CN113174446A - 一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重rt-pcr检测方法 - Google Patents

一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重rt-pcr检测方法 Download PDF

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欧云文
王勤
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Kaijiang Animal Disease Prevention And Control Center
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Dazhou Vocational And Technical College
Kaijiang Animal Disease Prevention And Control Center
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Abstract

本发明公开了一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT‑PCR检测方法，该引物组由发明人根据GenBank公布的BVDV‑1和BVDV‑2流行毒株5'‑UTR保守序列，设计2组特异性引物，所得目的基因扩增片段大小分别为279bp和180bp。建立的BVDV双重RT‑PCR不与牛传染性鼻气管炎病毒等发生交叉反应，可用于了解样品采集地牛群BVDV的感染情况，建立的BVDV双重RT‑PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，可用于田间样品的常规检测。采用本发明建立的双重RT‑PCR方法检测了我国2017‑2020年西部4个不同省(直辖市)不同牛场的总共1154份田间样品，结果显示389份预混样品中BVDV‑1阳性率为8.48％，BVDV‑1阳性率为9.51％，BVDV‑1+BVDV‑2阳性率为2.83％，具有一定临床应用价值，可用于临床BVDV的检测。

Description

一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测 方法
技术领域
本发明涉及兽医分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是引起牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)又称粘膜病(Mucosal disease，MD)的主要病原，宿主动物可出现腹泻、急慢性黏膜感染、繁殖和免疫障碍，同时伴有其他病原的继发感染与混合感染。耐过犊牛则成为持续感染动物(PI)，PI牛终生带毒且不断向外排毒，成为BVDV的重要传染源，难以净化，给养牛业的安全生产带来了严重的挑战。
BVDV是单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，BVDV主要分为2种基因型，即BVDV-1型和BVDV-2型。BVDV-1型的主要症状为一过性发热、腹泻和急慢性粘膜病。BVDV-2型的症状主要表现为发烧、腹泻、呼吸失调和血小板减少等，主要导致奶牛流产，对牛的致死性较高。近年来，BVDV-1型和BVDV-2 型均在我国被报道，两个基因型间具有一定交叉保护作用，但无法达到高效保护。目前，检测BVDV-1型和BVDV-2型的PCR方法已有研究报道，但其先对病毒RNA进行逆转录，再进行PCR扩增，操作较为繁琐，极易造成气溶胶污染。因此，急需一种一步法快速分型鉴别方法来区分牛群中BVDV-1型和BVDV-2型感染，为疫病防控提供技术支持。
发明内容
针对上述背景技术中指出的不足，本发明根据BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计一组(4条)特异性引物，提供了一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法，旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。
本发明采用以下技术方案：
一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
根据BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计4条特异性引物，所述引物的基因序列如下：
BVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，
P2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，
BVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，
P4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3',
(2)样品处理及核酸提取
采集牛腹泻粪便和血清样品若干份，使用核酸提取试剂盒提取样品的核酸RNA；
(3)阳性质粒的制备
以BVDV-1和BVDV-2基因组5'端非编码区(5'-UTR)分别为目的序列，与pMD19-T 载体进行重组质粒的构建；
(4)RT-PCR扩增反应
以P1、P2、P3、P4为引物，对构建的重组质粒进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增反应体系为：2×One step buffer缓冲液10μL、One step Enzyme Mix混合液0.5μL、10mmol/L 引物P10.5μL、10mmol/L引物P20.5μL、10mmol/L引物P30.5μL、10mmol/L引物P4 0.5μL、模板1.0μL、补加双蒸水至20μL。扩增程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；进行30个循环；72℃延伸10min。扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。
