CN112626278B - 鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用 - Google Patents

鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物；和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的疫苗株探针及核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的野毒株探针。本发明引物探针构建的复合荧光定量PCR方法能快速、有效的鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株和疫苗株，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点。

Description

鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用
技术领域
本发明属于动物病原分子鉴别技术领域，具体涉及鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用。
背景技术
犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的高度接触性传染病。犬科、猫科、鼬科等肉食兽感染后死亡率可达30％～80％，而雪貂感染后死亡率则高达100％。实验表明，CDV可对猴造成致死性感染。近年来，随着犬瘟热病例逐渐上升，对毛皮动物养殖业、野生动物保护业和宠物饲养业危害极大。CDV属于有囊膜的单股负链不分节段的RNA病毒，基因组编码6个结构蛋白分别为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大转录蛋白(L)。H蛋白是CDV所有结构蛋白中变异率最高的。H蛋白与粘连蛋白、信号淋巴激活分子受体结合后，对CDV细胞噬性、跨种间传播和介导病毒感染这三方面具有显著影响。CDV H蛋白受体结合位点区单个氨基酸突变可改变宿主嗜性和病毒毒力，从而使CDV不断产生新毒株。第519位、第530位以及第549位氨基酸发生替换，可改变病毒的细胞噬性，造成CDV暴发，种间大量传播且防控异常困难。迄今为止，CDV可分为Asia1–4、Africa-1、North America1–5、Europe/South America-1、Wild Europe、South America2–4、Africa-2等19个基因型，广泛分布于全球几个大陆。根据CDV H基因序列的变异情况和各病毒株之间地域及年代的不同可将CDV基因型划分为野毒株和疫苗株。目前，Arctic和Asia-1、Asia-3为我国主要流行的基因型，其中最主要流行的是Asia-1。
近年来，随着犬瘟热病毒野毒株基因变异频繁，新基因型的病毒不断出现，而弱毒疫苗免疫动物暴发犬瘟热病例时有发生。研究报道某些弱毒疫苗株的残余毒力可能是易感动物暴发犬瘟热的原因。随着犬瘟热弱毒疫苗在易感动物中的广泛应用，在控制犬瘟热流行起着重要作用，但同时对CDV野毒感染的传统诊断方法和疫苗接种动物的鉴别诊断提出了重大挑战。CD的治愈率极低，早期病例可望治愈，中后期病例治愈困难，因此快速早期诊断CD极其重要。此外，部分由犬源细胞传代生产CDV弱毒疫苗株在易感幼龄动物和野生动物体内毒力返强的病例也时有发生。因此，建立一种快速敏感鉴别CDV野毒株和疫苗株的方法对于澄清疫苗接种动物暴发犬瘟热的原因具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于建立了一种新型的复合荧光定量PCR方法，用于鉴定和检测犬瘟热病毒的野毒株和疫苗株，以对CDV感染进行早期快速而准确的诊断，从而防止CD的蔓延以及为CDV宿主致病性的定量研究提供依据和理论基础。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物，包括引物P1和P2：
P1：CAAACGGTGGCTGAATGACAT；
P2：CCACTGCTATAGTACATACCTTGGCTT。
在本发明的另一方面，提供了鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的探针，用于鉴别疫苗株的探针为：CATATAGTTGGTTGTTTGGA；用于鉴别野毒株的探针为：CATATAGTTGGTTGTCTGGA。
进一步的，所述野毒株和疫苗株的探针5’端添加荧光基团，3’端添加淬灭基团。
优选的，疫苗株探针的荧光基团为FAM，野毒株探针的荧光基团为HEX，野毒株和疫苗株探针的淬灭基团均为MGB。
