯化成观赏鸽、赛鸽和肉鸽，拥有较强的免疫系统，加上鸽舍多采用开放式或半开放式，空气流通好，空气新鲜，相比较其他畜禽，鸽生病较少。然而，随着养鸽业规模化、集约化的迅速发展，饲养总量、饲养密度的增加，鸽的饲养方式发生了改变，由于饲养管理水平低，疫病防治意识差，加上鸽的贸易流通频繁(包括信鸽的比赛)，鸽病也越来越多，越来越严重，越来越复杂。近年来鸽病毒性传染病严重威胁着养鸽业，据国内外研究，已经报道的鸽病毒性传染病有鸽新城疫、鸽痘、鸽腺病毒感染、H9亚型低致病性禽流感、鸽Ⅰ型疱疹病毒感染、鸽轮状病毒感染和鸽圆环病毒感染等。腺病毒由于种类多，血清型复杂，宿主广泛，或作为主要的致病性病原或作为与其他致病性病原共感染的条件致病性病原，对养鸽业造成严重的威胁。禽腺病毒(Fowl aviadenovirus，FAdV)的血清2型、4型、5型、6型、8型、10型和12型均有在鸽群中检测到，有的血清型会引起鸽出现包涵体肝炎。鸽腺病毒A型(Pigeon aviadenovirus A，PiAdV-A)和鸽腺病毒B型(Pigeonaviadenovirus B，PiAdV-B)是不同于FAdV的腺病毒，虽然同属于禽腺病毒属(Aviadenovirus)，却是不同的病毒种。鸽腺病毒A型主要与幼鸽疾病综合征相关，幼鸽发病后出现呕吐，腹泻，食欲下降，甚至死亡。鸽腺病毒B型可以感染所有日龄的鸽子，其特征是引起鸽子猝死和广泛性肝炎坏死症。也有研究表明在出现呕吐、腹泻的鸽群的粪便中也能检测到鸽腺病毒B型。鸽腺病毒A型基因组大小为45480bp，鸽腺病毒B型的基因组大小为41981bp，两者的核苷酸同源性为54.9％，国际病毒分类委员会(The InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses，ICTV)已经将这两种病毒分类为不同的病毒种。虽然鸽腺病毒B型之前在国外有报道，但国内一直未见报道，近期我们从国内发病的鸽群中也检测到了该病毒的存在。

病毒分子生物学检测主要有常规PCR方法和实时荧光定量PCR方法，但由于实验设备要求比较高，在基层的检验检疫部门推广应用难。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是应用4-6条特异性引物，通过BstDNA聚合酶，在水浴锅中对靶基因进行的一种恒温扩增技术，该技术具有扩增特异性强、灵敏度高、操作快速简便、检测简单等特点，摆脱了对PCR仪、实时荧光定量PCR仪等昂贵仪器的依赖，在基层单位的检测更加方便。相对于现有的其他核酸扩增技术，LAMP具有许多独特的优点：①LAMP检测技术扩增的特异性很高，其特异性引物可以准确识别目的序列，对靶序列具有高度的选择性，减少了非特异性的扩增。②LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，减少了对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高，仅需要普通水浴锅调节温度(60℃～65℃)，大大降低了检测的费用，特别适合基层和现场使用。③LAMP检测技术在阳性扩增反应中会产生大量的双链DNA混合物和白色焦磷酸镁沉淀，其扩增产物有多种检测方法，白色焦磷酸镁沉淀可通过浊度仪测定，双链DNA产物既可以通过琼脂糖凝胶电泳检测，也可以在反应体系中加入荧光染料，然后直接根据颜色的变化或者利用荧光照射装置进行紫外线照射进行分析。目前，还未见针对鸽腺病毒B型环介导等温扩增(LAMP)反应方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。利用该引物组可特异性的检测鸽腺病毒B，为基层和现场提供一种简便、快捷的检测鸽腺病毒B的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组，其由外引物(GXB-F3和GXB-B3)、内引物(GXB-FIP和GXB-BIP)、环引物(GXB-LB和GXB-LF)组成，上述引物序列如下：

GXB-F3：5’-TAACCCCAGCTGGGAACT-3’，

GXB-B3：5’-GGGGGTTGAAATCCAGATCA-3’，

GXB-FIP：

5’-CCACGTTGAGACCGATCCCC-GCCGTCCAGTTTGCAGAT-3’，

GXB-BIP：

5’-GCGACTCGGATCCCAGTCAC-ATTCCATTCTCATCCGCAGTT-3’，

GXB-LF：5’-GATGTGCTGAAGGGTTGCTC-3’，

GXB-LB：5’-TCACCTCAATACCGAGGGC-3’。

一种含所述引物组的鸽腺病毒B型检测试剂盒。

所述的鸽腺病毒B型检测试剂盒的LAMP反应体系25μL：12.5μL的2×反应缓冲液、1μL的GXB-FIP(40pmol)、1μL的GXB-BIP(40pmol)、2μL的GXB-LF(10pmol)、2μL的GXB-LB(10pmol)、0.5μL的GXB-F3(10pmol)、0.5μL的GXB-B3(10pmol)、1μL的BstDNA聚合酶、2μL的模板DNA、1μL的荧光目视检测试剂，其余用超纯水(1.5μL)补足至25μL。反应条件为63℃反应50min。