上述检测方法，当扩增片段大小为279bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒1型；当扩增片段大小为180bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒2型；当扩增片段同时出现279bp和180bp大小，则样本为牛病毒性腹泻病毒1型和2型混合感染。
本发明公开了一种用于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分型的一步法双重RT-PCR检测方法，该引物组由发明人根据GenBank公布的BVDV-1和BVDV-2流行毒株5'-UTR保守序列，设计2组特异性引物，所得目的基因扩增片段大小分别为279bp和180bp。建立的BVDV双重RT-PCR不与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)和猪瘟病毒(CSFV)发生交叉反应，可用于了解样品采集地牛群BVDV的感染情况，经敏感性和特异性检测分析表明建立的BVDV双重RT-PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，可用于田间样品的常规检测。采用本发明建立的双重RT-PCR方法检测了我国2017-2020年西部4个不同省(直辖市) 不同牛场的总共1154份田间样品，结果显示389份预混样品中BVDV-1阳性率为8.48％， BVDV-1阳性率为9.51％，BVDV-1+BVDV-2阳性率为2.83％，具有一定临床应用价值，可用于临床BVDV的检测。
附图说明
图1是本发明实施例提供的BVDV-1单重RT-PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000 分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒；2：BVDV-2重组质粒；3：BVDV-1和BVDV-2 重组质粒混合物；4：阴性ddH2O对照。
图2是本发明实施例提供的BVDV-2单重RT-PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000 分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒；2：BVDV-2重组质粒；3：BVDV-1和BVDV-2 重组质粒混合物；4：阴性ddH2O对照。
图3是本发明实施例提供的BVDV双重RT-PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000 分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒；2：BVDV-2重组质粒；3：BVDV-1和BVDV-2 重组质粒混合物；4：阴性ddH2O对照。
图4是本发明实施例提供的BVDV双重RT-PCR特异性检测结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒；2：BVDV-2重组质粒；3：BVDV-1和BVDV-2 重组质粒混合物；4：IBRV；5：BRV；6：BCV；7：BPIV3；8：CSFV；9：阴性ddH2O 对照。
图5是本发明实施例提供的BVDV-1单重RT-PCR敏感性检测结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒10-1稀释；2：BVDV-1重组质粒10-2稀释； 3：BVDV-1重组质粒10-3稀释；4：BVDV-1重组质粒10-4稀释；5：阴性ddH2O对照。
图6是本发明实施例提供的BVDV-2单重RT-PCR敏感性检测结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-2重组质粒10-1稀释；2：BVDV-2重组质粒10-2稀释； 3：BVDV-3重组质粒10-3稀释；4：BVDV-4重组质粒10-4稀释；5：BVDV-4重组质粒 10-5稀释；6：阴性ddH2O对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
一、材料与方法
1、材料
BVDV-1(Oregon C24V毒株)、BVDV-2(HLJ-10毒株)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenzavirus type 3,BPIV-3)和猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)，均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存；
临床样品共1154份腹泻粪便和血清样品，采自2017-2020年中国西南地区的4个省份不同牛场，对同一牛场的粪便或血清样品以3～5管为单位进行混合，最后总共得389 份粪便和血清样品，-40℃保存。
小剂量核酸提取试剂盒购自宝生生物工程(大连)有限公司；RT-PCR扩增试剂盒购自北京美莱博医学科技有限公司；质粒提取试剂盒购自AxyPrep公司。
2、方法
(1)引物设计与合成
利用Megalign软件将Gen Bank中已登录的BVDV-1和BVDV-2全基因组序列5'-UTR序列进行多序列比对找出高度保守序列，运用的Primer Premier 6.0软件，根据Gen Bank中已登录的BVDV-1(登录号：AF091605.1)和BVDV-2(登录号：AF502399.1)高度保守基因序列设计特异性引物P1、P2和P3、P4，扩增目的片段大小预期分别为279bp和180bp，所述引物的基因序列如下：
BVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，
P2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，
BVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，
P4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3'
引物委托成都擎科生物科技有限责任公司合成。