在本发明的另一方面，提供了用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，所述的试剂盒包括引物P1和P2。
进一步的，所述的试剂盒还包括上述疫苗株探针和野毒株探针。
在本发明的另一方面，提供了鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的方法，包括以下步骤：
1)提取待测病毒株的总RNA；
2)以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；
3)加入含有引物P1和P2及弱毒疫苗探针和野毒株探针的PCR反应体系中反应；
4)根据扩增结果判定：
没有CT值和典型扩增曲线的样品，视为无犬瘟热病毒；
弱毒疫苗株阳性：FAM通道CT值≤35，且出现典型扩增曲线，HEX通道无扩增，视为存在犬瘟热弱毒疫苗株病毒；
野毒株阳性：HEX通道CT值≤35，且出现典型扩增曲线，FAM通道无扩增，视为存在犬瘟热野毒株病毒；
混合阳性：FAM和HEX两个通道都复合CT值≤35，且都出现典型扩增曲线，视为野毒株与弱毒疫苗株犬瘟热病毒混合阳性；
可疑：CT值＞35，且出现典型的扩增曲线的样品建议重做，重做结果出现CT值≤35和典型扩增曲线者视为阳性，否则为阴性。
进一步的，步骤3)中PCR反应体系为：
Figure GDA0003643541110000041
480Probes Master 2×conc10μL，P1引物0.4μL，P2引物0.4μL，疫苗株探针和野毒株探针各0.1μL，H2O PCR-grade 7μL，cDNA 2μL。
进一步的，反应条件为：95℃预变性5min后，95℃10s，61℃30s循环38次，61℃采集荧光信号。
在本发明的另一方面，还提供了所述引物P1和P2或疫苗株探针和野毒株探针或试剂盒在制备用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的试剂中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明根据H基因一个碱基的区别设计两条带有不同荧光基团的MGB探针，建立了一种能快速、有效的鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株和疫苗株的复合荧光定量PCR方法。该方法线性关系好，其标准曲线的相关系数达到0.998及0.997；灵敏度高，用此方法检测野毒株和弱毒疫苗株的灵敏度分别可达到2.25×101copies/μL和2.98copies/μL；特异性强，能检测出CDV的野毒株和疫苗株；重复性好，组内与组间的变异系数均小于2％。实验证明该方法具有良好的扩增效率，扩增效率野毒株为E＝2.12，疫苗株为E＝1.99，在对临床样品的检测中表现出良好的特异性、灵敏性和稳定性，可用于CDV野毒与弱毒疫苗的鉴别诊断以及CDV宿主致病性的核酸定量研究。
附图说明
图1是CDV野毒株和疫苗株H基因序列比对及本发明探针和通用引物(P1和P2)设计；
图2是本发明实施例野毒株的荧光定量PCR扩增标准曲线；
图3是本发明实施例疫苗株的荧光定量PCR扩增标准曲线；
图4是本发明实施例对野毒株的检测结果；1-3：强毒株的标准品RNA；4-8：新城疫疫苗(NDV)、水貂肠炎病毒(MEV)、阿留申病毒(ADV)、犬腺病毒(CAV)、犬细小病毒(CPV)；
图5是本发明实施例对疫苗株检测结果；a-c：疫苗株的标准品RNA；d-h：新城疫疫苗(NDV)、水貂肠炎病毒(MEV)、阿留申病毒(ADV)、犬腺病毒(CAV)、犬细小病毒(CPV)；
图6是本发明实施例CDV野毒株和疫苗弱毒探针特异性分析结果；I区：野毒样品；II区：野毒和疫苗毒混合样品；III区：疫苗毒样品；IV区：阴性样品；
图7是本发明CDV野毒株常规PCR(左)和荧光定量PCR(右)敏感性试验；M：DL2000DNA Marker；1-7：2.25×101copies/μL～2.25×107copies/μL；8：阴性对照；
图8是本发明疫苗株常规PCR(左)和荧光定量PCR(右)敏感性试验；1-7：2.98copies/μL-2.98×106copies/μL；8：阴性对照；
图9是本发明CDV感染动物(狐狸、貉和水貂)后不同时间外周血病毒RNA含量；
图10是本发明CDV感染动物(狐狸、貉和水貂)后不同组织中病毒RNA载量。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株方法的建立
1.1实验材料
1.1.1细胞、犬瘟热毒株