所述鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组在制备鸽腺病毒B型快速诊断试剂中的应用。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

(1)操作简便、快速：本发明建立的LAMP方法操作简便、无需复杂昂贵仪器，便于基层临床现场使用，方便快速。此外，建立的LAMP方法快速高效，从提取样品到结果判定可在1h内完成。反应结果判定方法简单，在可见光下将阳性、阴性结果进行对比。肉眼可见阳性样品管反应液明显浑浊，阴性管样品管反应液颜色变化不大。经紫外线照射装置(254nm)照射可见，阳性样品发出翠绿色的荧光，阴性样品则没有。必要时，可进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性样品可见有不连续梯状电泳条带。

(2)灵敏度高：本发明建立的LAMP方法检测鸽腺病毒B型，最低检测限为46copy/μL。

(3)特异性强：本发明建立的LAMP方法对其他传染病(PiCoV、PiNDV、PiRoTV、H9AIV)检测均为阴性，仅对鸽腺病毒B型出现阳性结果。

(4)本发明利用所述引物组建立的检测方法与鸽常见传染病病原不发生交叉反应。

附图说明

图1为本发明鸽腺病毒B型LAMP特异性实验(直接观察)结果图，其中1：鸽腺病毒B型；2：鸽圆环病毒(PiCoV)；3：鸽副黏病毒(PiNDV)；4：鸽轮状病毒(PiRoTV)；5：H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)

图2为本发明鸽腺病毒B型LAMP方法敏感性试验(琼脂糖电泳)结果图。其中M：DL2000DNA Marker；1：4.6×10⁴copy/μL；2：4.6×10³copy/μL；3：4.6×10²copy/μL；4：4.6×10¹copy/μL；5：4.6×10⁰copy/μL；6为阴性对照。

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

实施例1

1 试验毒株

试验用病原鸽腺病毒B型(PiAdV-B)、鸽圆环病毒(PiCoV)、鸽副黏病毒(PiNDV)、鸽轮状病毒(PiRoTV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

2 核酸DNA的提取

用商品化核酸DNA提取试剂盒说明书提取相关病毒核酸。其中，PiAdV-B、PiCoV提取病毒核酸DNA；PiNDV、PiRoTV、H9 AIV提取病毒核酸RNA，并将其反转录为cDNA备用(-20℃)。

3 LAMP的引物设计

根据GenBank中登录的所有鸽腺病毒B型基因序列特征，并将其与其他鸽源腺病毒进行分析比较。选择鸽腺病毒B型Fiber2基因组保守区域片段，设计引物，包括外引物1对(GXB-F3和GXB-B3)、内引物1对(GXB-FIP和GXB-BIP)和环引物一对(GXB-LB和GXB-LF)，具体序列见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6。将设计好的相关引物，经NCBI数据库进行BLAST分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，符合试验预期。

利用设计的外引物(GXB-F3和GXB-B3)(内引物GXB-FIP和GXB-BIP在外引物扩增区域以内，条带较短，常规PCR检测易与引物二聚体混淆)对相关病毒的核酸(PiAdV-B和PiCoV提取病毒DNA，PiNDV、PiRoTV、H9 AIV提取病毒RNA反转录后的cDNA)进行常规PCR扩增检测。

按照TaKaRa Taq^TM HS Perfect Mix说明书进行PCR反应，反应体系参考说明书配制，反应体系为50μL：其中TaKaRa Taq HS Perfect Mix(2×)反应液25μL、上/下游引物(10pmol GXB-F3和10pmol GXB-B3，)各1μL、提取的模板1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：94℃预变性3min；94℃20s，54℃25s，72℃20s，35个循环；循环结束后72℃延伸5min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。结果仅GXB-F3和GXB-B3对鸽腺病毒B型扩增出现特异性目的条带；对其他病原均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的相关引物无交叉干扰，特异性强。

4 LAMP方法的优化

按照环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒(SLP204 Laoopamp DNA扩增反应试剂盒)配置LAMP试验反应液，反应体系为25μL。每25μL反应体系中含有：12.5μL的2×反应缓冲液、1μL的GXB-FIP(40pmol)、1μL的GXB-BIP(40pmol)、2μL的GXB-LF(10pmol)、2μL的GXB-LB(10pmol)、0.5μL的GXB-F3(10pmol)、0.5μL的GXB-B3(10pmol)、1μL的BstDNA聚合酶、2μL的模板DNA、1μL的荧光目视检测试剂，其余用超纯水(1.5μL)补足至25μL。