(2)样品处理及核酸提取
对预混处理后389份粪便和血清样品使用核酸提取试剂盒提取预混样品的核酸RNA。
(3)阳性质粒的制备
以BVDV-1(登录号：AF091605.1)和BVDV-2(登录号：AF502399.1)基因组5'端非编码区(5'-UTR)分别为目的序列送往成都擎科生物科技有限责任公司，分别与pMD19-T 载体进行重组质粒的构建；
(4)RT-PCR的建立及条件优化
以BVDV-1重组质粒为模板，BVDV-2重组质粒、BVDV-1+BVDV-2等量混合物和 ddH2O为对照组，P1、P2为引物，采用统计学方法依次对模板含量为10μg、1μg、0.1μg、 10ng和1ng，引物含量为0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L和1.0mmol/L，退火温度为52℃、53℃、54℃和55℃进行摸索、优化，确定BVDV-1单重RT-PCR扩增的最适反应条件。与此同时，以BVDV-2重组质粒为模板，BVDV-1重组质粒、 BVDV-1+BVDV-2重组质粒等量混合物和ddH2O为对照组，P3、P4为引物，按照上述方法确定BVDV-2单重RT-PCR扩增的最适反应条件。
(5)RT-PCR产物测序鉴定选取
以P1、P2和P3、P4为引物，利用建立的RT-PCR方法检测田间样品得部分阳性样品，将RT-PCR产物送往成都擎科生物科技有限责任公司测序，测序结果用DNAStar软件与GenBank中登录的BVDV-1和BVDV-2基因序列进行比对分析，同时在NCBI中进行比对以确定RT-PCR扩增片段的特异性。
3、检测试验
(1)双重RT-PCR特异性试验
利用建立的双重RT-PCR方法分别扩增BVDV-1重组质粒、BVDV-2重组质粒、IBRV、BRV、BCV、BPIV3和CSFV，并以BVDV-1+BVDV-2重组质粒混合物和ddH2O依次作为阳性和阴性对照，检测该双重RT-PCR方法的特异性。
(2)RT-PCR敏感性试验
分别测定BVDV-1和BVDV-1重组质粒的浓度，并依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取1μL作为RT-PCR反应模板，进行RT-PCR扩增，测定最低检出浓度，评估该双重 RT-PCR方法的敏感性。
(3)临床样品RT-PCR检测
利用建立的双重RT-PCR方法对2017-2020年收集的临床预混样389份进行临床检测，分析不同地区样品中的BVDV的感染情况。
二、结果与分析
1、RT-PCR阳性质粒的制备结果
以引物P1、P2和P3、P4分别对BVDV-1和BVDV-2重组质粒进行RT-PCR扩增，得到预期大小片段279bp和180bp。经测序，测序结果与NCBI公布的登录号AF091605.1 和AF502399.1同源性为100％，说明构建的BVDV-1和BVDV-2重组质粒正确。
2、RT-PCR反应的建立及条件优化结果
经条件优化，确定最优反应体系为20.0μL：P1引物0.5μL，P2引物0.5μL，P3引物0.5μL，P4引物0.5μL，模板1.0μL，2×One step buffer缓冲液10μ，One step Enzyme Mix混合液0.5μL，加无菌ddH 2O补足至20μL；最优反应条件：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；进行30个循环；72℃延伸10min。
3、RT-PCR特异性试验结果
利用建立的双重RT-PCR方法分别扩增BVDV-1重组质粒、BVDV-2重组质粒、IBRV、BRV、BCV、BPIV3和CSFV，结果如图4所示。结果表明，建立的双重RT-PCR方法可在BVDV-1和BVDV-2样品中扩增出的特异性目的片段，而对IBRV、BRV、BCV、BPIV3 和CSFV均扩增不出目的片段，表明该双重PCR方法特异性良好。
4、RT-PCR敏感性试验结果
利用建立的最优双重RT-PCR反应条件，对不同稀释度的BVDV-1和BVDV-2阳性质粒分别进行RT-PCR扩增，结果如图5，6所示。结果发现该双重RT-PCR方法对BVDV-1 和BVDV-2的最低检测量分别为1×103拷贝/μL和1×102拷贝/μL，表明该双重RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度。
5、临床样品检测结果
利用建立的双重RT-PCR方法对2017-2020年收集的临床预混样389份进行临床检测，结果如表1所示，389份预混样品中检出BVDV-1阳性33份，阳性率为8.48％；BVDV-2 阳性37份，阳性率9.51％，BVDV-1+BVDV-2阳性11份，阳性2.83％。其中2017-2020 年BVDV-1阳性率分别为6.82％、8.49％、9.48％和8.86％，BVDV-2阳性率分别4.55％、 9.43％、12.93％和10.13％，BVDV-1+BVDV-2阳性率分别为1.14％、2.83％、1.72％和6.33％。
表1 2017-2020年临床样品RT-PCR检测结果统计表
Figure RE-GDA0003104563310000061
Figure RE-GDA0003104563310000071
利用建立的双重RT-PCR方法对2017-2020年收集的临床预混样389份进行临床检测，结果如表2所示，云南省BVDV-1、BVDV-2和BVDV-1+BVDV-2阳性检出率均最高，分别为16.07％、17.86％和8.93％。
表2西南地区临床样品RT-PCR检测结果统计表
Figure RE-GDA0003104563310000072
三、结论
本发明参考BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计并筛选了4条特异性引物，当扩增片段为279bp时，则样本为BVDV-1型感染；当扩增片段为 180bp时，则样本为BVDV-2型感染；当同时出现279bp和180bp扩增片段时，则样本为牛病毒性腹泻病毒1型和2型混合感染。经过对双重RT-PCR反应程序及条件的反复优化，结果显示BVDV双重RT-PCR检测方法对BVDV-1和BVDV-2标准品质粒检度为 1×103拷贝/μL和1×102拷贝/μL，且与5种常见的牛源病原均无交叉反应。基于以上试验结果，表明本发明建立的双重RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性。因此本发明建立的双重RT-PCR检测方法具有一定临床应用价值，为BVDV的检测和及其疾病的诊断提供了参考。应用本团队建立的双重RT-PCR检测方法对2017-2020年田间样品进行检测，结果显示389份预混样品中BVDV-1阳性率为8.48％，BVDV-1阳性率为9.51％， BVDV-1+BVDV-2阳性率为2.83％。