不同基因型CDV野毒株LN(10)1(Asia-1基因型)，SD(14)7(Asia-1基因型)，NJ(11)2(Asia-4基因型)，CDV弱毒疫苗CDV3株，和5804Pe/H(Europe基因型)、Onderstepoort株和SnyderHill株(均为America-1基因型)、阿留申病毒(ADV)、水貂肠炎病毒(MEV)、新城疫疫苗(NDV)、犬腺病毒(CAV)以及犬细小病毒(CPV)；由本实验保存的转化感受态菌株DH5ɑ。
1.1.2主要试剂
病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Kit，RNeasy Mini Kit和QIAamp BloodRNA Mini Kit均购自德国Qiagen公司。RNA反转录试剂盒Prime Script II 1st StrandcDNA Kit和荧光定量PCR试剂盒HS Ex Taq Premix reaction mix均购自大连宝生物工程有限公司。
1.2引物探针设计
CDV H基因的变异性较其他基因频繁，被认为是致使CDV不断变异的重要因素。本发明首先通过比对大量CDV H基因序列，根据野毒株与弱毒疫苗株H基因上单一碱基的区别设计一对只有一个碱基差异(T/C)且带有不同荧光基团的MBG探针(图1)。
表1 CDV复合荧光定量RT-PCR所用引物及探针序列
Figure GDA0003643541110000071
1.3CDV野毒株和疫苗株质粒标准品的制备
分别将CDV野毒株LN(10)1和疫苗株CDV3进行CDV-H基因克隆。两种毒株均由本实验室保存。
(1)提取CDV野毒株或弱毒疫苗株基因组RNA。
(2)通过RT-PCR的方法，用随机引物对提取到的RNA进行反转录处理后，通过使用根据CDV H基因编码区两端保守区所设计的一对通用扩增引物CDV-Hf:5’-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3’,CDV-Hr:5’-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3’(K＝G/T,R＝A/G)分别扩增野毒株和弱毒疫苗株CDV的H基因。
(3)纯化回收CDV野毒株和疫苗株H基因扩增片段，与pGEM-T载体连接，连接产物转化感受态细胞后筛选阳性克隆，提取质粒，测序和酶切鉴定正确后，即为重组质粒标准品。用Elution Buffer将含有犬瘟热病毒野毒株或弱毒疫苗株H基因的重组质粒标准品(pGEM-T-LN-H和pGEM-T-CDV3-H)依次稀释成1.0×107copies/μL～1.0×100copies/μL，共8个浓度梯度，以稀释后的重组质粒标准品为模板。
1.4复合荧光定量RT-PCR反应条件的确定
分别取CDV野毒株和疫苗株质粒标准品pGEM-T-LN-H或pGEM-T-CDV3-H 1μL为模板。加入含有弱毒疫苗探针(probeA)和野毒株探针(probeB)各0.5μL的PCR反应体系中，分别在59℃、61℃和63℃的退火温度下运行3次PCR。循环参数为：95℃5min；95℃10s、59℃/61℃/63℃45s；40个循环，退火延伸时检测荧光信号。最适退火温度为FAM荧光通道和HEX荧光通道中非特异荧光信号的变化最低时的温度。
使用罗氏
Figure GDA0003643541110000081
480Probes Master reagents按照如下反应体系使用Roche
Figure GDA0003643541110000082
96进行复合荧光定量PCR反应：
表2复合荧光定量RT-PCR反应体系
Figure GDA0003643541110000083
Figure GDA0003643541110000091
反应条件：95℃预变性5min后，95℃10s，61℃30s循环38次，61℃采集荧光信号。绘制野毒株或弱毒H基因复合荧光定量PCR的标准曲线。
1.5结果
判定标准：
阴性：没有CT值和典型扩增曲线的样品，视为无犬瘟热病毒。
弱毒疫苗株阳性：FAM通道CT值≤35，且出现典型扩增曲线，HEX通道无扩增，视为存在犬瘟热弱毒疫苗株病毒。
野毒株阳性：HEX通道CT值≤35，且出现典型扩增曲线，FAM通道无扩增，视为存在犬瘟热野毒株病毒。
混合阳性：FAM和HEX两个通道都复合CT值≤35，且都出现典型扩增曲线，视为野毒株与弱毒疫苗株犬瘟热病毒混合阳性。
可疑：CT值＞35，且出现典型的扩增曲线的样品建议重做。重做结果出现CT值≤35和典型扩增曲线者视为阳性，否则为阴性。
检测CDV荧光定量RT-PCR野毒株标准品和疫苗株标准品的浓度从101～1×107近似一条直线，具有良好的线性关系，标准曲线方程为：野毒株：y＝-3.059x+40.03，疫苗株：y＝-3.355x+36.79(野毒株：相关系数R2＝0.998，扩增效率E＝2.12；疫苗株：相关系数R2＝0.997，扩增效率E＝1.99)，见图2和图3。