对不同温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃)、不同时间(20min、30min、40min、50min、60min)进行推荐优化。结果发现，优化后最佳反应条件为63℃反应50min。

5 LAMP检测方法的特异性试验

取相关病毒(PiAdV-B、PiCoV)核酸DNA、相关病毒(PiNDV、PiRoTV、H9 AIV)提取病毒RNA反转录后的cDNA，分别用优化后的LAMP条件进行检测。结果表明，经紫外线照射装置(254nm)照射可见，阳性样品(PiAdV-B)发出翠绿色荧光，阴性样品(PiCoV、PiNDV、PiRoTV、H9 AIV)均未见可见荧光(见图1)。

6 LAMP检测方法的敏感性试验

6.1 阳性标准品的构建

针对PiAdV-B的Fiber2基因设计特异性引物(PiAdV-B-F2-F和PiAdV-B-F2-R)，用于制备标准品质粒。其上游引物PiAdV-B-F2-F(引物序列为：5’-GTGAGAGTGGACGACGAAACA-3’)和下游引物PiAdV-B-F2-R(引物序列为：5’-CCACCGTTCGCTTTGAGAAAC-3’)进行PCR扩增含有靶序列的基因片段(目的片段大小为305bp)。

按照TaKaRa Taq^TM HS Perfect Mix说明书进行PCR反应，反应体系参考说明书配制，反应体系为50μL：其中TaKaRa Taq HS Perfect Mix(2×)反应液25μL、上/下游引物(PiAdV-B-F2-F和PiAdV-B-F2-R，10pmol)各1μL、提取的模板DNA1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：94℃预变性3min；94℃25s，53℃30s，72℃30s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。

反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鸽腺病毒B型的Fiber2基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取6个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(PiAdV-B-F2-F和PiAdV-B-F2-R)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品(T-PiAdV-B)，分装后置于-20℃保存备用。

6.2 敏感性测定

对阳性标准品(T-PiAdV-B)进行连续稀释，选取质粒浓度分别为4.6×10⁴，4.6×10³，4.6×10²，4.6×10¹和4.6×10⁰拷贝/μL)，按照优化后的LAMP条件进行检测，获得其敏感性试验数据。

反应结束后，将结果进行常规琼脂糖凝胶电泳可见图2，在4.6×10⁴，4.6×10³，4.6×10²，4.6×10¹(即46copy/μL)均可见有不连续梯状电泳条带，4.6×10⁰拷贝/μL未见不连续梯状电泳条带，表明本发明的最低检测限为46copy/μL。

7 临床检测应用

对收集的37份鸽组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取DNA，按照优化后的LAMP条件进行检测。结果可见，3份检测可见翠绿荧光(即为鸽腺病毒B型感染阳性)，阳性率为8.11％(3/37)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

taaccccagc tgggaact 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ggggttgaaa tccagatca 19

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ccacgttgag accgatcccc gccgtccagt ttgcagat 38

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gcgactcgga tcccagtcac attccattct catccgcagt t 41

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gatgtgctga agggttgctc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tcacctcaat accgagggc 19

Claims

1.一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的引物由1对外引物GXB-F3和GXB-B3、1对内引物GXB-FIP和GXB-BIP、1对环引物GXB-LB和GXB-LF组成，上述引物序列如下：

GXB-F3：5’-TAACCCCAGCTGGGAACT-3’，

GXB-B3：5’-GGGGGTTGAAATCCAGATCA-3’，

GXB-FIP：5’-CCACGTTGAGACCGATCCCC-GCCGTCCAGTTTGCAGAT-3’，

GXB-BIP：5’-GCGACTCGGATCCCAGTCAC-ATTCCATTCTCATCCGCAGTT -3’，

GXB-LF：5’- GATGTGCTGAAGGGTTGCTC-3’，

GXB-LB：5’- TCACCTCAATACCGAGGGC-3’。

2.一种含权利要求1所述引物组的鸽腺病毒B型检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的鸽腺病毒B型检测试剂盒，其特征在于：其反应体系为25μL包括：12.5μL 的2×反应缓冲液、1μL的40 pmol GXB-FIP、1μL的40 pmol GXB-BIP 、2μL的10pmol GXB-LF、2μL的10 pmol GXB-LB、0.5μL 的10 pmol GXB-F3、0.5μL的10 pmol GXB-B3、1μL 的BstDNA聚合酶、2 μL 的模板DNA、1μL的荧光目视检测试剂，其余用超纯水1.5 μL补足至25 μL。