实施例1
一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
根据BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计4条特异性引物，所述引物的基因序列如下：
BVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，
P2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，
BVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，
P4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3'
(2)样品处理及核酸提取
采集牛腹泻粪便和血清样品若干份，使用核酸提取试剂盒提取样品的核酸RNA；
(3)阳性质粒的制备
以BVDV-1和BVDV-2基因组5'端非编码区(5'-UTR)分别为目的序列，与pMD19-T 载体进行重组质粒的构建；
(4)RT-PCR扩增反应
以P1、P2、P3、P4为引物，对构建的重组质粒进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增反应体系为：2×One step buffer缓冲液10μL、One step Enzyme Mix混合液0.5μL、10mmol/L 引物P10.5μL、10mmol/L引物P20.5μL、10mmol/L引物P30.5μL、10mmol/L引物P4 0.5μL、模板1.0μL、补加双蒸水至20μL；扩增程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；进行30个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。
当扩增片段大小为279bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒1型；当扩增片段大小为180bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒2型；当扩增片段同时出现279bp和180bp大小，则样本为牛病毒性腹泻病毒1型和2型混合感染。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 开江县动物疫病预防控制中心达州职业技术学院
<120> 一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法
<130> 2021.6.6
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctagggaa cgaat 15
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcagcaccc tatcag 16
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcaacgtag ggaac 15
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggcatctcg agactc 16

Claims (2)

1.一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
根据BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计4条特异性引物，所述引物的基因序列如下：
BVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，
P2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，
BVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，
P4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3'，
(2)样品处理及核酸提取
采集牛腹泻粪便和血清样品若干份，使用核酸提取试剂盒提取样品的核酸RNA；
(3)阳性质粒的制备
以BVDV-1和BVDV-2基因组5'端非编码区(5'-UTR)分别为目的序列，与pMD19-T载体进行重组质粒的构建；
(4)RT-PCR扩增反应
以P1、P2、P3、P4为引物，对构建的重组质粒进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增反应体系为：2×One step buffer缓冲液10μL、One step Enzyme Mix混合液0.5μL、10mmol/L引物P1 0.5μL、10mmol/L引物P2 0.5μL、10mmol/L引物P3 0.5μL、10mmol/L引物P4 0.5μL、模板1.0μL、补加双蒸水至20μL；扩增程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；进行30个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：当扩增片段大小为279bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒1型；当扩增片段大小为180bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒2型；当扩增片段同时出现279bp和180bp大小，则样本为牛病毒性腹泻病毒1型和2型混合感染。
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