实施例2特异性试验
以CDV的野毒株和疫苗株、犬细小病毒(CPV)、水貂肠炎病毒MEV毒株，阿留申病毒(ADV)，犬腺病毒(CAV)以及新城疫疫苗(NDV)的cDNA或DNA为模板，在实施例1的反应条件下应用复合荧光定量RT-PCR方法来鉴定其特异性。
如图4～5所示，复合荧光定量RT-PCR对其它病原核酸检测结果：建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR分别能检出CDV的野毒株和疫苗株，而新城疫疫苗(NDV)、水貂肠炎病毒MEV毒株，阿留申病毒(ADV)，犬腺病毒(CAV)，犬细小病毒(CPV)均无阈值信号产生。结果表明该方法在病毒样品的检测中有很好的特异性。
如图6所示，CDV强弱毒模板检测特异性：用复合荧光定量RT-PCR对设置的CDV强毒模板、弱毒模板、强弱毒混合模板及阴性对照模板进行检测。检测结果经
Figure GDA0003643541110000101
96等位基因型分析结果表明，不同模板得到了很好的区分，强毒模板、弱毒模板、强弱毒混合模板及阴性对照模板分别区分于I区、III区、II区和IV区。证实该方法对CDV强弱毒模板特异性较好。
实施例3敏感性试验
将CDV强毒或弱毒质粒标准品进行10倍梯度稀释(10-1～10-8)后，以此为模板进行复合荧光定量RT-PCR检测。
结果如图7～8所示，本发明检测野毒株和弱毒疫苗株的灵敏度分别可达到2.25×101copies/μL和2.98copies/μL，敏感性超过RT-PCR的敏感度。
实施例4重复性试验
各取3份等量的不同浓度的野毒株或疫苗株，提取三次RNA，反转录后，在相同反应条件下，进行3次独立的复合荧光定量RT-PCR检测；
各取3份不同浓度的野毒株或疫苗株，每份样品做3个重复提取RNA，反转录后，进行一次复合荧光定量RT-PCR检测。
结果如表3，可以看出各组的变异系数都在2％以内，说明该方法的重复性良好。
表3野毒株和疫苗株批内及批间重复性试验
Figure GDA0003643541110000111
实施例5符合性试验
采集山东、辽宁、河北和吉林等省的75份犬瘟热阳性及疑似病料对其提取RNA进行反转录后，各取cDNA2μL作为样品，使用已经建立的复合荧光定量RT-PCR方法，进行CDV野毒株和疫苗株检测，同时应用RT-PCR-RFLP鉴别检测CDV野毒株和疫苗株方法进行符合性比较。
如表4所示，荧光定量RT-PCR方法能检测出54份样品野毒阳性，2份疫苗弱毒阳性；RT-PCR-RFLP方法共检测出48份样品野毒株阳性，2份疫苗弱毒阳性。说明该方法敏感性高于后者，对CDV野毒株阳性的检测结果与RT-PCR-RFLP方法的符合率为88.9％。
表4复合荧光定量RT-PCR方法对临床样品符合性检测
Figure GDA0003643541110000112
Figure GDA0003643541110000121
实施例6复合荧光定量RT-PCR人工动物感染实验
应用CDV野毒SD(14)7株人工感染狐狸、貉和水貂(每种动物5只)后，感染后3、7、10、14dpi(days post infection)进行EDTA抗凝外周血采集。实验结束后所有脏器采集，包括肺脏、脾脏、淋巴结、肝脏、肠道、膀胱和大脑，这8种组织脏器每份取250mg经组织研磨仪研磨后用RNeasy Mini Kit提取病毒RNA，取140μL用QIAamp Viral RNA Kit提取病毒RNA。每份EDTA抗凝外周血取200μL用QIAamp Blood RNA Mini Kit提取病毒RNA，进行复合荧光定量RT-PCR检测。
如图9感染动物血液CDV RNA检测结果表明，在感染3dpi后，水貂病毒血症可达到106.5copies/μL，狐狸和貉可达到106.0copies/μL。而水貂、狐狸和貉病毒血症感染后7dpi均可达到108.5copies/μL。
如图10对来自不同感染动物的不同组织病毒RNA载量比较表明，脾脏、淋巴结和肺脏和肠道病毒RNA载量明显高于肾脏和膀胱。其中貉、狐狸和水貂的脾脏、淋巴结、肺脏和肠道病毒RNA载量均可达到108.0copies/μL以上。此外，感染动物脑组织中也可检测到较高水平的病毒RNA。
实施例7复合荧光定量RT-PCR对犬瘟热活疫苗半成品检测
用复合荧光定量RT-PCR对不同病毒含量的水貂犬瘟热活疫苗(CDV3株)半成品、成品(共计10份)进行病毒RNA含量检测。进行RNA含量和病毒含量比对分析。
结果如表5，表明犬瘟热疫苗半成品合格(病毒含量不低于104.50TCID50)，RNA含量应≥105.5copies/μL；疫苗成品合格(病毒含量不低于103.50TCID50)，RNA含量应≥104.0copies/μL。
表5复合荧光定量RT-PCR对犬瘟热活疫苗样品检测结果
Figure GDA0003643541110000131
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaacggtgg ctgaatgaca t 21
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccactgctat agtacatacc ttggctt 27
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catatagttg gttgtttgga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catatagttg gttgtctgga 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttagggctca ggtagtcca 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctaagkccaa ttgaratgtg t 21

Claims (9)

1.一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的疫苗株探针及核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的野毒株探针。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物探针组，其特征在于，所述野毒株和疫苗株的探针5’端添加荧光基团，3’端添加淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物探针组，疫苗株探针的荧光基团为FAM，野毒株探针的荧光基团为HEX，野毒株和疫苗株探针的淬灭基团为MGB。
4.一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物。
5.根据权利要求4所述的一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的探针。
6.一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测病毒株的总RNA；
2)以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；
3)加入含有序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物及序列如SEQ ID NO.3～4所示的探针的PCR反应体系中反应；
4)根据扩增结果判定：
没有CT值和典型扩增曲线的样品，视为无犬瘟热病毒；
弱毒疫苗株阳性：FAM通道CT值≤35，且出现典型扩增曲线，HEX通道无扩增，视为存在犬瘟热弱毒疫苗株病毒；
野毒株阳性：HEX通道CT值≤35，且出现典型扩增曲线，FAM通道无扩增，视为存在犬瘟热野毒株病毒；
混合阳性：FAM和HEX两个通道都复合CT值≤35，且都出现典型扩增曲线，视为野毒株与弱毒疫苗株犬瘟热病毒混合阳性；
可疑：CT值＞35，且出现典型的扩增曲线的样品建议重做，重做结果出现CT值≤35和典型扩增曲线者视为阳性，否则为阴性。
7.根据权利要求6所述的一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，步骤3)中PCR反应体系为：
Figure FDA0003643541100000021
480 Probes Master 2×conc 10μL，如SEQ IDNO.1所示引物0.4μL，如SEQ ID NO.2所示引物0.4μL，如SEQ ID NO.3～4所示探针各0.1μL，H2O PCR-grade 7μL，cDNA 2μL。
8.根据权利要求6所述的一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，步骤3)中反应条件为：95℃预变性5min后，95℃10s，61℃30s循环38次，61℃采集荧光信号。
9.序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物或序列如SEQ ID NO.3～4所示的探针或权利要求4所述试剂盒在制备用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的试剂中的应用。
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